Summary
For å kvantifisere mikrovaskulær Flow fra høyhastighets kapillær Flow bildesekvenser, utviklet vi STAFF (romlig Temporal Analysis of Fieldwise flow) programvare. Over hele bildet feltet og over tid, ansatte evaluerer Flow hastigheter og genererer en sekvens av fargekodede romlige kart for visualisering og tabell produksjon for kvantitative analyser.
Abstract
Endringer i blodgjennomstrømningen hastighet og distribusjon er avgjørende for å opprettholde vev og organ blod som svar på varierende cellulære behov. Videre kan utseendet på defekter i mikrosirkulasjonen være en primær indikator i utviklingen av flere patologi. Fremskritt inne optisk tenkelig ha fremstilt intravital mikroskopi (IVM) en praktisk adgang, tillater tenkelig for det Cellular og subcellulære plan flate inne bo dyrene for høy-fart over tid. Likevel, til tross for viktigheten av å opprettholde tilstrekkelig vev, er romlig og timelig variasjon i kapillær flyt sjelden dokumentert. I standard tilnærmingen velges et lite antall kapillær segmenter for bildebehandling over en begrenset periode. Til omfattende kvantifisere kapillær flyt på en upartisk måte vi utviklet romlig Temporal analyse av Fieldwise Flow (STAFF), en makro for FIJI åpen kildekode bildeanalyse programvare. Ved hjelp av høyhastighets bildesekvenser av hele felt av blodstrøm innen blodkar, produserer STAFF bilder som representerer bevegelse over tid kalt kymographs for hvert tidsintervall for hvert vaskulær segment. Fra kymographs STAFF beregner hastigheter fra avstanden som røde blodlegemer beveger seg over tid, og utganger hastigheten data som en sekvens av fargekodede romlige kart for visualisering og tabell produksjon for kvantitative analyser. I normale mus lever, STAFF analyser kvantifisert dype forskjeller i strømningshastighet mellom pericentral og periportal regioner innen lobules. Enda mer uventede er forskjellene i strømningshastighet sett mellom sinusoids som er side ved side og svingninger sett innenfor individuelle vaskulær segmenter over sekunder. STAFF er et kraftig nytt verktøy som kan gi romanen innsikt ved å muliggjøre måling av komplekse spatiotemporal dynamikk av kapillær flyt.
Introduction
Microvasculature spiller en avgjørende rolle i fysiologi, noe som sikrer effektiv mengde vev under skiftende forhold. Mikrovaskulær dysfunksjon er assosiert med utallige forhold inkludert langsiktige kardiovaskulære sykelighet og dødelighet, utvikling av demens, og sykdom i både lever og nyre, og dermed er en viktig faktor av interesse i et bredt spekter av biomedisinsk undersøkelser1,2,3,4,5. Mens flere teknikker har blitt brukt til å evaluere vev, bare intravital mikroskopi muliggjør datainnsamling ved Temporal og romlig oppløsning er nødvendig for å karakterisere blodstrømmen på nivået av individuelle blodkar.
Mikrovaskulær Flow kan bli visualisere i fluorescens mikroskopi enten ved bevegelse av fluorescerende mikrosfærer eller ved bevegelse av røde blodlegemer på bakgrunn av membran-impermeant fluorescerende markører (f. eks, fluorescensmerkete-merket dextran eller albumin)6,7. Mikrovaskulær Flow kan bli avbildet i overfladiske celle lag ved hjelp av widefield mikroskopi, eller i dybden ved hjelp av enten konfokalmikroskopi eller multiphoton mikroskopi. Men kapillær strømningsrater er slik at passering av røde blodlegemer ikke kan generelt bli fanget i hastigheter mindre enn 60 rammer/s. Siden de fleste laserskanning konfokalmikroskopi og multiphoton mikroskop krever 1-5 s for å skanne et fullstendig bildefelt, kan denne hastigheten generelt oppnås bare ved å begrense synsfeltet, noen ganger til en enkelt skanning linje8. Prosessen med å begrense målingene til utvalgte kapillær segmenter (1) har potensiale til å innføre utvalgs bias og (2) gjør det umulig å fange romlige og timelige heterogenitet i utbredelsen av kapillær blodstrøm. I kontrast kan bilder av kapillær nettverk samles ved hastigheter som overstiger 100 fps bruker widefield Digital mikroskop utstyrt med vitenskapelige komplementære metalloksid Semiconductor (sCMOS) kameraer9,10. Disse rimelige systemer, vanlig i typiske biomedisinsk laboratorier gjør det mulig å bilde mikrovaskulær flyt over hele todimensjonale nettverk, i hovedsak kontinuerlig. Problemet blir da en av å finne en analyse tilnærming som er i stand til å utvinne meningsfulle kvantitative data fra den massive og komplekse bildedata sett generert av høyhastighets video mikroskopi.
For å muliggjøre analyse av full felts flyt data har vi utviklet STAFF, romanen bildeanalyse programvare som kan kontinuerlig måle mikrovaskulær flyt gjennom hele mikroskop felt av bildeserier samlet i høy hastighet11. Tilnærmingen er kompatibel med en rekke ulike eksperimentelle systemer og Imaging modaliteter og STAFF bildeanalyse programvare er implementert som en Makroverktøy sett for FIJI gjennomføringen av ImageJ12. Det underliggende prinsippet som brukes her for å visualisere mikrovaskulær flyt er at først, må noen kontrast gis for å kunne bildet de røde blodcellene i blodkar. I våre studier, kontrasten er gitt av en bulk fluorescerende sonde som er utelukket av røde blodlegemer. Hastigheten av flyt kan da bli kvantifisert fra forskyvning av de røde blodcellene som vises som en negativ flekk i fluorescensmerkete merket plasma i bilder samlet i høy hastighet fra et levende dyr8. Vi bruker STAFF å gjøre tomter av avstand langs hver kapillær segment over flere tidsintervaller kalt kymographs, og deretter oppdage bakkene stede i kymographs13, og fra disse bakkene beregne utbredelsen av mikrovaskulær flyt. Tilnærmingen kan brukes på bilder som er samlet fra en kapillær seng som kan nås for Imaging. Her beskriver vi anvendelsen av IVM og STAFF til studier av blodstrømmen i leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimenter ble godkjent og gjennomført i henhold til institusjonelle Animal Care og use Committee retningslinjer for Indiana University, og overholdt NRC guide for omsorg og bruk av dyr.
1. kirurgisk forberedelse til Intravital mikroskopi
Merk: Dette er ikke en overlevelse kirurgi. Når del 1 "kirurgisk forberedelse for intravital mikroskopi" er påbegynt, kan arbeidet ikke stanses før ferdigstillelse av § 2 "Intravital mikroskopi".
- Akklimatisere seg 9 – 10 ukers gamle mannlige C57BL/6 mus, i minst 4 dager og raskt for 16 timer før studier.
- Veie dyret, sedate med 5% isoflurane og plasser på en varmepute for å opprettholde kroppstemperatur. Bruk en oksygen strømningshastighet på 1 – 2 L/min og oppretthold sedasjon med 1-2% isoflurane. Sjekk reflekser ved tå knipe. Overvåk temperaturen ved hjelp av et rektal termometer. Overvåk hjertefrekvensen og respirasjon visuelt.
- Når anestesi er stabil, barbere området for hals kanyleringen plassering og området under rib bur for eksponering av leveren.
-
For hals kanyleringen, lag en 1 cm igjen ventrale snitt 1 – 2 cm under muse kjeven. Rydd vekk alt fett og konseptkjedene rundt halsen vene. Tie av den fremre enden av halsen med 06 Sutur streng for å hindre blødning.
- Lag en liten nick i halsen vene og skyv kanyle (30 G x 1/2 i, nål), nål holderen og polyetylen slange (0,011 x 0,024 inches2 festet til en luer stub adapter og fylt med 0,9% saltvann) i ca 1 cm, og sikre på bakre enden av halsen ved hjelp av 0-6 Sutur streng.
- Ved bruk av hals kanyle levere 70 kDa fluorescein dextran (til en dose på 30 mg/kg via injeksjon av 0,1 mL av en 9 mg/mL oppløsning i saltvann).
- Utsett leveren for Imaging ved å lage en 4-6 cm snitt over torso, 1-2 cm under midten av ribbeinet buret.
- Plasser en våt (dynket i 0,9% saltvann) 2 x 2 inches2 gasbind svamp under venstre lateral leveren flik. Plasser tape på periferien av glassvinduet på en 40 mm dekkglass-bunn parabol og påfør Cyanoacrylate lim til tapen. Trykk glassplaten til leveren og bruke bomull tippet applikatorer trykk gasbind inn limet på båndet for å minimere vev bevegelse for mikroskopi.
- Flytte dyr til mikroskopet scenen. Tilsett sterile 0,9% saltvann i dekkglass for å holde leveren fuktig gjennom hele bilde økten. Oppretthold temperaturen ved 36 – 37 ° c via Varmeputer montert på scenen, en varmepute plassert over dyret og en objektiv ovn.
2. Intravital mikroskopi
- Utfør intravital mikroskopi på en invertert epifluorescence mikroskop utstyrt med et videokamera i stand til høyhastighets bildeopptak.
Merk: Her, en Xenon Arc lampe, fluorescein-spesifikke eksitasjon (480 – 500 NM) og utslipp (507 – 543 NM) filtre, plan fluor 20x, N.A. 0,75 vann nedsenking objektiv, og en høyhastighets sCMOS kameraet ble brukt. - Velg det området av interesse for kapillær blodstrøm analyse ved hjelp av minimal belysning.
- Sett eksponeringstid kort nok til at kameraet skal kunne erverve 100 fps. Sett belysningsnivå for å tydelig visualisere røde blodlegemer skygger og topologi av blodkar samtidig unngå Phototoksisitet og photobleaching av fluorescerende sonde.
- Samle bilder med en hastighet på 100 fps. Still inn kameraets piksel oppløsning mellom ~ 0,65 og ~ 1,3 μm/pixel. Angi rammestørrelse mellom 512 x 512 og 1024 x 1024 piksler. Angi bit dybde mellom 8 og 16 biter. Bruk høyeste oppløsning, rammestørrelse og bit dybde som fortsatt tillater 100 fps bilde samlingen på systemet.
- Spar tid serie fil (er) som en sekvens av TIF-filer eller som native kamera/mikroskop format hvis bio-formater14 i FIJI kan åpne native format filer.
- Bilde flere områder over tid. Hold musen på mikroskop scenen for opptil 2 h. euthanize musen på slutten av bildebehandling.
Merk: Varigheten av tidsserien vil være basert på å balansere behovet for å bilde for et intervall av tid som omfavner variasjonen, mens ikke påvirker levedyktigheten til vevet. Varigheten av tidsserien kan også være diktert av filstørrelse betraktninger; en 1 min tid serie av 1024 x 1024 pixel 16-bits bilder samlet på 100 fps vil generere en fil som er 12 GB i størrelse. Filstørrelse betraktninger kan også diktere rammestørrelse og bit dybde brukes. Det er ingen eksplisitte størrelsesgrenser i STAFF.
3. Definer det vaskulære nettverket ved hjelp av TrakEM2 i FIJI
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig etter at arbeidet er lagret i avsnitt 3.
- Last ned og Installer FIJI fra https://imagej.net/Fiji/Downloads.
Merk: Versjon 1.51 n av Fiji ble brukt for dette prosjektet, og kan lastes ned fra https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Legg merke til at på Windows, bør FIJI installeres i bruker rommet og ikke i program files. - Åpne filmfilen i FIJI ved hjelp av fil > Åpne eller bruke fil > Importer > bilde sekvens. Velg et enkelt bilde fra de stabile bildene mellom respirations der topologien til det vaskulære nettverket er lett å se. Velg bilde > duplisere og duplisere det valgte enkelt bildet (ikke stabelen) og lagre bildet i en ny mappe. Ikke ta med mellomrom i fil-eller mappenavn.
- Konfigurer et nytt tomt TrakEM2-prosjekt ved å velge fil > ny > TrakEM2 (tom). Velg den nye mappen som inneholder enkelt bildet fra filmen som prosjektmappen. Det TrakEM2 Vinduer ville åpen.
- Høyreklikk i hovedarbeidsområdet, og velg Importer bildefor > Importer . Naviger til enkelt bildet som er lagret i trinn 3,3, og velg det.
- Høyreklikk i det primære arbeidsområdet igjen, og velg vis > AutoResize lerret/lag Sett. Venstre klikk i vinduet for hoved arbeid. Bildet vil fylle arbeidsområdet.
- For å velge områdene i bildet som inneholder det vaskulære nettverket, velger du oppsetts områdeliste i TrakEM2. I mindre TrakEM2 vinduet (mal, prosjekt objekter, Layers) høyreklikk på "• alt". Velg Legg til ny underordnet > områdeliste.
- I mindre TrakEM2 vinduet, dra "mal > noe" på "Project Objects > Project". Deretter drar "mal > noe > • områdeliste" på "prosjekt objekter > prosjekt > noe". Under "prosjekt Objects > prosjekt > noe", • områdelisten vil nå være til stede.
- I hovedvinduet til TrakEM2 under Z rom-fanenble en bar merket områdeliste opprettet. Klikk for å merke den. I hovedvinduet TrakEM2 vinduet også velge pensel verktøyet. Trykk Shift og rull musehjulet for å velge en passende størrelse for pensel, f. eks, mindre enn diameteren av blodkar. Trykk CTRL + S for å lagre TrakEM2-oppsettet.
- Male vaskulære nettverk ved hjelp av pensel verktøyet. For å slette Hold nede alt mens du bruker pensel verktøyet. Ikke ta med utenfor fokus-områder. Lagre ofte ved hjelp av CTRL + S.
- Når merking av vaskulær nettverk er fullført, Høyreklikk i hovedvinduet TrakEM2 og velg eksporter > AreaLists som etiketter (TIF). I popup-vinduet velger skala 100% og eksportere alle områdelisten. Lukk TrakEM2-Vinduer, og velg Ja for Lagre prosjekt.
- Bildet av AreaLists vil åpnes og kan vises som et tomt svart bilde. I hoved FIJI Menu Velg bilde > justere ≫ lysstyrke/kontrast. I B & C-vinduet trykker du på Auto-knappen og AreaList blir synlig. I hoved FIJI-menyen velger du bilde > oppslags tabeller > Inverter lut. Lagre dette bildet av svarte etiketter på hvit bakgrunn og Lukk bildet.
- Åpne etiketter filen i FIJI. Velg Plugins > skjelett > Skeletonize. Lagre det skeletonized bildet som en TIF. Bruk skjelett. TIF-filen som en av input-filer som trengs for å kjøre STAFF Flow analyse. Når du lagrer filen, må du ikke bruke mellomrom i filnavnet.
- Rediger skjelett filen manuelt etter behov ved å plassere et mellomrom (ved hjelp av male verktøyet) i linje tegningen for eksempel på steder der grener i blodkar ikke er fanget opp fordi de går ut av bilde planet.
4. klargjør film sekvensen for personale-analyse
- Åpne filmfilen i FIJI ved hjelp av fil > åpne eller fil > Importer > bildesekvens. Velg en tidsperiode for bildesekvensen for strømnings analyse (kan være sekunder til minutter, hundrevis til titusenvis av bilder) der vevs posisjonen har holdt seg stabil over tid, med unntak av under åndedrett.
- Velg bilde > duplisere og duplisere den valgte delen av sekvensen ved å skrive inn tallene i Start-og slutt RAM men. Kontroller bildets romlige og timelige kalibrering under bilde > Egenskaper og korriger om nødvendig. Lagre bildefilen som en TIF (eller som en ukomprimert AVI). Denne Movie. tif er nødvendig som en inndatafil til å kjøre STAFF analyse. Ikke ta med mellomrom i filnavnet.
5. installere STAFF makroer i FIJI
Merk: (viktig) flere mapper i FIJI-mappen underkataloger har lignende filnavn, noen aktiverte, noen ikke. Vær sikker på at de riktige mappene er valgt når du installerer STAFF.
- Last ned STAFF-makroene fra https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
-
Hvis du vil installere, må du først åpne mappen FIJI.
- På Windows finner mappen der FIJI er installert i bruker rommet, oftest på skrivebordet. På MacOS finner du FIJI-ikonet i Programmer-mappen, høyreklikk og velg Åpne.
- I FIJI-mappen, åpne plugins-mappen. Inne i plugins-mappen, åpne makroer-mappen. Avskrift stab. ijm i denne makroene brosjyre: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
- I FIJI-mappen, åpne plugins-mappen. Kopier STAFF_Dir. jar i denne plugins-mappen: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. jar.
- I FIJI-mappen åpner du makro mappen. I denne makro mappen åpner du Autokjør-mappen. Kopier STAFF_Loader. ijm til denne Autokjør-mappen: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader. ijm.
- Start FIJI og kontroller makro installasjonen. Velg Plugins > makroerfor å bekrefte installasjonen. Når riktig installert dropdown menyen vil inneholde: Open-lag prosjekt, analyser skjelett, Rediger tidsintervaller, analyser Flow og produsere romlig Map.
- Hvis disse kommandoene ikke finnes i makroer-menyen, velger du Plugins > makroer > installere, åpne Fiji\plugins\Macros-mappen, Velg staff. ijm-filen, og klikk deretter OK -knappen. Kommandoene skal nå vises i Plugins > makroer menyen.
6. kvantifisere vaskulær Flow bruke STAFF
- Opprett et nytt prosjekt.
- Velg Plugins > makroer ≫ åpne-Opprett prosjekt og følg spørsmål for å opprette eller oppdatere en konfigurasjonsfil.
- Fra åpne-Opprett prosjekt- menyen navigerer du til og velger prosjekt katalog, inndatafil mappe og inndatafilene Movie. tif og Skeleton. tif. Rediger de automatisk utfylte filnavnene hvis det er nødvendig.
- Input verdier for korteste segment lengde (20 μm), maks hastighet målt (2 000 μm/s) og maks hastighet kartlagt (1 000 μm/s).
Merk: Produktet av korteste segmentet lengde og rammer per sekund gir maksimal strømningshastighet som kan teoretisk måles. Den høyeste kapillær strømningshastigheten rapportert i litteraturen er rundt 2 000 μm/s15. I leveren observerte vi at kapillær strømningshastigheter generelt gjennomsnitt rundt 300 μm/s og sjelden overskredet 1 000 μm/s. - Skriv inn verdiene for pikselstørrelse og bildefrekvens for bildesekvensen (fra bildets metadata eller eksperimentelle notater). Disse verdiene krever brukerinndata. Sjekk flimmer korreksjon boksen hvis bildene har periodisk bakgrunns intensitet flimmer.
- Velg parametere for best visualisering av dataene. Velg maksimal hastighet som er tilordnet til ca. 95% av dataene, slik at dataene tilordnes over hele spekteret i Fargeskalaen. STAFF tilordner høyhastighets outliers til høyhastighets enden av Fargeskalaen.
- Analyser skjelettet.
- Velg Plugins > makroer > analysere skjelett. Skjelett TIF-filen åpnes og den region av interesse (ROI) Manager vil åpne og kjøre.
Merk: Analyser skjelett klassifiserer hver piksel ved sitt antall naboer som enten på et endepunkt, i et veikryss eller innenfor et segment. For hvert segment blir det registrert et identifikasjonsnummer (ID-nummer), en kalibrert gren lengde og romlige koordinater for gren endene. - Vent til segment-IDer vises i skjelettet, segmentlisten vises i ROI Manager, og en popup som indikerer at ROI Manager-filen for skjelettet er lagret. Klikk på OK.
- Kontroller at mellom åndedrett bevegelser, skjelettet forblir over hvor røde blodlegemer passere gjennom kapillær (f. eks, ikke kanten og ikke utenfor kapillær). Vis de merkede segmentene som et overlegg på filmen, ved å åpne filmfilen og deretter dra glidelåsen for ROI-filen til den åpne filmen. Spill av filmen med segmentene kledde.
- Velg Plugins > makroer > analysere skjelett. Skjelett TIF-filen åpnes og den region av interesse (ROI) Manager vil åpne og kjøre.
- Velg tidsintervaller.
- Velg Plugins > makroer > velge tids intervaller. Vent mens makroen genererer en kymograph fra et enkelt segment over den totale tiden for filmen. Fra denne kymograph velger brukeren tidsintervaller for analyse. Bruk CTRL + + tastene for å øke størrelsen på kymograph om nødvendig.
- Rektangel merkings verktøyet aktiveres automatisk. Tegn et rektangel rundt hvert tidsintervall. Et godt utgangspunkt for tidsintervall lengde er 1 – 2 s-intervallet mellom respirations, som vises som vannrette, uskarpe områder i kymograph.
- Klikk på T -tasten eller Legg til -knappen i ROI Manager for å registrere tidsintervall valg. Gjenta for så mange tidsintervaller som ønsket. Gjøre markeringer sekvensielt fra toppen (eller venstre) til bunnen (eller høyre) av kymograph.
- Evaluer parameter valg (fra åpne-Opprett prosjekt) ved å velge et lite antall tidsintervaller (3 til 4) og fullføre analyse for bare disse intervallene, siden analyser Flow (neste trinn) kan ta timer for store datasett.
- Klikk OK i gjør en avkastning for hvert tidsintervall vinduet når du er ferdig. Et popup-vindu vises når de valgte intervallene er lagret i prosjekt-mappen. Klikk på OK.
- Analyser flyt.
- Velg Plugins > makroer ≫ analysere flyt og analysere flyt parametere dialogboksen åpnes, og viser verdiene som er angitt i trinnet åpne-Opprett prosjekt. Rediger hvis nødvendig, og klikk deretter OK.
- Dialogboksen filnavn for utdata åpnes og viser navnene som er angitt i trinnet åpne-Opprett prosjekt. Rediger hvis nødvendig, og klikk deretter OK.
- En dialogboks åpnes og spør om brukeren er klar til å starte analysen. Klikk OK og analysen vil begynne. Vent til en dialogboks som åpnes for å indikere når Flow-analyse er fullført.
Merk: Tiden som kreves avhenger av prosessorhastigheten og størrelsen på datasettet. - Kontroller at resultat filer er lagret som CSV-format regnearkfiler i prosjekt-mappen.
Merk: Output filer inkluderer: segment_velocities. csv inneholder hastighet verdier som har positive og negative verdier som indikerer flyt retning. Celler som representerer segmenter som er mindre enn minimumslengden, inneholder teksten kort. Celler med hastighets verdier større enn den maksimale målte hastigheten inneholder teksten OUT (for avvikende). kym_ang. csv inneholder kymograph vinkler målt av retningen PLUGIN i FIJI. good_fit. csv inneholder godhet av anfall av en kurve til fordelingen av vinkler målt fra hver kymograph. Dårlig godhet Fit (< 0,8) kan indikere skjulte gren poeng i et segment, endring i hastighet i løpet av tidsintervallet, lampe eller rom lys flimmer. - Kontroller at segment_velocities. csv inneholder få OUT-verdier. Hvis det finnes et stort antall OUT-verdier, må du kontrollere at den minste segment lengden som skal analyseres, ikke er mindre enn 15 – 20 μm, og deretter kjøre analyser Flowpå. Hvis den nye segment_velocities. csv fortsatt inneholder en stor andel av OUT-verdier, kan du sjekke flimmer korreksjon boksen, og deretter kjøre analyser Flow.
- Produser romlige kart.
- Velg Plugins > makroer > lage romlige kart og vinduet romlige kart parametere åpnes, og viser verdiene som er angitt i trinnet åpne Opprett prosjekt. Rediger om nødvendig, eller velg OKfor å fortsette.
- Se som en timelig sekvens av romlige kart over strømningshastigheter er generert med farge som indikerer strømningshastighet. Utdataene er i form av en TIF-bilde stabel med ett bilde for hvert tidsintervall. Bla gjennom TIF-stakken for å visualisere romlig og tidsmessig variasjon i flyt. Lagre stabelen som en AVI-fil (ukomprimert for maksimal portabilitet) for å dele som en film.
7. kvantitativ analyse ved hjelp av personale output
- Åpne segment_velocities. CSV-filen i et regneark eller statistisk analyse program. Disse verdiene har et positivt eller negativt tegn som angir retningen på flyten i forhold til start/stopp-punktene for det segmentet (registrert i ROI-filen for segmentet).
- Lag en ny regnearks side som inneholder absolutte verdier for alle hastighetsverdiene. Bruk disse verdiene til å beregne total gjennomsnittlig strømningshastighet, gjennomsnittlig strømningshastighet for alle vaskulære segmenter over tid, strømningshastighet for hvert vaskulær segment over tid, og lag histogrammer av hastighets distribusjoner.
- Beregn verdier rundt bestemte morfologiske regioner eller andre interesseområder ved først å finne de spesifikke relevante segmentene i det merkede skjelettet og deretter utføre analyser på disse valgte segmentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STAFF-analyse genererer en fullstendig folketelling av mikrovaskulær hastigheter over hele mikroskop felt overtids perioder som strekker seg fra sekunder til minutter. Representative resultater presenteres i figur 1, figur 2, Figur 3og Figur 4. Figur 1 viser et eksempel på en tidsserie av mikrovaskulær nettverket i leveren av en mus, generering av skeletonized bildet som brukes til å definere aksen av mikrovaskulær flyt, og staff-genererte kart over individuelle vaskulære segmenter identifisert for kvantifisering. STAFF bruker deretter skeletonized bildet til å bryte mikrovaskulær nettverket ned i individuelle segmenter, deretter genererer bilder av kymographs for hvert segment. Disse bildene er gitt til brukeren, sammen med verktøy for å identifisere tidsintervallene som skal brukes for kymograph analyse (figur 2). STAFF bruker deretter skjelettet, og de bruker-gitt tidsintervaller for å bryte kymograph av hvert segment i individuelle segmentet-tidsintervaller. STAFF identifiserer deretter den dominerende vinkelen i kymograph fra hvert segment-tidsintervall og gir hastighets målinger som. csv-datafiler (Figur 3) og i form av stabler av fargekodede hastighets kart bilder (Figur 4). For å støtte utforskning av dataanalyse rørledningen, gir STAFF også. CSV-filer som inneholder alle kymograph vinkelmål og godhet-av-Fit verdier.
Figur 1: generering av vaskulær skjelett. (A) Original bilde av en enkelt ramme fra tidsserie bilder samlet inn fra leveren av en levende mus. Scale bar = 100 μm. (B) bilde vist i panel A med sentrale ÅRER (CV) og Portal TRIADENE (PT) indikert, for å identifisere de viktigste retningene av sinusoid flyt. (C) bilde fra panel A med overlegg av TrakEM2 segmentering av sinusoids. (D) binært bilde av TrakEM2 segmentering. (E) Skeletonization av TrakEM2 segmentering. (F) personale output bilde av individuelle vaskulær segmenter med etiketter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kymograph analyse. (A) forstørret bilde av vaskulære segmenter vist i figur 1F. (B) typisk kymograph fra ett segment samlet inn over to tidsintervaller mellom luftveiene. Perioder med åndedrett er merket med piler. (C) Kymographs for segmenter 240, 252 og 254 fra panel A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Velocity dataanalyse. (A, B) Tabeller med hastighet målinger av fire segmenter over 19 tidsintervaller uttrykt enten som hastighet med retning (A) eller som absolutt hastighet (B). (C) histogram som viser fordeling av absolutte hastighets verdier over hele feltet over hele 20 s tidsperiode. (D) graf av hastigheter av de tre segmentene som kymographs er vist i figur 2C over hele 20 s periode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: hastighets kart. (A) personale output bilde av fargekodede hastighet kartet for et enkelt tidsintervall for feltet som vises i figur 1. (B) kompositt av hastighet kart for alle tidsintervaller presentert som et 3D-volum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen. Først, minimering av bevegelse under intravital Imaging av leveren er avgjørende for generering av filmer som er brukbare for kapillær Flow analyse bruker STAFF. På grunn av nærheten til membranen, korte perioder med åndedrett-indusert bevegelse oppstår, med sikret leveren tilbake til sin opprinnelige posisjon etter hvert åndedrag. Sikring av kirurgisk eksponert leveren mot dekkglass-bunn parabolen bruker gasbind, deretter Imaging fra nedenfor ved hjelp av en invertert mikroskop tjener til å nakkens orgelet mellom respirations16,17,18,19. For det andre er et bilde oppkjøpet hastighet på 100 fps sterkt anbefalt fordi hastigheten på flyten som kan måles er en funksjon av hastigheten på bildet oppkjøpet og minimum lengde av segmentene der flyten er målt11. Tredje, produsere en høy kvalitet skjelett, linjen tegning representasjon av det vaskulære nettverket, er det neste kritiske skritt i å skaffe kapillær Flow hastigheter ved hjelp STAFF. Skjelett linjesegmenter bør ligge nær midtpunktet av blodkar mellom respirations over tid kurset blir analysert og vaskulær Forgrening ut av bildet flyet skal identifiseres. Plasseringen av disse skjulte grenene langs et vaskulær segment kan utledes ved å se på filmen, ved å undersøke kymograph eller undersøke hastighetsverdiene over tid for dette segmentet. Vise filmen, disse vaskulære segmenter er sett enten som å ha toveis flyt, som kommer bort fra eller sammenfallende mot plasseringen av usett gren, eller som å ha en brå endring i strømningshastighet på det punktet langs vaskulære segmentet. Plasseringen av skjulte gren punkter kan identifiseres i kymographs som plasseringen av en endring i vinkel som er produsert av endringen i strømningsretning eller hastighet. I regnearket kan vaskulære segmenter med skjulte gren posisjoner spuriously endre retning (tegn) eller endre mellom verdiene i de to bidrags segmentene. Hvis tidsserien inneholder for mange gren punkter som er ute av bildet planet, bør STAFF-analyse gjentas etter manuell redigering av skjelettet, ved å plassere et gap (ved hjelp av maling verktøyet) i linje tegningen på plasseringene til de tapte gren punktene.
Vi avdekket et vanlig problem i bildet oppkjøpet som vanligvis går ubemerket, men hadde en sterk effekt på å måle strømningshastigheter bruker STAFF. I bildet oppkjøpet, ustabilitet eller "flimring" i intensiteten av Epi-belysning lampe lyskilde eller fra området belysning i mikroskopet rommet kan forekomme. Fra begge kilder, lys/mørke striper over tid med perioden av flimmer oppstår på null vinkel i kymographs. Hvis null vinkelen toppen er den store toppen, så selv om vinkelen produsert av bevegelse av røde blodlegemer gjennom fartøyet der strømningshastighet måles er åpenbar for det menneskelige øyet, retningen plugin passer en kurve til null peak og rapporterer en verdi svært nær null grader, noe som resulterer i hastighet målinger som er urealistisk høy. Selv om null-vinkel Peak er ikke den store toppen, vil det påvirke retningen kurven passer slik at hastigheten rapportert er forskjøvet mot en høyere verdi. For å løse dette problemet, gir STAFF en "flimmer korreksjon" alternativet som ignorerer topp vinkler oppstår på 0 °. Denne endringen eliminert effekten av lampen flimrer uten å påvirke hastighet quantifications.
Den viktigste begrensningen for innhenting av strømningshastigheter ved hjelp av widefield mikroskopi er at bildet oppkjøpet er begrenset til tynne preparater som chrezbryzheechno blodkar, eller sebrafisk arteria intersegmentalis fartøy eller overfladiske lag av organer som lever eller nyre som kan være exteriorized.
En betydelig fordel med å bruke STAFF over eksisterende metoder for flyt kvantifisering er at det muliggjør rask og upartisk påvisning av romlige og timelige mønstre av vaskulær flyt. Innsamling og analyse av mikrovaskulær flyt data ved hjelp av raster skanning systemer er vanligvis begrenset til målinger av én bruker valgte blodkar om gangen20,21,22,23. Metoder finnes for å trekke ut strømningshastigheter på tvers av felt24,25,26, men ingen av disse tilnærmingene støtter analyse på tvers av hele felt, og alle er arbeidsintensive. Ved hjelp av personale kan analyse av hvert kapillær segment over tid over hele bildefeltet i et datasett med titusenvis av bilder utføres i løpet av en dag. Manuell analyse av selv et enkelt datasett med full-feltet vaskulær flyt ville ta måneder til år. Dermed er manuell analyse upraktisk selv for karakterisering av normal flyt og tydelig tillater ikke sammenligning av flere behandlingsgrupper.
Den enkle STAFF kvantifisering av spatiotemporal mønstre av vaskulær flyt gir mulighet for fremtidige brukere å koble vaskulære morfologiske observasjoner til effekter på kapillær strømningshastighet mønstre. Ved å definere forholdet mellom de vaskulære morfologi målinger av fartøy diametere og nettverkstopologi for å flyte hastighet mønstre vi kan da være i stand til å forutsi strømnings mønstre fra vaskulær morfologi. Tilsvarende samkjøre vaskulær flyt mønstre og vaskulær morfologi med hendelser som timing, lokalisering og omfanget av immun celle infiltrasjon, vevskader fra toxicant eksponering eller sykdom, eller status for intracellulære transport, ville ikke bare gi oss en bedre forståelse av strømnings mønstre og cellulær funksjon i helse og sykdom, men vil også gi et rammeverk for å identifisere spesielt skadelige patofysiologiske scenarioer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Studier som presenteres her ble støttet av finansiering fra National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 og NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital mikroskopi studier ble utført ved Indiana Center for Biological mikroskopi. Vi takker Dr. Malgorzata Kamocka for teknisk assistanse med mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
