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Bioengineering

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60493

Summary

Um den mikrovaskulären Fluss aus Hochgeschwindigkeits-Kapillarflussbildsequenzen zu quantifizieren, haben wir die Software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) entwickelt. Im gesamten Bildfeld und im Laufe der Zeit wertet STAFF Strömungsgeschwindigkeiten aus und generiert eine Sequenz farbcodierter Raumkarten für die Visualisierung und Tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen.

Abstract

Veränderungen der Durchblutungsgeschwindigkeit und -verteilung sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebe- und Organperfusion als Reaktion auf unterschiedliche zelluläre Bedürfnisse. Darüber hinaus kann das Auftreten von Defekten in der Mikrozirkulation ein Primärindikator für die Entwicklung mehrerer Pathologien sein. Fortschritte in der optischen Bildgebung haben die Intravital-Mikroskopie (IVM) zu einem praktischen Ansatz gemacht, der die Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mit hoher Geschwindigkeit im Laufe der Zeit ermöglicht. Doch trotz der Bedeutung der Aufrechterhaltung einer ausreichenden Gewebeperfusion ist die räumliche und zeitliche Variabilität des Kapillarflusses selten dokumentiert. Im Standardansatz wird eine kleine Anzahl von Kapillarsegmenten für die Bildgebung über einen begrenzten Zeitpunkt ausgewählt. Um den Kapillarfluss unvoreingenommen zu quantifizieren, haben wir die Räumliche Temporalanalyse des feldweisen Flusses (STAFF), ein Makro für FIJI Open Source Bildanalysesoftware, entwickelt. Mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildsequenzen von vollen Blutflussfeldern innerhalb von Kapillaren erzeugt STAFF Bilder, die Bewegungen im Zeitverlauf darstellen, die für jedes Zeitintervall für jedes Gefäßsegment als Kymographen bezeichnet werden. Aus den Kymographen berechnet STAFF Geschwindigkeiten aus der Entfernung, die rote Blutkörperchen im Laufe der Zeit bewegen, und gibt die Geschwindigkeitsdaten als eine Sequenz von farbcodierten Raumkarten für die Visualisierung und tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen aus. In normalen Mauslebern quantifizierte STAFF-Analysen tiefgreifende Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen pericentral- und periportal-Regionen innerhalb von Lobulen. Noch unerwarteter sind die Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen Sinusoiden, die nebeneinander stehen, und Schwankungen, die innerhalb einzelner Gefäßsegmente über Sekunden gesehen werden. STAFF ist ein leistungsstarkes neues Werkzeug, das neue Erkenntnisse liefern kann, indem es die Messung der komplexen raumzeitlichen Dynamik des Kapillarflusses ermöglicht.

Introduction

Die Mikrovaskulatur spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie und sorgt für eine effektive Perfusion von Geweben unter wechselnden Bedingungen. Mikrovaskuläre Dysfunktion ist verbunden mit unzähligen Erkrankungen einschließlich langfristiger kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität, Entwicklung von Demenz und Erkrankungen von Leber und Niere und ist daher ein Schlüsselfaktor von Interesse in einem breiten Spektrum von biomedizinischen Untersuchungen1,2,3,4,5. Während mehrere Techniken zur Bewertung der Gewebeperfusion eingesetzt wurden, ermöglicht nur die intravitale Mikroskopie die Datenerfassung in der zeitlichen und räumlichen Auflösung, die notwendig ist, um den Blutfluss auf der Ebene einzelner Kapillaren zu charakterisieren.

Der mikrovaskuläre Fluss kann in der Fluoreszenzmikroskopie entweder durch Bewegung fluoreszierender Mikrosphären oder durch die Bewegung roter Blutkörperchen vor dem Hintergrund membranimpermeant Fluoreszenzmarker (z.B. fluoreszierend dextran oder albumin)6,7visualisiert werden. Der mikrovaskuläre Fluss kann in oberflächlichen Zellschichten mittels Weitfeldmikroskopie oder in der Tiefe mit der konfokalen oder multiphotonen Mikroskopie abgebildet werden. Die Kapillardurchflussraten sind jedoch so, dass der Durchgang roter Blutkörperchen in der Regel nicht mit Geschwindigkeiten unter 60 Frames/s erfasst werden kann. Da die meisten Laserscanning-Konfokal- und Multiphotonenmikroskope 1-5 s benötigen, um ein vollständiges Bildfeld zu scannen, kann diese Geschwindigkeit in der Regel nur erreicht werden, indem das Sichtfeld eingeschränkt wird, manchmal auf eine einzige Scanlinie8. Der Prozess der Begrenzung von Messungen auf ausgewählte Kapillarsegmente (1) hat das Potenzial, Selektionsverzerrungen einzuführen und (2) macht es unmöglich, räumliche und zeitliche Heterogenität in den Raten des kapillaren Blutflusses zu erfassen. Im Gegensatz dazu können Bilder von Kapillarnetzwerken mit Geschwindigkeiten von mehr als 100 fps mit Widefield-Digitalmikroskopen gesammelt werden, die mit wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkameras (sCMOS)9,10ausgestattet sind. Diese kostengünstigen Systeme, die in typischen biomedizinischen Laboratorien üblich sind, ermöglichen es, den mikrovaskulären Fluss über ganze zweidimensionale Netzwerke im Wesentlichen kontinuierlich abzubilden. Das Problem wird dann zu einem Analyseansatz, der in der Lage ist, aussagekräftige quantitative Daten aus den massiven und komplexen Bild-Datasets zu extrahieren, die durch die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie generiert werden.

Um die Analyse von Vollfeld-Flow-Daten zu ermöglichen, haben wir STAFF entwickelt, eine neuartige Bildanalysesoftware, die kontinuierlich den mikrovaskulären Fluss in ganzen Mikroskopfeldern von Bildreihen messen kann, die mit hoher Geschwindigkeit11gesammelt wurden. Der Ansatz ist mit einer Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Systeme und Bildgebungsmodalitäten kompatibel und die STAFF Bildanalyse-Software wird als Makro-Toolset für die FIJI-Implementierung von ImageJ12implementiert. Das zugrunde liegende Prinzip, das hier verwendet wird, um den mikrovaskulären Fluss zu visualisieren, ist, dass zuerst ein gewisser Kontrast vorgesehen werden muss, um die roten Blutkörperchen innerhalb von Kapillaren abbilden zu können. In unseren Studien wird der Kontrast durch eine massenhaft fluoreszierende Sonde bereitgestellt, die von den roten Blutkörperchen ausgeschlossen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit kann dann aus der Verschiebung der roten Blutkörperchen quantifiziert werden, die als negativer Fleck innerhalb des fluoreszierend markierten Plasmas in Bildern erscheinen, die mit hoher Geschwindigkeit von einem lebenden Tier gesammelt wurden8. Wir verwenden dann STAFF, um Entfernungsdiagramme entlang jedes Kapillarsegments über mehrere Zeitintervalle zu erstellen, die als Kymographen bezeichnet werden, und dann die in den Kymographen13vorhandenen Steigungen zu erkennen, und von diesen Hängen aus berechnen wir die Raten des mikrovaskulären Flusses. Der Ansatz kann auf Bilder angewendet werden, die von jedem Kapillarbett gesammelt wurden, auf das für die Bildgebung zugegriffen werden kann. Hier beschreiben wir die Anwendung von IVM und STAFF auf Studien des Blutflusses in der Leber.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University genehmigt und durchgeführt und hielten sich an den NRC-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren.

1. Chirurgische Präparation für die Intravital-Mikroskopie

HINWEIS: Dies ist keine Überlebensoperation. Sobald Abschnitt 1 "Chirurgische Präparation für die intravitale Mikroskopie" begonnen hat, können die Arbeiten bis zum Abschluss von Abschnitt 2 "Intravitalmikroskopie" nicht mehr angehalten werden.

  1. Akklimatisieren Sie 9–10 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse, für mindestens 4 Tage und schnell für 16 h vor Studien.
  2. Wiegen Sie das Tier, sedate mit 5% Isoflurane und legen Sie auf einem Heizkissen Körpertemperatur zu halten. Verwenden Sie einen Sauerstoffdurchfluss von 1–2 L/min und halten Sie die Sedierung mit 1-2% Isofluran aufrecht. Überprüfen Sie Diereflexe durch Zehenstich. Überwachen Sie die Temperatur mit einem rektalen Thermometer. Überwachen Sie Herzfrequenz und Atmung visuell.
  3. Wenn die Anästhesie stabil ist, rasieren Sie den Bereich für die Platzierung der Jugularkanulation und den Bereich unterhalb des Rippenkäfigs für die Exposition der Leber.
  4. Für die Jugularcannulation, machen Sie einen 1 cm linken ventralen Schnitt 1–2 cm unter dem Kiefer der Maus. Löschen Sie alle Fette und Faszien rund um die Jugularvene. Binden Sie das vordere Ende des Jugulars mit 06 Nahtschnur ab, um Blutungen zu verhindern.
    1. Machen Sie einen winzigen Nick in der Jugularvene und schieben Sie die Kanüle (30 G x 1/2 Zoll, Nadel), Nadelhalter und Polyethylen-Schlauch (0,011 x 0,024 Zoll2 an einem Luer-Stub-Adapter befestigt und mit 0,9% Saline gefüllt) in ca. 1 cm, und am hinteren Ende des Jugulars mit 0-6 Nahtschnur sichern.
  5. Mit der Jugularkanüle liefern 70 kDa Fluorescein dextran (in einer Dosis von 30 mg/kg durch Injektion von 0,1 ml einer 9 mg/ml Lösung in Saline).
  6. Setzen Sie die Leber für die Bildgebung aus, indem Sie einen 4–6 cm großen Schnitt über den Oberkörper machen, 1–2 cm unterhalb der Mitte des Rippenkäfigs.
  7. Legen Sie einen nassen (in 0,9% Saline getränkten) 2 x 2 Zoll2 Gazeschwamm unter den linken seitlichen Leberlappen. Legen Sie Klebeband an die Peripherie des Glasfensters einer 40 mm Coverslip-Bodenschale und tragen Sie Cyanoacrylatkleber auf das Band auf. Drücken Sie die Glasplatte auf die Leber und drücken Sie mit Watte-Kipp-Applikatoren die Gaze in den Kleber auf dem Band, um die Gewebebewegung für die Mikroskopie zu minimieren.
  8. Tier auf die Mikroskopstufe bringen. Fügen Sie sterile 0,9% Saline in die Decke-Boden-Boden-Schale, um die Leber feucht während der Bildgebung Sitzung zu halten. Halten Sie die Temperatur bei 36–37 °C über auf der Bühne montierte Heizkissen, ein über dem Tier platziertes Heizkissen und eine Objektivheizung.

2. Intravitale Mikroskopie

  1. Führen Sie die intravitale Mikroskopie auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop durch, das mit einer Videokamera ausgestattet ist, die eine Hochgeschwindigkeits-Bildaufnahme durchführen kann.
    HINWEIS: Hier kamen eine Xenon-Lichtbogenlampe, eine fluoresceinspezifische Anregung (480–500 nm) und Emissionsfilter (507–543 nm), Plan Fluor 20x, N.A. 0,75 Wassertauchobjektiv und eine Hochgeschwindigkeits-SCMOS-Kamera zum Einsatz.
  2. Wählen Sie den Interessenbereich für die Kapillar-Blutflussanalyse mit minimaler Beleuchtung aus.
  3. Stellen Sie die Belichtungszeit so kurz ein, dass die Kamera 100 fps erfassen kann. Stellen Sie die Beleuchtungsstärke ein, um rote Blutkörperchen und die Topologie der Vaskulatur deutlich zu visualisieren und gleichzeitig Phototoxizität und Photobleichung der Fluoreszenzsonde zu vermeiden.
  4. Sammeln Sie Bilder mit einer Rate von 100 fps. Stellen Sie die Auflösung des Kamerapixels zwischen 0,65 und 1,3 m/Pixel ein. Stellen Sie die Framegröße zwischen 512 x 512 und 1024 x 1024 Pixel n. Chr. ein. Stellen Sie die Bittiefe zwischen 8 und 16 Bit ein. Verwenden Sie die höchste Auflösung, Framegröße und Bittiefe, die immer noch eine Bildsammlung von 100 fps auf dem System ermöglicht.
  5. Sparen Sie Zeitreihendateien als eine Sequenz von TIF-Dateien oder als natives Kamera-/Mikroskopformat, wenn Bio-Formate14 in FIJI die nativen Formatdateien öffnen können.
  6. Bild mehrere Bereiche im Laufe der Zeit. Halten Sie die Maus auf der Mikroskop-Stufe für bis zu 2 h. Euthanisieren Sie die Maus am Ende der Bildgebung.
    HINWEIS: Die Dauer der Zeitreihe basiert auf dem Ausgleich der Notwendigkeit, für ein Zeitintervall abzubilden, das die Variabilität umfasst, ohne die Lebensfähigkeit des Gewebes zu beeinträchtigen. Die Dauer der Zeitreihe kann auch durch Überlegungen zur Dateigröße bestimmt werden. eine 1 min Zeitreihe von 1024 x 1024 Pixel 16-Bit-Bildern, die mit 100 fps gesammelt werden, generiert eine Datei, die 12 GB groß ist. Überlegungen zur Dateigröße können auch die verwendete Framegröße und Bittiefe bestimmen. Es gibt keine expliziten Größenbeschränkungen in STAFF.

3. Definieren Sie das Gefäßnetzwerk mit TrakEM2 in FIJI

HINWEIS: Das Protokoll kann nach dem Speichern der Arbeit an einem beliebigen Punkt in Abschnitt 3 angehalten werden.

  1. Laden Sie FIJI von https://imagej.net/Fiji/Downloads herunter und installieren Sie es.
    HINWEIS: Version 1.51n von Fidschi wurde für dieses Projekt verwendet und kann von https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip heruntergeladen werden. Beachten Sie, dass UNTER Windows FIJI im Benutzerbereich und nicht in Programmdateien installiert werden sollte.
  2. Öffnen Sie die Filmdatei in FIJI mit Datei > Datei öffnen oder verwenden Sie Datei > Importieren > Bildsequenz. Wählen Sie ein einzelnes Bild aus den stabilen Bildern zwischen Atmungen aus, bei denen die Topologie des Gefäßnetzwerks leicht zu erkennen ist. Wählen Sie Bild > Duplizieren und duplizieren Sie das ausgewählte Einzelbild (nicht den Stapel) und speichern Sie das Bild in einem neuen Ordner. Schließen Sie keine Leerzeichen in Datei- oder Ordnernamen ein.
  3. Richten Sie ein neues leeres TrakEM2-Projekt ein, indem Sie Datei > Neu > TrakEM2 (leer)auswählen. Wählen Sie den neuen Ordner aus, der das einzelne Bild aus dem Film als Projektordner enthält. Die TrakEM2-Fenster werden geöffnet.
  4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Hauptarbeitsbereich, und wählen Sie Import > Bild importierenaus. Navigieren Sie zu dem in Schritt 3.3 gespeicherten Einzelbild und wählen Sie es aus.
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut in den Hauptarbeitsbereich und wählen Sie Anzeigen > Autoresize canvas/Layer set. Linksklick im Hauptarbeitsfenster. Das Bild füllt den Arbeitsbereich.
  6. Um die Bereiche im Bild auszuwählen, die das Gefäßnetzwerk enthalten, richten Sie die Auswahl der Bereichslisten in TrakEM2 ein. Im kleineren TrakEM2-Fenster (Template, Projektobjekte, Layer) klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "• alles". Wählen Sie Neue untergeordnete > Bereichslistehinzufügen aus.
  7. Ziehen Sie im kleineren TrakEM2-Fenster "Vorlage > alles" auf "Projektobjekte > Projekt". Ziehen Sie dann "Vorlage > alles > • Flächenliste" auf "Projektobjekte > Projekt > alles". Unter "Projektobjekte > Projekt > alles", • wird nun die Flächenliste vorhanden sein.
  8. Im Hauptfenster TrakEM2 unter der Registerkarte Z-Raumwurde eine mit Balken beschriftete Bereichsliste erstellt. Klicken Sie hier, um es auszuwählen. Wählen Sie im Hauptfenster TrakEM2 auch das Pinselwerkzeugaus. Drücken Sie umschalten und rollen Sie das Mausrad, um eine geeignete Größe für den Pinsel auszuwählen, z. B. kleiner als der Durchmesser der Vaskulatur. Um die TrakEM2-Einrichtung zu speichern, drücken Sie die Tasten Control + S.
  9. Malen Sie das Gefäßnetzwerk mit dem Pinselwerkzeug. Um Alt zu löschen, während Sie das Pinselwerkzeug verwenden. Schließen Sie keine Nichtfokusregionen ein. Sparen Sie häufig mit Control + S.
  10. Wenn die Beschriftung des Gefäßnetzwerks abgeschlossen ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste in das TrakEM2-Hauptfenster, und wählen Sie Export > AreaLists als Beschriftungen (tif). Wählen Sie im Popup-Fenster Maßstab 100 % und Alle Flächenausexportieren aus. Schließen Sie TrakEM2-Fenster, und wählen Sie Ja für Projekt speichern.
  11. Das Bild von AreaLists wird geöffnet und kann als leeres schwarzes Bild angezeigt werden. Wählen Sie im Hauptmenü FIJI Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast. Drücken Sie im B&C-Fenster die Auto-Taste, und die AreaList wird sichtbar. Wählen Sie im Hauptmenü FIJI Bild > Nachsuchtabellen > LUT invertieren aus. Speichern Sie dieses Bild mit schwarzen Beschriftungen auf weißem Hintergrund, und schließen Sie das Bild.
  12. Öffnen Sie die Etikettendatei in FIJI. Wählen Sie Plugins > Skelett > Skelettisieren. Speichern Sie das skelettierte Bild als tif. Verwenden Sie die Datei skeleton.tif als eine der Eingabedateien, die zum Ausführen der STAFF-Flussanalyse erforderlich sind. Verwenden Sie beim Speichern der Datei keine Leerzeichen im Dateinamen.
  13. Bearbeiten Sie die Skelettdatei nach Bedarf manuell, indem Sie eine Lücke (mit dem Malwerkzeug)in der Linienzeichnung platzieren, z. B. an Stellen, an denen Zweige in der Gefäßstruktur nicht erfasst wurden, weil sie aus der Bildebene herausgehen.

4. Vorbereiten der Filmsequenz für die STAFF-Analyse

  1. Öffnen Sie die Filmdatei in FIJI mit Datei > Öffnen oder Datei > Importieren > Bildsequenz. Wählen Sie einen Zeitraum der Bildsequenz für die Strömungsanalyse (kann Sekunden bis Minuten, Hunderte bis Zehntausende von Frames sein), in dem die Gewebeposition im Laufe der Zeit stabil geblieben ist, außer während der Atmung.
  2. Wählen Sie Bild > Duplizieren und duplizieren Sie den ausgewählten Teil der Sequenz, indem Sie die Zahlen des Anfangs- und Endframes eingeben. Überprüfen Sie die räumliche und zeitliche Bildkalibrierung unter Bild > Eigenschaften und korrigieren Sie sie bei Bedarf. Speichern Sie die Bilddatei als TIF (oder als unkomprimiertes AVI). Diese movie.tif wird als Eingabedatei benötigt, um die STAFF-Analyse auszuführen. Schließen Sie keine Leerzeichen in den Dateinamen ein.

5. Installieren Sie STAFF-Makros in FIJI

HINWEIS: (Wichtig) Mehrere Ordner innerhalb der FIJI-Ordner-Unterverzeichnisse haben ähnliche Dateinamen, einige großgeschrieben, einige nicht. Stellen Sie sicher, dass die richtigen Ordner bei der Installation von STAFF ausgewählt sind.

  1. Laden Sie die STAFF-Makros von https://github.com/icbm-iupui/STAFF herunter.
  2. Öffnen Sie zunächst den Ordner FIJI, um zu installieren.
    1. Suchen Sie unter Windows den Ordner, in dem FIJI im Benutzerbereich installiert ist, am häufigsten auf dem Desktop. Finden Sie unter MacOS das FIJI-Symbol im Ordner Anwendungen, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Öffnenaus.
  3. Öffnen Sie im Ordner FIJI den Plugins-Ordner. Öffnen Sie im Ordner Plugins den Ordner Makros. Kopieren Sie STAFF.ijm in diesen Makroordner: Fidschi-Plugins-Macros-STAFF.ijm.
  4. Öffnen Sie im Ordner FIJI den Plugins-Ordner. Kopieren Sie STAFF_Dir.jar in diesen Plugin-Ordner: Fidschi-Plugins-STAFF_Dir.jar.
  5. Öffnen Sie im Ordner FIJI den Makroordner. Öffnen Sie in diesem Makroordner den AutoRun-Ordner. Kopieren Sie STAFF_Loader.ijm in diesen AutoRun-Ordner: Fidschi-Makros, AutoRun, STAFF_Loader.ijm.
  6. Starten Sie FIJI, und überprüfen Sie die Makroinstallation. Um die Installation zu überprüfen, wählen Sie Plugins > Makros. Wenn das Dropdown-Menü korrekt installiert ist, enthält das Dropdown-Menü: Projekt öffnen, Skelett analysieren, Zeitintervalle bearbeiten, Fluss analysieren und räumliche Karte erzeugen.
  7. Wenn diese Befehle nicht im Menü Makros vorhanden sind, wählen Sie Plugins > Makros > Installieren, Öffnen Sie den Ordner Fidschi-Plugins-Macros, wählen Sie die Datei STAFF.ijm aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche OK. Die Befehle sollten nun im Menü Plugins > Makros angezeigt werden.

6. Quantifizierung des Gefäßflusses mit STAFF

  1. Erstellen Sie ein neues Projekt.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Projekt öffnen und folgen Sie den Anweisungen zum Erstellen oder Aktualisieren einer Konfigurationsdatei.
    2. Navigieren Sie im Menü Projekt öffnen zum Projektverzeichnis, zum Eingabedateiordner und zu den Eingabedateien Movie.tif und Skeleton.tif, und wählen Sie es aus. Bearbeiten Sie ggf. die Namen der automatisch ausgefüllten Ausgabedatei.
    3. Eingangswerte für kürzeste Segmentlänge (20 m), gemessene Höchstgeschwindigkeit (2.000 m/s) und maximale Geschwindigkeit zugeordnet (1.000 m/s).
      HINWEIS: Das Produkt mit kürzester Segmentlänge und Frames pro Sekunde ergibt die theoretisch messbare maximale Durchflussgeschwindigkeit. Die höchsten kapillaren Durchflussgeschwindigkeiten, die in der Literatur berichtet werden, liegen bei etwa 2.000 m/s15. In der Leber beobachteten wir, dass die Kapillarflussgeschwindigkeiten im Durchschnitt bei etwa 300 m/s lagen und selten 1.000 m/s überstiegen.
    4. Geben Sie die Werte für Pixelgröße und Bildrate für die Bildsequenz ein (aus Bildmetadaten oder experimentellen Notizen). Diese Werte erfordern Benutzereingaben. Aktivieren Sie das Feld Flicker-Korrektur, wenn die Bilder regelmäßig hintergrundintensitätsflackern.
    5. Wählen Sie Parameter für die beste Visualisierung der Daten aus. Wählen Sie die maximale Geschwindigkeit aus, die zugeordnet ist, um etwa 95 % der Daten einzuschließen, sodass die Daten über den gesamten Bereich der Farbskala zugeordnet werden. STAFF ordnet Hochgeschwindigkeitsausreißer dem Hochgeschwindigkeitsende der Farbskala zu.
  2. Analysieren Sie das Skelett.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Skelett analysieren . Die Datei skeleton.tif wird geöffnet und der ROI-Manager (Region of Interest) wird geöffnet und ausgeführt.
      HINWEIS: Analysieren von Skelett klassifiziert jedes Pixel nach seiner Anzahl von Nachbarn als entweder an einem Endpunkt, an einer Kreuzung oder innerhalb eines Segments. Für jedes Segment werden eine Identifikationsnummer (ID-Nummer), eine kalibrierte Verzweigungslänge und die räumlichen Koordinaten der Verzweigungsen den Enden aufgezeichnet.
    2. Warten Sie, bis Segment-IDs auf dem Skelett angezeigt werden, die Segmentliste im ROI-Manager und ein Popup, das angibt, dass die ROI Manager-Datei für das Skelett gespeichert ist. Klicken Sie auf OK.
    3. Stellen Sie sicher, dass zwischen den Atmungsbewegungen das Skelett dort bleibt, wo rote Blutkörperchen durch die Kapillare gehen (z. B. nicht die Kante und nicht außerhalb der Kapillare). Zeigen Sie die beschrifteten Segmente als Overlay im Film an, indem Sie die Filmdatei öffnen und dann die ROI-ZIP-Datei in den geöffneten Film ziehen. Spielen Sie den Film mit den segmentierten Segmenten ab.
  3. Wählen Sie Zeitintervalle aus.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Zeitintervalleauswählen . Warten Sie, während das Makro einen Kymographen aus einem einzelnen Segment über die Gesamtzeit für den Film generiert. Aus diesem Kymographwählt wählt der Benutzer Zeitintervalle für die Analyse aus. Verwenden Sie Control + + Tasten, um die Größe des Kymographen bei Bedarf zu erhöhen.
    2. Das Rechteckauswahlwerkzeug wird automatisch aktiviert. Zeichnen Sie ein Rechteck um jedes Zeitintervall. Ein guter Ausgangspunkt für die Zeitintervalllänge ist das Intervall von 1–2 s zwischen Atmungsaufatmungen, die als horizontale verschwommene Bereiche im Kymographen sichtbar sind.
    3. Klicken Sie im ROI-Manager auf die T-Taste oder die Schaltfläche Hinzufügen, um die Auswahl des Zeitintervalls aufzuzeichnen. Wiederholen Sie dies für beliebig viele Zeitintervalle. Treffen Sie eine Auswahl sequenziell von oben (oder links) bis unten (oder rechts) des Kymographen.
    4. Bewerten Sie die Parameterauswahl (aus Open-Create Project), indem Sie eine kleine Anzahl von Zeitintervallen (3 bis 4) auswählen und die Analyse nur für diese Intervalle abschließen, da "Flow analysieren" (der nächste Schritt) für große Datasets Stunden in Anspruch nehmen kann.
    5. Klicken Sie im Erstellen eines ROI für jedes Zeitintervallfenster auf OK, wenn Sie fertig sind. Ein Popupfenster wird angezeigt, wenn die ausgewählten Intervalle im Projektordnergespeichert wurden. Klicken Sie auf OK.
  4. Analysieren Sie den Fluss.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Flow analysieren und das Dialogfeld Flow-Parameter analysieren öffnet und zeigt die Werte an, die im Schritt Projekt öffnen eingegeben wurden. Bei Bedarf bearbeiten und dann auf OKklicken.
    2. Das Dialogfeld Dateinamen ausgeben wird geöffnet und zeigt die Namen an, die im Schritt Projekt öffnen eingegeben wurden. Bei Bedarf bearbeiten und dann auf OKklicken.
    3. Es wird ein Dialogfeld geöffnet, in dem sie gefragt wird, ob der Benutzer bereit ist, mit der Analyse zu beginnen. Klicken Sie auf OK, und die Analyse beginnt. Warten Sie auf ein Dialogfeld, das geöffnet wird, um anzugeben, wann die Flussanalyse abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Die benötigte Zeit hängt von der Prozessorgeschwindigkeit und -größe des Datasets ab.
    4. Vergewissern Sie sich, dass Ergebnisdateien als Tabellenkalkulationsdateien im Csv-Format im Projektordner gespeichert wurden.
      HINWEIS: Ausgabedateien enthalten: segment_velocities.csv enthält Geschwindigkeitswerte, die positive und negative Werte aufweisen, die die Strömungsrichtung angeben. Zellen, die Segmente darstellen, die kleiner als die minimale Länge sind, enthalten den Text SHORT. Zellen mit Geschwindigkeitswerten, die größer als die gemessene Höchstgeschwindigkeit sind, enthalten den Text OUT (für Ausreißer). kym_ang.csv enthält Kymographenwinkel, die mit dem Directionality Plugin in FIJI gemessen werden. good_fit.csv enthält die Güte der Anpassung einer Kurve an die Verteilung der Winkel, die von jedem Kymograph gemessen werden. Schlechte Passfähigkeit (< 0,8) kann auf versteckte Astpunkte in einem Segment, Geschwindigkeitsänderung während des Zeitintervalls, Lampen- oder Raumlichtflimmern hinweisen.
    5. Überprüfen Sie, ob segment_velocities.csv nur wenige OUT-Werte enthält. Wenn eine große Anzahl von OUT-Werten vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass die zu analysierende minimale Segmentlänge nicht weniger als 15–20 m beträgt, und führen Sie dann Flow analysierenerneut aus. Wenn die neue segment_velocities.csv immer noch einen großen Anteil an OUT-Werten enthält, aktivieren Sie das Flickerkorrekturfeld, und führen Sie dann Flow analysierenerneut aus.
  5. Erstellen Sie räumliche Karten.
    1. Wählen Sie Plugins > Makros > Räumliche Karte erzeugen und das Fenster Räumliche Kartenparameter wird geöffnet, in dem die im Schritt Projekt öffnen eingegebenen Werte angezeigt werden. Bearbeiten Sie bei Bedarf, oder wählen Sie OKaus.
    2. Beobachten Sie, wie eine zeitliche Abfolge räumlicher Karten von Strömungsgeschwindigkeiten mit Einer Farbe generiert wird, die die Strömungsgeschwindigkeit angibt. Die Ausgabe erfolgt in Form eines .tif-Bildstapels mit einem Bild für jedes Zeitintervall. Scrollen Sie durch den .tif-Stack, um räumliche und zeitliche Variationen im Flow zu visualisieren. Speichern Sie den Stapel als AVI-Datei (unkomprimiert für maximale Portabilität), um ihn als Film freizugeben.

7. Quantitative Analyse mit STAFF-Ausgang

  1. Öffnen Sie die Datei segment_velocities.csv in einer Kalkulationstabelle oder einem statistischen Analyseprogramm. Diese Werte haben ein positives oder negatives Vorzeichen, das die Strömungsrichtung relativ zu den Start-/Stopppunkten dieses Segments angibt (in der Segment-ROI-Datei aufgezeichnet).
  2. Erstellen Sie eine neue Tabellenkalkulationsseite, die die absoluten Werte aller Geschwindigkeitswerte enthält. Verwenden Sie diese Werte, um die durchschnittliche Gesamtströmungsgeschwindigkeit, die durchschnittliche Strömungsgeschwindigkeit für alle Gefäßsegmente im Zeitverlauf, die Strömungsgeschwindigkeit für jedes Gefäßsegment im Zeitverlauf zu berechnen und Histogramme von Geschwindigkeitsverteilungen vorzunehmen.
  3. Berechnen Sie Werte um bestimmte morphologische Regionen oder andere interessenspezifische Regionen, indem Sie zunächst die spezifischen relevanten Segmente im markierten Skelett finden und dann Analysen für diese ausgewählten Segmente durchführen.

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Representative Results

Die STAFF-Analyse erzeugt eine vollständige Zählung der mikrovaskulären Geschwindigkeiten über ganze Mikroskopfelder hinweg über Zeiträume von Sekunden bis Minuten. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4dargestellt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Zeitreihe des mikrovaskulären Netzwerks in der Leber einer Maus, die Erzeugung des skelettierten Bildes, das zur Definition der Achse des mikrovaskulären Flusses verwendet wird, und die VON STAFF generierte Karte einzelner Vaskulärsegmente, die für die Quantifizierung identifiziert wurden. STAFF verwendet dann das skelettierte Bild, um das mikrovaskuläre Netzwerk in einzelne Segmente aufzuteilen und generiert dann Bilder von Kymographen für jedes Segment. Diese Bilder werden dem Benutzer zusammen mit Werkzeugen zur Verfügung gestellt, um die Zeitintervalle zu identifizieren, die für die Kymographenanalyse verwendet werden sollen (Abbildung 2). STAFF verwendet dann das Skelett und die vom Benutzer bereitgestellten Zeitintervalle, um den Kymographen jedes Segments in einzelne Segment-Zeitintervalle aufzuteilen. STAFF identifiziert dann den vorherrschenden Winkel im Kymographen aus jedem Segment-Zeitintervall und stellt Geschwindigkeitsmessungen als .csv-Datendateien (Abbildung 3) und in Form von Stapeln von farbcodierten Geschwindigkeitskartenbildern bereit (Abbildung 4). Um die Erforschung der Datenanalyse-Pipeline zu unterstützen, stellt STAFF auch .csv-Dateien bereit, die alle Kymographenwinkelmessungen und Güte-of-Fit-Werte enthalten.

Figure 1
Abbildung 1: Generierung des Gefäßskeletts. (A) Originalbild eines einzelnen Frames aus Zeitreihenbildern, die aus der Leber einer lebenden Maus gesammelt wurden. Skala bar = 100 m. (B) Bild in Panel A mit zentralen Venen (CV) und Portaltriaden (PT) angegeben, um hauptrichtungen des Sinusflusses zu identifizieren. (C) Bild aus Panel A mit Überlagerung der TrakEM2-Segmentierung von Sinusoiden. (D) Binäres Bild der TrakEM2-Segmentierung. (E) Skelettierung der TrakEM2-Segmentierung. (F) STAFF-Ausgangsbild einzelner Gefäßsegmente mit Etiketten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Kymographenanalyse. (A) Vergrößertes Bild der Gefäßsegmente in Abbildung 1Fdargestellt . (B) Typischer Kymograph aus einem Segment, der über zwei Interatemsonenzeitintervalle gesammelt wurde. Atmungsphasen werden mit Pfeilen notiert. (C) Kymographen für die Segmente 240, 252 und 254 aus Panel A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Geschwindigkeitsdatenanalyse. (A, B) Tabellen der Geschwindigkeitsmessungen von vier Segmenten über 19 Zeitintervalle, ausgedrückt entweder als Geschwindigkeit mit Richtung (A) oder als absolute Geschwindigkeit (B). (C) Histogramm mit Verteilung der absoluten Geschwindigkeitswerte über das gesamte Feld über den gesamten Zeitraum von 20 s. (D) Grafik der Geschwindigkeiten der drei Segmente, deren Kymographen in Abbildung 2C über den gesamten Zeitraum von 20 s dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Geschwindigkeitskarte. (A) STAFF-Ausgabebild der farbcodierten Geschwindigkeitszuordnung für ein einzelnes Zeitintervall für das in Abbildung 1dargestellte Feld . (B) Zusammengesetzte Geschwindigkeitskarten für alle Zeitintervalle, die als 3D-Volumen dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll enthält mehrere wichtige Schritte. Erstens ist die Minimierung der Bewegung während der intravitalen Bildgebung der Leber wichtig für die Erzeugung von Filmen, die für die Kapillarflussanalyse mit STAFF verwendet werden können. Aufgrund der Nähe des Zwerchfells treten kurze Phasen der Atmungs-induzierten Bewegung auf, wobei die gesicherte Leber nach jedem Atemzug in ihre Ausgangsposition zurückkehrt. Die Sicherung der chirurgisch exponierten Leber gegen die Abdeckungsplatte mit Gaze, dann die Bildgebung von unten mit einem invertierten Mikroskop dient zur Immobilisierung des Organs zwischen den Atmungs-16,17,18,19. Zweitens wird eine Bildaufnahmegeschwindigkeit von 100 fps dringend empfohlen, da die gemessene Durchflussgeschwindigkeit eine Funktion der Geschwindigkeit der Bildaufnahme und der Mindestlänge der Segmente ist, in denen der Durchfluss gemessen wird11. Drittens ist die Herstellung eines hochwertigen Skeletts, der Linienzeichnungsdarstellung des Gefäßnetzes, der nächste entscheidende Schritt bei der Erzielung von Kapillarströmungsgeschwindigkeiten mit STAFF. Skelettliniensegmente sollten in der Nähe des Mittelpunkts der Vaskulatur zwischen Atmungen während der Zeit, die analysiert wird, und vaskulären Verzweigungen aus der Bildebene identifiziert werden. Die Positionen dieser verborgenen Zweige entlang eines Gefäßsegments lassen sich durch betrachten den Film, durch Untersuchung des Kymographen oder durch Untersuchung der Geschwindigkeitswerte im Zeitverlauf für dieses Segment ableiten. Wenn man sich den Film ansieht, werden diese Gefäßsegmente entweder als bidirektionaler Fluss betrachtet, der von der Position des unsichtbaren Zweigs weggeht oder sich in Richtung der Position des unsichtbaren Zweigs konvergiert, oder als eine abrupte Änderung der Durchflussgeschwindigkeit an diesem Punkt entlang des Gefäßsegments. Die Position der versteckten Verzweigungspunkte kann in Kymographen als die Position einer Winkeländerung identifiziert werden, die durch die Änderung der Strömungsrichtung oder -geschwindigkeit erzeugt wird. In der Kalkulationstabelle können Gefäßsegmente mit versteckten Verzweigungspositionen die Richtung (Zeichen) oder zwischen den Werten der beiden beitragenden Segmente nachundflummeln." Wenn die Zeitreihe zu viele Verzweigungspunkte enthält, die sich aout aofder ader der Bildebene befinden, sollte die STAFF-Analyse nach der manuellen Bearbeitung des Skeletts wiederholt werden, indem eine Lücke (mit dem Malwerkzeug) in der Linienzeichnung an den Positionen der verpassten Verzweigungspunkte platziert wird.

Wir entdeckten ein häufiges Problem bei der Bildaufnahme, das normalerweise unbemerkt bleibt, aber einen starken Einfluss auf die Messung von Strömungsgeschwindigkeiten mit STAFF hatte. Bei der Bildaufnahme kann es zu Instabilität oder "Flicker" in der Intensität der Epi-Beleuchtungslampenlichtquelle oder aus flächenbezogener Beleuchtung im Mikroskopraum kommen. Von beiden Quellen aus tritt die licht-dunkle Bandierung im Laufe der Zeit mit der Periode des Flimmerns in den Kymographen im Nullwinkel auf. Wenn der Nullwinkel-Peak der Hauptgipfel ist, dann ist selbst wenn der Winkel, der durch die Bewegung roter Blutkörperchen durch das Gefäß erzeugt wird, wo die Strömungsgeschwindigkeit gemessen wird, für das menschliche Auge offensichtlich ist, passt das Richtungs-Plugin eine Kurve zum Nullpunkt an und meldet einen Wert sehr nahe null Grad, was zu Geschwindigkeitsmessungen führt, die unrealistisch hoch sind. Auch wenn der Nullwinkelgipfel nicht der Hauptgipfel ist, wird er die Richtungskurve so beeinflussen, dass die gemeldete Geschwindigkeit in Richtung eines höheren Wertes verschoben wird. Um dieses Problem zu beheben, bietet STAFF eine "Flicker-Korrektur"-Option, die Spitzenwinkel ignoriert, die bei 0° auftreten. Diese Modifikation eliminierte die Auswirkungen des Lampenflimmerns, ohne die Geschwindigkeitsquantifizierungen zu beeinflussen.

Die Hauptbeschränkung bei der Erlangung von Strömungsgeschwindigkeiten mittels Weitfeldmikroskopie besteht darin, dass die Bildaufnahme auf dünne Präparate wie die mesenterische Vaskulatur oder die Zebrafisch-Intersegmentgefäße oder die oberflächlichen Schichten von Organen wie Leber oder Niere, die nach außen gerichtet werden kann.

Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von STAFF gegenüber bestehenden Methoden der Durchflussquantifizierung besteht darin, dass es eine schnelle und unvoreingenommene Detektion räumlicher und zeitlicher Muster des Gefäßflusses ermöglicht. Die Erfassung und Analyse von mikrovaskulären Strömungsdaten mit Raster-Scansystemen beschränkt sich im Allgemeinen auf Messungen von einzelbenutzerdefinierten Kapillaren zu einem Zeitpunkt20,21,22,23. Es gibt Methoden zum Extrahieren von Strömungsgeschwindigkeiten über Felder24,25,26, jedoch unterstützt keiner dieser Ansätze die Analyse über ganze Felder hinweg und alle sind arbeitsintensiv. Mit STAFF kann die Analyse jedes Kapillarsegments im Laufe der Zeit über das gesamte Bildfeld eines Datensatzes mit Zehntausenden von Bildern innerhalb eines Tages durchgeführt werden. Die manuelle Analyse sogar eines einzelnen Datensatzes des Vollfeld-Gefäßflusses würde Monate bis Jahre dauern. Daher ist die manuelle Analyse selbst zur Charakterisierung des normalen Durchflusses unpraktisch und erlaubt eindeutig keinen Vergleich mehrerer Behandlungsgruppen.

Die einfache STAFF-Quantifizierung der raumzeitlichen Musterung des Gefäßflusses bietet zukünftigen Anwendern die Möglichkeit, vaskuläre morphologische Beobachtungen mit Auswirkungen auf die Kapillarströmungsgeschwindigkeit simgieren zu können. Durch die Definition der Beziehung zwischen den vaskulären Morphologiemessungen der Gefäßdurchmesser und der Netzwerktopologie zur Strömungsgeschwindigkeitsmusterung können wir dann Strömungsmuster aus der Gefäßmorphologie vorhersagen. In ähnlicher Weise würde die Korrelation von Vaskulärflussmusterung und vaskulärer Morphologie mit Ereignissen wie Timing, Lokalisierung und Ausmaß der Infiltration von Immunzellen, Gewebeschäden durch toxische Exposition oder Krankheit oder Status des intrazellulären Transports ein besseres Verständnis der Strömungsmusterung und der zellulären Funktion bei Gesundheit und Krankheit, würde aber auch einen Rahmen für die Identifizierung besonders schädlicher pathophysiologischer Szenarien bieten.

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Disclosures

Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

Die hier vorgestellten Studien wurden durch Fördermittel der National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 und NIH NIDDK P30 DK079312) unterstützt. Intravitale Mikroskopie-Studien wurden am Indiana Center for Biological Microscopy durchgeführt. Wir danken Dr. Malgorzata Kamocka für die technische Unterstützung bei der Mikroskopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice Jackson Labs male 9-12 weeks old
Cannula Instech BTPE-10 Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches
CMOS camera Hamamatsu C11440-42U30 4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish Electron Microscopy Sciences WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran Thermo Fisher, Invitrogen D1822 Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge Fisher 22-415-504 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad Reptitherm RH-4 between mouse and stage
Heating pad Sunbeam 000732-500-000U over mouse
Inverted epifluorescence microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver Braun Aesculap GT420
Isofluorane Abbott GmbH PZN4831850
Luer stub adapter Fisher 14-826-19E Catheter adapter
Micro scissors Castro Viejo
Microscope objective Nikon Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle Fisher 30 G x1/2"
Needle holder Olsen-Hegar
Objective heater BioScience Tools MTC-HLS-025 Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer Braintree Scientific, INC TH-5A Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string Harvard Bioscience 723288 silk black suture, 6-0, spool

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References

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  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

Tags

Bioengineering Ausgabe 153 Kapillare Hämodynamik Intravitalmikroskopie mikrovaskuläre rote BlutkörperchenGeschwindigkeit Mikrovaskulatur
Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur
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Clendenon, S. G., Fu, X., Von Hoene, R. A., Clendenon, J. L., Sluka, J. P., Winfree, S., Mang, H., Martinez, M., Filson, A., Klaunig, J. E., Glazier, J. A., Dunn, K. W. Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature. J. Vis. Exp. (153), e60493, doi:10.3791/60493 (2019).

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