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Bioengineering

微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析

doi: 10.3791/60493 Published: November 18, 2019

Summary

高速キャピラリーフロー画像シーケンスから微小血管流れを定量化するために、STAFF(フィールドワイズフローの空間時間解析)ソフトウェアを開発しました。フルイメージフィールド全体および時間の経過とともに、STAFFはフロー速度を評価し、定量分析のための視覚化と表形式出力のための色分けされた空間マップのシーケンスを生成します。

Abstract

血流速度と分布の変化は、様々な細胞のニーズに応じて組織や臓器の灌流を維持するために不可欠です。また、微小循環における欠陥の出現は、複数の病理の発症における主要な指標であり得る。光学イメージングの進歩により、バイタル顕微鏡(IVM)は実用的なアプローチとなり、生きている動物の細胞および細胞下レベルでのイメージングを時間の経過とともに高速化しました。しかし、十分な組織灌流を維持することの重要性にもかかわらず、毛細管流における空間的および時間的変動はめったに文書化されていない。標準的なアプローチでは、限られた時間をかけてイメージングするために少数の毛細管セグメントが選択される。フィジーオープンソース画像解析ソフトウェアのマクロであるフィールドワイズフローの空間時間解析(STAFF)を開発し、公平な方法で毛細管の流れを総合的に定量化しました。毛細血管内の血流の完全なフィールドの高速画像シーケンスを使用して、STAFFは、すべての血管セグメントのための時間間隔ごとにキモグラフと呼ばれる時間の経過とともに動きを表す画像を生成します。KYmographs STAFFからは、赤血球が時間の経過とともに移動する距離から速度を計算し、定量分析のための視覚化と表形式出力のための色分けされた空間マップのシーケンスとして速度データを出力します。通常のマウス肝臓では、STAFF分析は、小葉の中のペリセントラル領域とペリポータル領域間の流速の深い差を定量化した。さらに予想外ののののは、並んで並んでいるシヌコイドと、個々の血管セグメント内で数秒にわたって見られる変動の間に見られる流速の違いです。STAFFは毛細管の流れの複雑な時空間ダイナミクスの測定を可能にすることによって新しい洞察を提供することができる強力な新しい用具である。

Introduction

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微小血管系は生理学において重要な役割を果たし、変化する条件下で組織の効果的な灌流を保証する。微小血管機能障害は、長期的な心血管罹患率および死亡率、認知症の発症、および肝臓と腎臓の両方の疾患を含む無数の状態に関連しており、したがって、広範な生物医学的調査における関心の重要な要因である1、2、3、4、5。組織灌流を評価するために複数の技術が用いられてきたが、生内顕微鏡によってのみ、個々の毛細血管のレベルで血流を特徴付けるために必要な時間的および空間的な分解能でデータ収集を可能にする。

微小血管流れは、蛍光微小球の動きまたは膜不浸透蛍光マーカーの背景に対する赤血球の動き(例えば、蛍光標識デキストランまたはアルブミン)6、7のいずれかによって蛍光顕微鏡で可視化することができる。微小血管の流れは、広視野顕微鏡を用いて表面的な細胞層で、または共焦点または多光子顕微鏡を用いて深さで画像化することができる。しかし、毛細管流量は、赤血球の通過が一般的に60フレーム/s未満の速度で捕捉することができないようなものである。ほとんどのレーザー走査共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡は、フル画像フィールドをスキャンするために1〜5sを必要とするので、この速度は、一般的に視野を制限することによってのみ達成することができ、時には単一のスキャンライン8に。選択された毛細血管セグメント(1)に測定を制限するプロセスは、選択バイアスを導入する可能性があり、(2)毛細管血流の速度における空間的および時間的不均一性を捕捉することが不可能である。対照的に、キャピラリーネットワークの画像は、科学的相補金属酸化物半導体(sCMOS)カメラ9、10を搭載したワイドフィールドデジタル顕微鏡を使用して、100fpsを超える速度で収集することができる。これらの安価なシステムは、典型的な生物医学実験室で一般的であり、本質的に連続的に、2次元ネットワーク全体にわたる微小血管の流れを画像化することを可能にする。この問題は、高速ビデオ顕微鏡によって生成された膨大で複雑な画像データセットから有意義な定量データを抽出できる解析アプローチを見つける方法の1つになります。

全場流量データの解析を可能にするために、高速11で収集した画像系列の顕微鏡分野全体を通して微小血管流量を連続的に測定できる新規画像解析ソフトウェアSTAFFを開発しました。このアプローチは、様々な実験システムやイメージングモダリティと互換性があり、STAFF画像解析ソフトウェアはImageJ12のFIJI実装のためのマクロツールセットとして実装されています。微小血管の流れを可視化するためにここで使用される根本的な原理は、まず、毛細血管内の赤血球を画像化できるようにいくつかのコントラストを提供しなければならないということです。我々の研究では、コントラストは赤血球によって除外されるバルク蛍光プローブによって提供される。流れの速度は、生きている動物8から高速に収集された画像において蛍光標識プラズマ内に負の染色として現れる赤血球の変位から定量することができる。次に STAFF を使用して、キモグラフと呼ばれる複数の時間間隔で各キャピラリー セグメントに沿った距離のプロットを作成し、キモグラフ13に存在する勾配を検出し、それらの勾配から微小血管流量を計算します。このアプローチは、イメージングのためにアクセスできる任意の毛細血管ベッドから収集された画像に適用することができます。ここでは、肝臓の血流の研究にIVMとSTAFFの適用について説明します.

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Protocol

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すべての動物実験は、インディアナ大学の制度動物ケアと使用委員会のガイドラインに従って承認され、実施され、動物のケアと使用のためのNRCガイドに従いました。

1. インバイタル顕微鏡検査のための外科的準備

注:これは生存手術ではありません。「バイタル顕微鏡検査のための外科的準備」が始まると、セクション2「バイタル内顕微鏡」が完了するまで作業を一時停止することはできません。

  1. 9~10週齢の雄C57BL/6マウスを、研究前に少なくとも4日間、16時間速く順応させる。
  2. 動物の重量を量り、5%のイソフルランで沈静化し、体温を維持するために加熱パッドの上に置きます。1~2L/分の酸素流量を使用し、1~2%のアイソフルランで沈下を維持します。つま先のピンチで反射神経をチェックします。直腸温度計を使用して温度を監視します。心拍数と呼吸を視覚的に監視します。
  3. 麻酔が安定している場合は、頸部のカヌレーション配置のための領域と肝臓の露出のための肋骨ケージの下の領域を剃ります。
  4. 頸部の缶切りの場合は、マウスの顎の下に1~2cmの左腹部切開を行います。頸静脈を取り巻くすべての脂肪と筋膜をクリアします。出血を防ぐために、06縫合糸を使用して頸部の前端を結びます。
    1. 頸静脈に小さなニックを作り、カニューレ(30 G x 1/2インチ、針)、針ホルダーとポリエチレンチューブ(0.011 x 0.024インチ2は、ルアースタブアダプタに取り付けられ、0.9%の生理食通で満たされています)を約1cmでスライドさせ、0-6サチュリングストリングを使用して頸部の後端で固定します。
  5. 頸管カニューレを使用して70 kDaフルオレセインデキストラン(生理線中の9mg/mL溶液の0.1 mLの注射を介して30 mg/kgの用量に)を提供する。
  6. リブケージの真ん中から1~2cm下の胴体を横切って4~6cmの切開を行い、イメージングのために肝臓を露出させます。
  7. 湿った(0.9%生理積糸に浸漬)2 x 2インチ2ガーゼスポンジを左横肝葉の下に置きます。40mmカバースリップ底皿のガラス窓の周囲にテープを貼り、シアノアクリレート接着剤をテープに塗布します。ガラス板を肝臓に押し付け、綿の先端アプリケーターを使用して、顕微鏡検査のための組織の動きを最小限に抑えるために、テープ上の接着剤にガーゼを押します。
  8. 動物を顕微鏡の段階に移動します。カバースリップボトム皿に無菌の0.9%の生理食塩分を加え、イメージングセッションを通して肝臓を湿らせておきます。ステージに取り付けられた加熱パッド、動物の上に置かれた加熱パッド、および目的のヒーターを介して36〜37°Cで温度を維持します。

2. インタビタル顕微鏡

  1. 高速画像撮影が可能なビデオカメラを搭載した反転エピ蛍光顕微鏡でバイタル顕微鏡を行います。
    注:ここでは、キセノンアークランプ、フルオレセイン特異的励起(480~500nm)および発光(507~543nm)フィルタ、プランフルオア20x、N.A.0.75水浸漬目的、高速sCMOSカメラを使用しました。
  2. 最小限の照明を使用して、毛細管血流解析の対象領域を選択します。
  3. カメラが100 fpsを取得できるように、露光時間を短く設定します。赤血球の影と血管系のトポロジーを明確に視覚化すると同時に、蛍光プローブの光毒性や光漂白を避けるように設定します。
  4. 100 fps の速度で画像を収集します。カメラのピクセル解像度を~0.65~1.3μm/ピクセルに設定します。フレーム サイズを 512 x 512 ~ 1024 x 1024 ピクセルに設定します。ビット深度を 8 ビットから 16 ビットの間で設定します。システム上で 100 fps のイメージ収集を可能にする、最高解像度、フレーム サイズ、およびビット深度を使用します。
  5. FIJIのBio-Formats14がネイティブ形式のファイルを開くことができる場合は、時系列ファイルを一連のTIFファイルまたはネイティブカメラ/顕微鏡形式として保存します。
  6. 時間の経過とむ複数の領域をイメージします。顕微鏡ステージでマウスを最大2時間安楽死させ、イメージング終了時にマウスを安楽死させる。
    注:時系列の持続時間は、組織の生存率に影響を与えずに、変動性を包含する時間間隔の画像化の必要性のバランスに基づきます。時系列の期間は、ファイル サイズの考慮事項によって決まることもあります。100 fps で収集された 1024 x 1024 ピクセル 16 ビット イメージの 1 分のタイム シリーズでは、サイズが 12 GB のファイルが生成されます。ファイル サイズに関する考慮事項によって、フレーム サイズと使用ビット深度が決まる場合もあります。STAFF 内に明示的なサイズ制限はありません。

3. FIJIでTrakEM2を使用して血管ネットワークを定義する

注:プロトコルは、セクション 3 の任意の時点で作業を保存した後に一時停止できます。

  1. https://imagej.net/Fiji/DownloadsからFIJIをダウンロードしてインストールします。
    注:フィジーのバージョン 1.51n は、このプロジェクトに使用され、https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zipからダウンロードできます。Windows では、FIJI はプログラム ファイルではなくユーザー領域にインストールする必要があります。
  2. ファイル/ファイルを開くか、ファイル/読み込み/イメージシーケンスを使用して、FIJI でムービーファイルを開きます。血管ネットワークのトポロジが見やすい呼吸間の安定した画像から単一の画像を選択します。[イメージ]-[複製]を選択し、選択した単一のイメージ (スタックではなく) を複製して複製し、イメージを新しいフォルダに保存します。ファイル名またはフォルダ名にスペースを含めないでください。
  3. [ファイル] → [新規作成][TrakEM2 (空白)]を選択して、新しい空の TrakEM2 プロジェクトを設定します。ムービーから単一のイメージを含む新しいフォルダをプロジェクトフォルダとして選択します。TrakEM2 ウィンドウが開きます。
  4. メイン作業領域を右クリックし、[インポート/イメージインポート ]を選択します。手順 3.3 で保存した単一のイメージに移動して選択します。
  5. メイン作業領域をもう一度右クリックし、[表示]-[キャンバス/レイヤーセット自動サイズ変更]を選択します。メイン作業ウィンドウを左クリックします。画像が作業領域を塗りつぶします。
  6. 血管ネットワークを含む画像内の領域を選択するには、TrakEM2 でのセットアップ領域リストの選択。小さなTrakEM2ウィンドウ(テンプレート、プロジェクトオブジェクト、レイヤー)で、"•何でも右クリックします。[新しい子の追加>エリア リスト] を選択します。
  7. 小さい TrakEM2 ウィンドウで、 "テンプレート>何でも" プロジェクトオブジェクト&プロジェクト" にドラッグします。次に、 "テンプレート>何でも> • エリアリスト" "プロジェクト オブジェクト& プロジェクト& gt; 何でも" にドラッグします。[プロジェクト オブジェクト & プロジェクト ] > [何でも]の下に [ • エリア リストが表示されます。
  8. [Zスペース] タブの下のメインの TrakEM2 ウィンドウに、エリア リストというラベルの付いたバーが作成されました。クリックして選択します。TrakEM2 のメイン ウィンドウでは、ペイントブラシ ツールを選択します。Shift キーを押しながらマウス ホイールを回転して、手間ブラシの直径よりも小さいペイントブラシの適切なサイズを選択します。TrakEM2 セットアップを保存するには、Ctrl + Sキーを押します。
  9. ペイントブラシツールを使用して血管ネットワークをペイントします。ペイントブラシツールを使用しているときにAltキーを押したまま消去します。フォーカスされていない領域は含めないでください。コントロール + Sを使用して頻繁に保存します。
  10. 血管ネットワークのラベル付けが完了したら、TrakEM2 のメイン ウィンドウを右クリックし、[エクスポート]-[エリアリストラベルとして表示(tif)] を選択します。 ポップアップ ウィンドウで、[スケール 100% ] と [すべてエクスポート] エリア リストを選択します。TrakEM2 ウィンドウを閉じ、[プロジェクトの保存]で [はい]を選択します。
  11. エリアリストのイメージが開き、空白の黒いイメージとして表示される場合があります。FIJI メニューのメインで、[イメージ] → [調整] → [明るさ/コントラスト]を選択します。B&C ウィンドウで自動ボタンを押すと、エリアリストが表示されます。FIJI のメイン メニューで、[イメージ]-[ルックアップテーブル]-[LUT の反転]を選択します。黒いラベルのこの画像を白い背景に保存し、画像を閉じます。
  12. FIJI でラベル ファイルを開きます。[プラグイン]-[スケルトン]-[スケルトン化]を選択します。スケルトン化されたイメージを tif として保存します。STAFF フロー解析の実行に必要な入力ファイルの 1 つとして、skeleton.tif ファイルを使用します。ファイルを保存するときは、ファイル名にスペースを使用しないでください。
  13. 必要に応じて、スケルトン ファイルを手動で編集するには、線画にギャップ(ペイント ツールを使用)を配置します( たとえば、線の中の分岐がイメージ プレーンの外に出てキャプチャされていない場所など)。

4. STAFF 分析用のムービー シーケンスの準備

  1. ファイル/開く/ファイル/ファイル/インポート/イメージシーケンスを使用して、FIJI でムービーファイルを開きます。 流量解析用の画像シーケンスの期間 (数秒から数分、数百~数万フレーム) を選択します。
  2. 開始フレームと終了フレームの番号を入力して、画像/選択した部分を複製し、複製します。[イメージ] > [プロパティ]イメージの空間キャリブレーションと時間キャリブレーションを確認し、必要に応じて修正します。イメージ ファイルを TIF (または圧縮されていない AVI) として保存します。この movie.tif は、STAFF 分析を実行するための入力ファイルとして必要です。ファイル名にスペースを含めないでください。

5. FIJIへの STAFFマクロのインストール

注 : (重要)FIJI フォルダ サブディレクトリ内の複数のフォルダは、類似したファイル名を持ち、大文字のファイル名もあれば、大文字でないフォルダもある。STAFF をインストールする場合は、正しいフォルダが選択されていることを確認してください。

  1. https://github.com/icbm-iupui/STAFFから STAFF マクロをダウンロードします。
  2. インストールするには、まず FIJI フォルダを開きます。
    1. Windows では、FIJI がユーザー空間にインストールされているフォルダーを見つけます。MacOS で[アプリケーション]フォルダにある FIJI アイコンを見つけて右クリックし、[開く]を選択します。
  3. FIJI フォルダで、プラグインフォルダを開きます。プラグインフォルダ内でマクロフォルダを開きます。STAFF.ijm をこのマクロフォルダにコピーします: フィジー\プラグイン\マクロ\STAFF.ijm.
  4. FIJI フォルダで、プラグインフォルダを開きます。STAFF_Dir.jar をこのプラグインフォルダにコピーします: フィジー\プラグイン\STAFF_Dir.jar.
  5. FIJI フォルダで、マクロ フォルダを開きます。このマクロ フォルダ内で、自動実行フォルダを開きます。STAFF_Loader.ijm をこの自動実行フォルダにコピーします STAFF_Loader。
  6. FIJI を起動し、マクロのインストールを確認します。インストールを確認するには、[プラグイン」> [マクロ] を選択します。ドロップダウン メニューを正しくインストールすると、[プロジェクトを開く]、[スケルトンを分析]、[時間間隔の編集]、[フローの分析]、[空間マップの生成] が含まれます。
  7. これらのコマンドがマクロメニューに表示されない場合は、「プラグイン」>「マクロ」>「インストール」を選択し、フィジー\プラグイン\マクロフォルダを開き、STAFF.ijmファイルを選択して、「OK」ボタンをクリックします。コマンドが[プラグイン]>[マクロ]メニューに表示されます。

6. STAFFを用いた血管流量の定量化

  1. 新しいプロジェクトを作成します。
    1. プラグイン>マクロ/プロジェクトを開く/プロジェクトを作成し、プロンプトに従って構成ファイルを作成または更新します。
    2. プロジェクトを開く」メニューから、プロジェクトディレクトリ、入力ファイルフォルダ、入力ファイル Movie.tif および Skeleton.tif に移動して選択します。必要に応じて、自動入力された出力ファイル名を編集します。
    3. 最短セグメント長(20μm)、最大速度測定(2,000μm/s)、最大速度マッピング(1,000μm/s)の入力値。
      注:最短セグメント長と 1 秒あたりのフレーム数の積は、理論的に測定できる最大流量速度を提供します。文献で報告されている最も高い毛細管流量速度は約2,000μm/s15です。肝臓では、毛細管の流速は一般的に平均で約300μm/sであり、1,000μm/sを超えることはめったにないことが観察されました。
    4. イメージ シーケンスのピクセル サイズとフレーム レートの値を入力します (イメージ メタデータまたは実験用メモから)。これらの値にはユーザー入力が必要です。画像に定期的な背景強度のちらつきがある場合は、[フリッカ補正]チェックボックスをオンにします。
    5. データを最適に視覚化するためのパラメーターを選択します。データがカラー スケールの全範囲にマップされるように、データの約 95% を含めるには、[マップされた最大速度] を選択します。STAFFは、カラースケールの高速端に高速外れ値をマップします。
  2. スケルトンを解析します。
    1. [プラグイン] → [マクロ] → [スケルトン分析]を選択します。skeleton.tif ファイルが開き、対象地域 (ROI) マネージャが開いて実行されます。
      注:[スケルトンを解析]は、各ピクセルを、端点、ジャンクション、またはセグメント内のいずれかで近傍数で分類します。セグメントごとに識別番号(ID番号)、キャリブレーションされた分岐の長さと分岐端の空間座標が記録されます。
    2. セグメント ID がスケルトンに表示され、セグメント・リストが ROI マネージャーに表示され、スケルトンの ROI Manager ファイルが保存されたことを示すポップアップが表示されるまで待ちます。[OK] をクリックします。
    3. 呼吸運動の間に、赤血球が毛細血管を通過する場所(例えば、縁毛管の外側ではなく、エッジではない)の上に骨格が残っていることを確認します。ムービーファイルを開き、開いているムービーに ROI zip ファイルをドラッグして、ラベル付けされたセグメントをムービー上のオーバーレイとして表示します。セグメントをオーバーレイしてムービーを再生します。
  3. 時間間隔を選択します。
    1. [ プラグイン]-[マクロ] → [時間間隔選択]を選択します。マクロがムービーの合計時間にわたって単一のセグメントから kymograph を生成するまで待ちます。このキモグラフから、ユーザは分析の時間間隔を選択します。必要に応じて、コントロール + キーを使用して Kymograph のサイズを増やします。
    2. 四角形選択ツールが自動的にアクティブになります。各時間間隔の周囲に四角形を描画します。時間間隔の長さの開始点として適しているのは、呼吸間の 1 ~ 2 s 間隔で、キモグラフの水平方向のぼやけた領域として明らかです。
    3. ROI マネージャーのTキーまたは追加ボタンをクリックして、時間間隔の選択を記録します。必要な数の時間間隔に対して繰り返します。キモグラフの上(または左)から下(または右)に順番に選択します。
    4. [フローの分析 ( 次の手順) には大きなデータセットに対して数時間かかる可能性があるため、少数の時間間隔 (3 ~ 4) を選択し、それらの間隔のみの分析を完了して、パラメーターの選択肢を評価します ([プロジェクトを開く] から)。
    5. 完了したら、[各時間間隔ウィンドウのROI 作成][OK] をクリックします。選択した間隔が[プロジェクト フォルダ]に保存されると、ポップアップ ウィンドウが表示されます。[OK] をクリックします。
  4. フローを分析します。
    1. プラグイン/マクロ/フロー分析を選択すると、「フローパラメータの分析」ダイアログボックスが開き、「プロジェクトを開く」ステップに入力した値が表示されます。必要に応じて編集し、[OK]をクリックします。
    2. [出力ファイル名]ダイアログ ボックスが開き、[プロジェクトを開く]ステップで入力した名前が表示されます。必要に応じて編集し、[OK]をクリックします。
    3. ユーザーが分析を開始する準備ができているかどうかを尋ねるダイアログ ボックスが開きます。[OK] をクリックすると、解析が開始されます。フロー解析が完了したことを示すダイアログ ボックスが表示されるまで待ちます。
      注:必要な時間は、データセットのプロセッサ速度とサイズによって異なります。
    4. 結果ファイルが .csv 形式のスプレッドシート ファイルとしてプロジェクト フォルダに保存されていることを確認します。
      注:出力ファイルには、segment_velocities.csvには、流れ方向を示す正と負の値を持つ速度値が含まれています。最小長より小さいセグメントを表すセルには、SHORT というテキストが含まれます。最大測定速度より大きい速度値を持つセルには、OUT (外れ値の場合) というテキストが含まれます。kym_ang.csvには、FIJI の方向性プラグインによって測定されたキモグラフ角度が含まれています。good_fit.csvには、各キモグラフから測定された角度の分布に対する曲線の適合度が含まれています。フィット感の悪さ(< 0.8)は、セグメント内の隠れた分岐点、時間間隔中の速度の変化、ランプまたは部屋の光のちらつきを示すことができます。
    5. segment_velocities.csv に OUT 値が少なることを確認します。OUT 値の数が多い場合は、分析する最小セグメント長が 15 ~ 20 μm 以上であることを確認してから、[フローの分析]を再実行します。新しい segment_velocities.csv にまだ OUT 値の割合が大きい場合は、ちらつき補正ボックスを確認してから、[フローの分析]を再実行します。
  5. 空間マップを作成します。
    1. [プラグイン] > [マクロ] > [空間マップ生成]を選択すると、[空間マップ パラメーター]ウィンドウが開き、[プロジェクトのオープン作成] ステップで入力した値が表示されます。必要に応じて [編集] をクリックするか、[OK] をクリックします。
    2. 流速の空間マップの時系列が流速を示す色で生成されるのを見る。出力は、時間間隔ごとに 1 つのイメージを持つ .tif イメージ スタックの形式です。tif スタックをスクロールして、流れの空間的および時間的な変動を視覚化します。ムービーとして共有する AVI ファイル(移植性を最大限に高めるために圧縮されていない)としてスタックを保存します。

7. STAFF出力を用いた定量分析

  1. スプレッドシートまたは統計分析プログラムで segment_velocities.csv ファイルを開きます。これらの値には、そのセグメントの開始/停止点に対する流れの方向を示す正または負の符号があります (セグメント ROI ファイルに記録されます)。
  2. すべての速度値の絶対値を含む新しいスプレッドシート ページを作成します。これらの値を使用して、全体的な平均流速、時間の経過に従うすべての血管セグメントの平均流速、時間の経過に従う各血管セグメントの流速、および速度分布のヒストグラムを作成します。
  3. 特定の形態領域または対象地域の他の領域に関する値を計算するには、まずラベル付きスケルトン内の特定の関連セグメントを検索し、次に選択したセグメントに対して解析を実行します。

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Representative Results

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STAFF分析は、数秒から数分までの期間にわたって、顕微鏡分野全体にわたる微小血管速度の完全な国勢調査を生成します。代表的な結果を図1、図 2図 3、および図 4に示します。図1は、マウスの肝臓におけるマイクロ血管ネットワークの時系列の例、微小血管流れの軸を定義するために使用される骨格化画像の生成、および定量のために同定された個々の血管セグメントのSTAFF生成マップを示す。次に STAFF は、スケルトン化されたイメージを使用してマイクロ血管ネットワークを個々のセグメントに分割し、各セグメントのキモグラフのイメージを生成します。これらの画像は、キモグラフ分析に使用する時間間隔を識別するためのツールと共に、ユーザーに提供されます (図 2)。次に STAFF は、スケルトンとユーザーが指定した時間間隔を使用して、各セグメントのキモグラフを個々のセグメント時間間隔に分割します。次に、STAFF は、各セグメント時間間隔から kymograph 内の主要な角度を識別し、速度測定値を .csv データ ファイル (図 3)として提供し、色分けされた速度マップ イメージのスタックの形式で提供します (図 4)。データ分析パイプラインの探索をサポートするために、STAFFは、すべてのキモグラフ角度測定値と適合度値を含む.csvファイルも提供します。

Figure 1
図1:血管骨格の生成(A)生きているマウスの肝臓から収集された時系列画像から単一フレームのオリジナル画像。スケールバー=100μm.(B)中央静脈(CV)およびポータルトライアド(PT)を示したパネルAに示される画像は、正弦波の主方向を識別する。(C)パネルAからの画像と、シヌソイドのTrakEM2セグメンテーションのオーバーレイ。(D) TrakEM2 セグメンテーションのバイナリ画像。(E)TrakEM2セグメンテーションの骨格化(F) ラベル付きの個々の血管セグメントのSTAFF出力画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:キモグラフ分析(A)図1Fに示す血管セグメントの拡大像(B)2つの呼吸間時間間隔にわたって収集された1つのセグメントからの典型的なキモグラフ。呼吸の期間は矢印で示されています。(C) パネル A のセグメント 240、252、および 254 の Kymographsをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

Figure 3
図3:速度データ解析(A, B)方向(A)または絶対速度(B)で表される 19 時間間隔にわたる 4 つのセグメントの速度測定値の表。(C) 20 s 期間全体にわたるフィールド全体の絶対速度値の分布を示すヒストグラム。(D) 20s期間全体にわたって図2Cに図2Cに図2Cに示されている3つのセグメントの速度のグラフ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 速度マップ(A)図 1に示すフィールドの単一時間間隔の色分けされた速度マップの STAFF 出力イメージ 。(B) 3D ボリュームとして表示されるすべての時間間隔の速度マップの合成。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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このプロトコルには複数の重要な手順があります。まず、LIVERを用いた毛細管流解析に利用できる映画を生成するためには、肝臓の生態中イメージング中の運動の最小化が不可欠です。横隔膜の近接性のために、呼吸誘発運動の短い期間が発生し、各呼吸後に安全な肝臓が初期位置に戻る。ガーゼを用いてカバースリップ底皿に対して外科的に露出した肝臓を固定し、その後、逆顕微鏡を用いて下方からイメージングし、呼吸16、17、18、19の間で器官を固定化する役割を果たす。第2に、測定可能な流量は画像取得速度と流れを測定するセグメントの最小長11の関数であるため、100fpsの画像取得速度を強くお勧めします。第3に、高品質の骨格を作り出し、血管ネットワークの線画表現は、STAFFを用いて毛細管流速度を得る上で次の重要なステップである。スケルトンラインセグメントは、解析中の時間経過中の呼吸間の血管の中点の近くにあり、画像平面から血管分岐を識別する必要があります。血管セグメントに沿ったこれらの隠された枝の位置は、映画を見て、キモグラフを調べたり、そのセグメントの時間の経過に伴う速度値を調べることによって推測できます。ムービーを見ると、これらの血管セグメントは、双方向の流れを持つ、見えない枝の位置から離れたり収束したり、または血管セグメントに沿ってその時点での流速の急激な変化を有すると見なされます。非表示の分岐点の位置は、流れ方向または速度の変化によって生成される角度の変化の位置として、kymographs で識別できます。スプレッドシートでは、分岐位置が非表示の血管セグメントが、方向を誤って変更 (符号) したり、2 つの関連セグメントの値間で変更したりすることがあります。時系列にイメージ プレーンから外れている分岐点が多すぎる場合は、見つからない分岐点の位置にある線画にギャップ(ペイント ツールを使用)を配置して、スケルトンを手動で編集した後に STAFF 解析を繰り返す必要があります。

画像取得の一般的な問題は明らかにしましたが、通常は気付かれませんが、STAFFを使用した流れの速度の測定に強い影響を与えました。画像取得では、エピイルミネーションランプ光源の強度または顕微鏡室内の領域照明から不安定性または「ちらつき」が生じ得る。どちらのソースからも、フリッカの周期に伴う時間の経過に伴う光/暗いバンドは、キモグラフ内のゼロ角度で発生します。ゼロ角度ピークが大峰の場合、流速が測定される血管を通る赤血球体の動きによって生じる角度が人間の目には明らかであっても、方向性プラグインはゼロピークにカーブをフィットさせ、非常にゼロ度付近の値を報告し、現実的に高い速度測定を行います。ゼロ角ピークが大峰でない場合でも、報告された速度が高い値にシフトするように方向曲線フィットに影響を与えます。この問題に対処するために、STAFFは0°で発生するピーク角度を無視する「フリッカ補正」オプションを提供します。この変更により、速度の定量に影響を与えることなくランプちらつきの効果が排除されました。

広視野顕微鏡を用いて流速度を得る主な制限は、画像取得が腸間性血管系のような薄い製剤に制限されているか、ゼブラフィッシュの分セグメント血管または肝臓などの器官の表面層または外装できる腎臓。

フロー定量化の既存の方法よりもSTAFFを使用する大きな利点は、血管の流れの空間的および時間的パターンの迅速かつ公平な検出を可能にすることです。ラスタースキャンシステムを用いた微小血管流量データの収集と解析は、一般に、一度に20、21、22、23の単一ユーザー選択毛細血管の測定に限定される。フィールド24、25、26の流れの速度を抽出する方法は存在しますが、これらのアプローチはいずれもフィールド全体の分析をサポートせず、すべて労力を要します。STAFFを使用すると、数万枚の画像を含むデータセットの画像フィールド全体にわたるすべての毛細管セグメントの解析を 1 日以内に実行できます。フルフィールド血管フローの単一データセットの手動分析でも、数ヶ月から数年かかります。したがって、手動分析は、通常の流れの特性評価に対しても実用的ではなく、明らかに複数の治療群の比較を許可しません。

血管流れの時空間パターンのSTAFF定量の容易さは、将来のユーザーが血管形態学的観察を毛細管流速パターンへの影響にリンクする機会を提供する。血管径の血管形態測定と流速パターニングとの関係を定義することで、血管形態から流れパターンを予測できる可能性があります。同様に、血管の流れのパターニングと血管形態を、タイミング、免疫細胞浸潤の局在化および程度、毒性暴露または疾患による組織損傷、または細胞内輸送の状態などの事象と相関させるだけでなく、私たちは、健康と病気におけるフローパターンと細胞機能をよりよく理解するだけでなく、特に有害な病態生理学的シナリオを特定するためのフレームワークを提供します。

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Disclosures

著者は競合する利害関係を報告しない。

Acknowledgments

ここで提示された研究は、国立衛生研究所(NIH U01 GM111243およびNIH NIDDK P30 DK079312)からの資金提供によって支えられました。インディアナ生物顕微鏡センターでバイタル内顕微鏡研究を行いました。マルゴルザータ・カモッカ博士の顕微鏡検査の技術支援に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice Jackson Labs male 9-12 weeks old
Cannula Instech BTPE-10 Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches
CMOS camera Hamamatsu C11440-42U30 4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish Electron Microscopy Sciences WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran Thermo Fisher, Invitrogen D1822 Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge Fisher 22-415-504 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad Reptitherm RH-4 between mouse and stage
Heating pad Sunbeam 000732-500-000U over mouse
Inverted epifluorescence microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver Braun Aesculap GT420
Isofluorane Abbott GmbH PZN4831850
Luer stub adapter Fisher 14-826-19E Catheter adapter
Micro scissors Castro Viejo
Microscope objective Nikon Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle Fisher 30 G x1/2"
Needle holder Olsen-Hegar
Objective heater BioScience Tools MTC-HLS-025 Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer Braintree Scientific, INC TH-5A Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string Harvard Bioscience 723288 silk black suture, 6-0, spool

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References

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微小血管系におけるフィールドワイズフローの空間時間解析
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Clendenon, S. G., Fu, X., Von Hoene, R. A., Clendenon, J. L., Sluka, J. P., Winfree, S., Mang, H., Martinez, M., Filson, A., Klaunig, J. E., Glazier, J. A., Dunn, K. W. Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature. J. Vis. Exp. (153), e60493, doi:10.3791/60493 (2019).More

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