Summary
For at kvantificere microvaskulære flow fra high speed kapillar flow billedsekvenser, vi udviklede personale (Spatial tidsmæssig analyse af Fieldwise flow) software. På tværs af hele billedfeltet og over tid evaluerer medarbejderne flowhastigheder og genererer en sekvens af farvekodede rumkort til visualisering og tabel output til kvantitative analyser.
Abstract
Ændringer i blodgennemstrømningen hastighed og distribution er afgørende for at opretholde væv og organ perfusion som reaktion på varierende cellulære behov. Desuden kan forekomsten af defekter i mikrocirkulationen være en primær indikator i udviklingen af flere patologier. Fremskridt inden for optisk billeddannelse har gjort intravital mikroskopi (IVM) en praktisk tilgang, der tillader billeddannelse på cellulært og subcellulært niveau i levende dyr ved høj hastighed over tid. Men på trods af vigtigheden af at opretholde tilstrækkelig vævs perfusion, er rumlig og tidsmæssig variation i kapillar strømmen sjældent dokumenteret. I standardmetoden vælges et lille antal kapillar segmenter til billeddannelse over en begrænset periode. For at kvantificere kapillar strømmen på en objektiv måde udviklede vi rumlig tidsmæssig analyse af Fieldwise flow (STAFF), en makro til FIJI open-source billedanalyse software. Ved hjælp af High-Speed billedsekvenser af fulde felter af blodgennemstrømning i kapillærer, personale producerer billeder, der repræsenterer bevægelse over tid kaldet kymographs for hvert tidsinterval for hvert vaskulære segment. Fra kymographs personale beregner hastigheder fra afstanden, at røde blodlegemer bevæger sig over tid, og output hastighed data som en sekvens af farvekodede rumlige kort til visualisering og tabel output for kvantitative analyser. I normale muselever analyserer medarbejderne kvantificerede dybe forskelle i strømningshastigheden mellem nekrose-og Portal-områder inden for lobuler. Endnu mere uventet er forskellene i strømningshastigheden set mellem sinusoider, der er side om side og udsving set inden for individuelle vaskulære segmenter over sekunder. PERSONALE er et kraftfuldt nyt værktøj, der kan give nye indblik ved at muliggøre måling af den komplekse spatiotemporale dynamik i kapillar strømmen.
Introduction
Mikrovaskulaturen spiller en afgørende rolle i fysiologi, der sikrer effektiv perfusion af væv under skiftende forhold. Microvaskulær dysfunktion er forbundet med utallige betingelser, herunder langvarig kardiovaskulær morbiditet og dødelighed, udvikling af demens, og sygdom i både lever og nyrer og dermed er en nøglefaktor for interesse i en bred vifte af biomedicinske undersøgelser1,2,3,4,5. Mens flere teknikker er blevet brugt til at evaluere vævs perfusion, kun intravital mikroskopi muliggør dataindsamling ved den tidsmæssige og rumlige opløsning er nødvendig for at karakterisere blodgennemstrømning på niveauet af individuelle kapillærer.
Microvaskulær flow kan visualiseres i Fluorescens mikroskopi enten ved bevægelse af fluorescerende mikrosfærer eller ved bevægelse af røde blodlegemer på baggrund af membran-Imper-umærkede lysstofrør (f. eks. fluorercently-mærket dextran eller albumin)6,7. Microvaskulær flow kan afbildet i overfladiske cellelag ved hjælp af widefield mikroskopi, eller i dybden ved hjælp af enten Konfokal eller multifoton mikroskopi. Men, kapillar strømningshastigheder er sådan, at passagen af røde blodlegemer generelt ikke kan fanges ved hastigheder mindre end 60 frames/s. Da de fleste Laserscanning konfokale og multiphoton mikroskoper kræver 1-5 s at scanne en fuld billedfelt, denne hastighed kan generelt kun opnås ved at begrænse synsfeltet, nogle gange til en enkelt scanning linje8. Processen med at begrænse målinger til udvalgte kapillar segmenter (1) har potentialet til at indføre selektionsbias og (2) gør det umuligt at indfange rumlige og tidsmæssige heterogenitet i satserne for kapillærblod gennemstrømning. I modsætning hertil kan billeder af kapillar netværk indsamles ved hastigheder over 100 fps ved hjælp af widefield digitale mikroskoper udstyret med videnskabelige komplementære metaloxid halvleder (scmos) kameraer9,10. Disse billige systemer, almindelige i typiske biomedicinske laboratorier gør det muligt at billede microvaskulære flow på tværs af hele todimensionelle netværk, hovedsagelig kontinuerligt. Problemet bliver så en af at finde en analyse tilgang, der er i stand til at udtrække meningsfulde kvantitative data fra de massive og komplekse billeddatasæt genereret af high-speed video mikroskopi.
For at muliggøre analyse af data for fuld felt flow har vi udviklet medarbejdere, nye billedanalyse software, der kontinuerligt kan måle microvaskulær flow i hele mikroskop felter af billedserier indsamlet ved høj hastighed11. Tilgangen er kompatibel med en række forskellige eksperimentelle systemer og billedbehandlings metoder og de ansatte billedanalyse software er implementeret som en makro værktøjsæt til FIJI implementering af ImageJ12. Det underliggende princip, der anvendes her til at visualisere microvaskulære flow er, at første, nogle kontrast skal gives for at kunne billede de røde blodlegemer i kapillærer. I vores undersøgelser, kontrast er tilvejebragt af en bulk fluorescerende sonde, der er udelukket af de røde blodlegemer. Hastigheden af strømmen kan derefter kvantificeres fra forskydningen af de røde blodlegemer, der vises som en negativ plet i fluorescently mærket plasma i billeder indsamlet ved høj hastighed fra et levende dyr8. Vi bruger derefter personale til at gøre observationsområder langs hvert kapillar segment over flere intervaller af tid kaldet kymographs, derefter opdage de skråninger, der findes i kymographs13, og fra disse skråninger beregne satserne for microvaskulære flow. Tilgangen kan anvendes på billeder indsamlet fra enhver kapillær seng, der kan tilgås til Imaging. Her beskriver vi anvendelsen af IVM og personale til undersøgelser af blodgennemstrømningen i leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt og gennemført i henhold til den institutionelle dyrepasning og brug Komité retningslinjer for Indiana University, og overholdt NRC guide til pleje og brug af dyr.
1. kirurgisk forberedelse til Intravital mikroskopi
Bemærk: Det er ikke en overlevelses operation. Når afsnit 1 "kirurgisk forberedelse til intravital mikroskopi" er påbegyndt, kan arbejdet ikke sættes på pause indtil afslutningen af afsnit 2 "Intravital mikroskopi".
- Acclimatize 9 – 10 uger-gamle mandlige C57BL/6 mus, i mindst 4 dage og hurtigt for 16 h før undersøgelser.
- Afvejes dyret, Sedat med 5% isofluran og Placer på en varmepude for at opretholde kropstemperaturen. Brug en oxygen flowhastighed på 1 – 2 L/min og opretholde sedation med 1-2% isofluran. Tjek reflekser ved tå knivspids. Overvåge temperaturen ved hjælp af et rektal termometer. Overvåg puls og respiration visuelt.
- Når anæstesi er stabilt, barberer området for hals placering og området under brystkassen for eksponering af leveren.
-
For hals kanyle, lav en 1 cm venstre ventrale indsnit 1 – 2 cm under musens kæbe. Fjern alt fedt og fascia omkring den jugulære vene. Binde den forreste ende af hals ved hjælp af 06 sutur snor for at forhindre blødning.
- Lav en lille Nick i den jugulære vene og skub kanylen (30 G x 1/2 i, nål), nål holder og polyethylen slange (0,011 x 0,024 inches2 fastgjort til en luer stub adapter og fyldt med 0,9% saltvand) i ca. 1 cm, og fastgør ved den bageste ende af hals ved hjælp af 0-6 sutur snor.
- Ved hjælp af den jugulære kanyle leverer 70 kDa fluorescein dextran (til en dosis på 30 mg/kg via injektion af 0,1 mL af en 9 mg/mL opløsning i saltvand).
- Udsæt leveren for billeddannelse ved at lave et 4 – 6 cm snit på tværs af torso, 1 – 2 cm under midten af ribburet.
- Placer en våd (gennemblødt i 0,9% saltvand) 2 x 2 inches2 gaze svamp under den venstre laterale lever lap. Placer tape på periferien af glasvinduet på en 40 mm dækslip-bundet skål og anvende cyanoacrylat klæbemiddel på båndet. Tryk glaspladen til leveren og ved hjælp af bomuld tippet applikatorer tryk gaze ind i limen på båndet for at minimere væv bevægelse for mikroskopi.
- Flyt dyret til mikroskop stadiet. Tilsæt steril 0,9% saltvand i coverslip-bunden skålen for at holde leveren fugtig i hele billedbehandlings sessionen. Vedligehold temperatur ved 36 – 37 °C via varmepuder monteret på scenen, en varmepude placeret over dyret og en objektiv varmelegeme.
2. intravital mikroskopi
- Udfør intravital mikroskopi på et inverteret epifluorescens mikroskop udstyret med et videokamera, der kan billedoptagelse med høj hastighed.
Bemærk: Her, en xenon Arc lampe, fluorescein-specifikke excitation (480 – 500 nm) og emission (507-543 nm) filtre, plan lægge fluor 20x, N.A. 0,75 vand nedsænkning mål, og en højhastigheds sCMOS kamera blev brugt. - Vælg det område af interesse for kapillar blodgennemstrømning analyse ved hjælp af minimal belysning.
- Indstil eksponeringstid kort nok til kameraet til at kunne erhverve 100 fps. Indstil belysningsniveau til klart at visualisere røde blodlegemer og topologien af Vaskulaturen samtidig undgå fototoksicitet og foto blegning af fluorescerende sonde.
- Saml billeder med en hastighed på 100 fps. Indstil kameraets pixel opløsning mellem ~ 0,65 og ~ 1,3 μm/pixel. Indstil rammestørrelse mellem 512 x 512 og 1024 x 1024 pixels. Indstil bitdybde mellem 8 og 16 bit. Brug den højeste opløsning, rammestørrelse og bitdybde, der stadig tillader 100 fps billedsamling på systemet.
- Gem Time Series fil (er) som en sekvens af TIF-filer eller som Native kamera/Microscope format hvis bio-formater14 i Fiji kan åbne de oprindelige format filer.
- Billede flere områder over tid. Hold musen på mikroskop scenen i op til 2 h. euthanize musen i slutningen af billeddannelse.
Bemærk: Varigheden af tidsserierne vil være baseret på afvejning af behovet for at billedet for et tidsinterval, der favner variabiliteten, men ikke påvirker levedygtigheden af vævet. Varigheden af tidsserierne kan også være dikteret af filstørrelse overvejelser; en 1 min tid serie af 1024 x 1024 pixel 16-bit billeder indsamlet på 100 fps vil generere en fil, der er 12 GB i størrelse. Overvejelser i forbindelse med filstørrelse kan også diktere rammestørrelse og bitdybde brugt. Der er ingen eksplicitte størrelsesbegrænsninger inden for personalet.
3. Definer det vaskulære netværk ved hjælp af TrakEM2 i FIJI
Bemærk: Protokollen kan afbrydes midlertidigt, når du har gemt arbejde på et hvilket som helst tidspunkt i afsnit 3.
- Download og Installer FIJI fra https://imagej.net/Fiji/Downloads.
Bemærk: Version 1.51 n af Fiji blev brugt til dette projekt, og kan downloades fra https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Kommentar at oven på Vinduer, FIJI burde være installeret i den bruger plads og ikke i plan filer. - Åbn filmfil i FIJI ved hjælp af fil > åbne eller bruge fil > importere > billed sekvens. Vælg et enkelt billede fra de stabile billeder mellem respirationer, hvor topologien af det vaskulære netværk er let at se. Vælg billede ≫ duplikere og duplikere det valgte enkelt billede (ikke stakken) og gemme billedet i en ny mappe. Medtag ikke mellemrum i fil-eller mappenavne.
- Konfigurer et nyt tomt TrakEM2-projekt ved at vælge fil > nyt > TrakEM2 (tomt). Vælg den nye mappe, der indeholder det enkelte billede fra filmen som projektmappe. Den TrakEM2 Vinduer vil lukke op.
- Højreklik i hoved arbejdområdet, og vælg importer > Importer billede. Naviger til det enkelt billede, der blev gemt i trin 3,3, og vælg det.
- Højreklik på hoved arbejdområdet igen, og vælg vis ≫ automatisk størrelse lærred/lagsæt . Venstre klik i det primære arbejds vindue. Billedet fylder arbejdsområdet.
- For at vælge de områder i billedet, der indeholder det vaskulære netværk, valg af opsætnings områdeliste i TrakEM2. I det mindre TrakEM2 vindue (skabelon, projekt objekter, lag) Højreklik på "• noget". Vælg Tilføj ny børne > områdeliste.
- I det mindre TrakEM2 vindue skal du trække "Template > Anything" til "Project Objects > Project". Træk derefter "Template > alt > • områdeliste" til "projekt objekter > projekt > noget". Under "projekt objekter > projekt > noget", vil områdelisten nu være til stede.
- I hoved TrakEM2 vinduet under Z Space fanen, en bar mærket områdeliste blev oprettet. Klik for at markere den. I hovedvinduet TrakEM2 skal du også vælge malerpenselværktøjet. Tryk på Shift og rul musehjulet for at vælge en passende størrelse til pensel, f. eks, mindre end diameteren af Vaskulaturen. Du gemmer TrakEM2-opsætningen ved at trykke på CTRL + S- tasterne.
- Mal det vaskulære netværk ved hjælp af malerpenselværktøjet. Hvis du vil slette, skal du holde alt nede, mens du bruger malerpenselværktøjet. Medtag ikke områder, der ikke er i fokus. Gem ofte ved hjælp af Control + S.
- Når mærkningen af det vaskulære netværk er fuldført, skal du højreklikke i hoved TrakEM2 vinduet og vælge eksporter ≫ arealists som etiketter (TIF). I popup-vinduet Vælg Scale 100% og Eksporter alle områdeliste. Luk TrakEM2 Windows, og vælg Ja for Gem projekt.
- Billedet af AreaLists vil åbne og kan fremstå som et tomt sort billede. I de vigtigste FIJI menu Vælg billede > justere > lysstyrke/kontrast. I vinduet B & C skal du trykke på Auto-knappen , hvorefter arealist bliver synlig. I de vigtigste FIJI menu Vælg billede > opslags tavler > inverter lut. Gem dette billede af sorte etiketter på hvid baggrund og luk billedet.
- Åbn filen labels i FIJI. Vælg Plugins > skelet ≫ skeletonize. Gem skeletteret billedet som en TIF. Brug Skeleton. tif-filen som en af de input filer, der skal bruges til at køre personale flow analysen. Når du gemmer filen, skal du undlade at bruge mellemrum i filnavnet.
- Manuelt redigere skelet fil efter behov, ved at placere et hul (ved hjælp af Paint Tool) i stregtegning for eksempel på steder, hvor grene i Vaskulaturen ikke er blevet fanget, fordi de går ud af billedet flyet.
4. Forbered film sekvensen til personale analyse
- Åbn filmfil i FIJI ved hjælp af fil > åbne eller fil > importere > billedsekvens. Vælg en tidsperiode for billedsekvensen til flow analyse (kan være sekunder til minutter, hundreder til titusinder af frames), hvor vævs positionen er forblevet stabil over tid, bortset fra under respiration.
- Vælg billede ≫ duplikere og duplikere den valgte del af sekvensen ved at indtaste numrene på start-og slutrammerne. Kontroller billedets rumlige og tidsmæssige kalibrering under billede > Egenskaber og korriger om nødvendigt. Gem billedfilen som en TIF (eller som en ukomprimeret AVI). Denne Movie. tif er nødvendig som en input-fil til at køre personale analyse. Medtag ikke mellemrum i filnavnet.
5. Installer personale makroer i FIJI
Bemærk: (vigtigt) flere mapper i Fiji mappe undermapper har lignende filnavne, nogle kapitaliseret, nogle ikke. Vær sikker på, at de rigtige mapper er valgt, når du installerer personale.
- Hent STAFF-makroerne fra https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
-
Hvis du vil installere, skal du først åbne mappen FIJI.
- Oven på Vinduer hitte den omslag der hvor FIJI er installeret i den bruger plads, oftest oven på den desktop. På MacOS finde FIJI ikonet i mappen programmer, højreklik og vælg åben.
- Åbn mappen plugins i mappen FIJI. Åbn mappen makroer i mappen plugins. Kopiér STAFF. IJM til denne mappe med makroer: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
- Åbn mappen plugins i mappen FIJI. Afskrift STAFF_Dir. jar i indeværende plugins omslag: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. jar.
- Åbn mappen makroer i mappen FIJI. Åbn mappen AutoRun i denne mappe med makroer. Afskrift STAFF_Loader. IJM i indeværende AutoRun omslag: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader. IJM.
- Start FIJI og bekræft makro installation. For at verificere installationen skal du vælge Plugins > makroer. Når den er installeret korrekt, vil rullemenuen indeholde: Åbn-Opret projekt, Analysér skelet, Rediger tidsintervaller, Analysér flow og Fremstil rumlig kort.
- Hvis disse kommandoer ikke findes i menuen makroer, skal du vælge Plugins > makroer > installere, åbne mappen FIJI\PLUGINS\MACROS, vælge staff. IJM-filen og derefter klikke på knappen OK . Kommandoerne skal nu vises i menuen Plugins > makroer .
6. kvantificering af det vaskulære flow ved hjælp af personale
- Opret et nyt projekt.
- Vælg Plugins > makroer ≫ Åbn-Opret projekt , og følg prompter for at oprette eller opdatere en konfigurationsfil.
- Fra Åbn-Opret projekt menuen, Naviger til og vælg projektmappe, input fil mappe og input files Movie. tif og Skeleton. tif. Rediger de automatisk udfyldte output filnavne, hvis det er nødvendigt.
- Input værdier for korteste segment længde (20 μm), max hastighed målt (2.000 μm/s) og max hastighed kortlagt (1.000 μm/s).
Bemærk: Produktet af korteste segment længde og rammer pr. sekund giver den maksimale strømningshastighed, der teoretisk set kan måles. De højeste kapillar strømningshastigheder, der rapporteres i litteraturen, er omkring 2.000 μm/s15. I leveren observerede vi, at kapillar strømningshastigheder generelt var i gennemsnit omkring 300 μm/s og sjældent overskredet 1.000 μm/s. - Indtast værdierne for pixelstørrelse og frame rate for billedsekvensen (fra billedmetadata eller eksperimentelle noter). Disse værdier kræver brugerinput. Markér afkrydsningsfeltet flimmer korrektion , hvis billederne har flimmer med periodisk baggrunds intensitet.
- Vælg parametre for den bedste visualisering af dataene. Vælg maksimal hastighed, der er tilknyttet, for at inkludere ca. 95% af dataene, så dataene tilknyttes hele spektret af farve skalaen. MEDARBEJDERNE knytter høje hastigheds afvigelser til den høje hastighed ved farve skalaen.
- Analysér skelettet.
- Vælg Plugins > makroer > Analysér skelet. Skelettet. tif-filen åbnes, og den region af interesse (ROI) Manager vil åbne og køre.
Bemærk: Analysér skelet klassificerer hver pixel med sit antal naboer som enten ved et slutpunkt, ved et kryds eller inden for et segment. For hvert segment registreres et identifikationsnummer (ID-nummer), en kalibreret forgrenings længde og de rumlige koordinater for forgrenings enderne. - Vent, til segment-id'er vises på skelettet, segment listen skal vises i ROI Manager, og en popup, der indikerer, at ROI Manager fil for skelettet er gemt. Klik på OK.
- Kontroller, at skelettet mellem respiration bevægelser forbliver over, hvor røde blodlegemer passerer gennem kapillær (f. eks, ikke kanten og ikke uden for kapillar). Få vist de mærkede segmenter som en overlejring på filmen ved at åbne filmfilen og derefter trække ROI-zip-filen til den åbne film. Afspil filmen med segmenterne lagt over.
- Vælg Plugins > makroer > Analysér skelet. Skelettet. tif-filen åbnes, og den region af interesse (ROI) Manager vil åbne og køre.
- Vælg tidsintervaller.
- Vælg Plugins > makroer > Vælg tidsintervaller . Vent, mens makroen genererer en kymograph fra et enkelt segment over den samlede tid for filmen. Fra denne kymograph vælger brugeren tidsintervaller til analyse. Brug CTRL + + tasterne til at forøge størrelsen på kymograph, hvis det er nødvendigt.
- Rektangel markeringsværktøjet aktiveres automatisk. Tegn et rektangel omkring hvert tidsinterval. Et godt udgangspunkt for tidsinterval længden er intervallet 1 – 2 s mellem respirationer, som er synlige som horisontale, slørede områder i kymografen.
- Klik på tasten T eller knappen Tilføj i ROI Manager for at registrere valg af tidsintervaller. Gentag for så mange tidsintervaller som ønsket. Foretag valg sekventielt fra toppen (eller venstre) til bunden (eller til højre) af kymograph.
- Evaluer parametervalg (fra Åbn-Opret projekt) ved at vælge et lille antal tidsintervaller (3 til 4) og fuldføre analyse for netop disse intervaller, da Analysér flow (det næste trin) kan tage timer for store datasæt.
- Klik på OK i vinduet Foretag et investeringsafkast for hvert tidsinterval, når du er færdig. Der vises et popup-vindue, når de valgte intervaller er gemt i projektmappen. Klik på OK.
- Analysér flow.
- Vælg Plugins > makroer > Analysér flow , og dialogboksen Analysér flow parametre åbnes og viser de værdier, der er indtastet i trinnet Åbn projektoprettelse. Rediger, hvis det er nødvendigt, og klik derefter på OK.
- Dialogboksen output filnavne åbnes og viser de navne, der er indtastet i trinnet Åbn-Opret projekt. Rediger, hvis det er nødvendigt, og klik derefter på OK.
- Der åbnes en dialogboks, hvor du bliver spurgt, om brugeren er klar til at begynde analysen. Klik på OK , hvorefter analysen begynder. Vent på en dialogboks, der åbnes for at angive, hvornår flow analysen er fuldført.
Bemærk: Den nødvendige tid afhænger af processorens hastighed og størrelsen af datasættet. - Bekræft, at resultatfilerne er gemt som. csv-format regnearksfiler i projektmappen.
Bemærk: Output filer omfatter: segment_velocities. csv indeholder hastighedsværdier, som har positive og negative værdier, der angiver flowretningen. Celler, der repræsenterer segmenter, der er mindre end minimumlængden, indeholder teksten kort. Celler med hastighedsværdier større end den maksimale målte hastighed indeholder teksten ud (for outlier). kym_ang. csv indeholder kymograph-vinkler, målt ved plugin for directionalitet i Fiji. good_fit. csv indeholder godhed af pasform af en kurve til fordelingen af vinkler målt fra hver kymograph. Dårlig godhed af pasform (< 0,8) kan indikere skjulte forgrenings punkter i et segment, ændring i hastighed i løbet af tidsintervallet, lampe eller værelse lys flimmer. - Kontroller, at segment_velocities. csv indeholder få ud-værdier. Hvis der er et stort antal OUT-værdier, skal du kontrollere, at minimum segment længden for at analysere ikke er mindre end 15 – 20 μm, og derefter køre Analysér flowigen. Hvis den nye segment_velocities. csv stadig indeholder en stor del af ud-værdierne, skal du markere feltet flimmer korrektion og derefter køre Analysér flowigen.
- Producere rumlige kort.
- Vælg Plugins > makroer > producere rumlig kort , og vinduet afstands parametre åbnes, og viser de værdier, der er indtastet i trinnet Åbn-Opret projekt. Rediger, hvis det er nødvendigt, eller Fortsæt med at vælge OK.
- Watch som en tidsmæssig sekvens af rumlige kort over strømningshastigheder genereres med farve indikerer flowhastighed. Outputtet er i form af en. tif-billedstak med ét billede for hvert tidsinterval. Rul gennem. tif-stakken for at visualisere rumlig og tidsmæssig variation i flow. Gem stakken som en AVI-fil (ukomprimeret for maksimal bærbarhed) for at dele som en film.
7. kvantitativ analyse ved hjælp af personale output
- Åbn filen segment_velocities. csv i et regneark eller et statistisk analyseprogram. Disse værdier har et positivt eller negativt tegn, der angiver retningen af flowet i forhold til start-/stoppunkterne for det pågældende segment (registreret i ROI-filen for segmentet).
- Lav en ny regnearks side, der indeholder de absolutte værdier for alle hastighedsværdier. Brug disse værdier til at beregne den samlede gennemsnitlige strømningshastighed, gennemsnitlig strømningshastighed for alle vaskulære segmenter over tid, strømningshastigheden for hvert vaskulære segment over tid, og lav histogrammer af hastigheds fordelinger.
- Beregn værdier omkring specifikke morfologiske regioner eller andre områder af interesse ved først at finde de specifikke relevante segmenter i det mærkede skelet og derefter udføre analyser på disse udvalgte segmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PERSONALE analyse genererer en komplet optælling af microvaskulære hastigheder på tværs af hele mikroskop felter over perioder, der strækker sig fra sekunder til minutter. Repræsentative resultater vises i figur 1, figur 2, figur 3og figur 4. Figur 1 viser et eksempel på en tidsserie af microvaskulære netværk i leveren af en mus, generation af skeletteret billede, der bruges til at definere aksen af microvaskulære flow, og det personale-genereret kort over individuelle vaskulære segmenter identificeret til kvantificering. Personalet bruger derefter skeletteret billede til at bryde det microvaskulære netværk ned i individuelle segmenter, derefter genererer billeder af kymografer for hvert segment. Disse billeder leveres til brugeren sammen med værktøjer til at identificere de tidsintervaller, der skal bruges til kymograph-analyse (figur 2). Personalet bruger derefter skelettet, og de bruger-leverede tidsintervaller til at bryde kymograph af hvert segment i individuelle segment-tidsintervaller. Personalet identificerer derefter den dominerende vinkel i kymograph fra hvert segment-tidsinterval og giver hastighedsmålinger som. csv-datafiler (figur 3) og i form af stakke af farvekodede hastigheds kort billeder (figur 4). For at understøtte udforskning af dataanalyse pipelinen leverer medarbejderne også. csv-filer, der indeholder alle kymograph-vinkel målinger og godhed-af-fit-værdier.
Figur 1: generering af det vaskulære skelet. (A) originalt billede af en enkelt ramme fra tidsserie billeder indsamlet fra leveren af en levende mus. Scale bar = 100 μm. (B) billede vist i panel A med centrale vener (CV) og Portal triader (PT) angivet, at identificere de vigtigste retninger af output flow. (C) billede fra panel A med overlay af TrakEM2 segmentering af sinusoids. (D) binært billede af TrakEM2 segmentering. (E) skeletonisering af TrakEM2 segmentering. F) personale output billede af individuelle vaskulære segmenter med etiketter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kymograph-analyse. A) forstørret billede af vaskulære segmenter,derer vist i figur 1f. B) typisk kymografi fra et segment, som er indsamlet over to tids intervaller mellem luftvejene. Perioder med respiration er noteret med pile. C) kymografer for segmenter 240, 252 og 254 fra panel A. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af hastighedsdata. (A, B) Tabeller med hastighedsmålinger af fire segmenter over 19 tidsintervaller udtrykkes enten som hastighed med retning (A) eller som absolut hastighed (B). (C) histogram, der viser fordelingen af absolutte hastighedsværdier på tværs af hele feltet over hele 20 s tidsperiode. D) graf over hastigheden af de tre segmenter, hvis kymografer er vist i figur 2c i løbet af hele 20 s-perioden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: hastighed kort. (A) udgangs billede af det farvekodede hastigheds kort for et enkelt tidsinterval for det felt, der er vist i figur 1. (B) sammensat af hastigheds kort for alle tidsintervaller præsenteret som en 3D-volumen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin i denne protokol. Første, minimering af bevægelse under intravital billeddannelse af leveren er afgørende for at generere film, der er brugbare til kapillar flow analyse ved hjælp af personale. På grund af nærhed af membranen, korte perioder af respiration-induceret bevægelse opstår, med den sikrede leveren vender tilbage til sin oprindelige position efter hver åndedræt. Sikring af kirurgisk eksponeret lever mod coverslip-bunden skålen ved hjælp af gaze, derefter billeddannelse nedefra ved hjælp af en inverteret mikroskop tjener til at imortere organet mellem respirationer16,17,18,19. For det andet, en billed erhvervelse hastighed på 100 fps anbefales kraftigt, fordi hastigheden af strømmen, der kan måles, er en funktion af hastigheden af billedet erhvervelse og den mindste længde af de segmenter, hvor strømmen måles11. For det tredje, at producere en høj kvalitet skelet, linje tegning repræsentation af det vaskulære netværk, er det næste kritiske skridt i at opnå kapillar flow hastigheder ved hjælp af personale. Skelet linjesegmenter skal ligge nær midtpunktet af Vaskulaturen mellem respirationer over det tidsforløb, der analyseres, og vaskulære forgreninger ud af billedplanet skal identificeres. Placeringen af disse skjulte grene langs et vaskulære segment kan udledes ved at se filmen, ved at undersøge kymograph eller undersøge hastighedsværdierne over tid for dette segment. Visning af filmen, disse vaskulære segmenter ses enten som havende tovejs flow, stammer væk fra eller konvergerende mod placeringen af den usynlige gren, eller som havende en brat ændring i strømningshastigheden på dette tidspunkt langs det vaskulære segment. Placeringen af skjulte forgrenings punkter kan identificeres i kymografer som placeringen af en ændring i vinklen, der produceres af ændringen i strømningsretningen eller hastigheden. I regnearket kan vaskulære segmenter med skjulte forgrenings placeringer ændre retningen (tegn) eller ændre mellem værdierne i de to medvirkende segmenter. Hvis tidsserien indeholder for mange forgrenings punkter, der er ude af billedplanet, skal personale analysen gentages efter manuel redigering af skelettet ved at placere et hul (ved hjælp af maler værktøjet) i stregtegningen på placeringen af de mistede forgrenings punkter.
Vi afslørede et fælles problem i billed erhvervelse, der typisk går ubemærket hen, men havde en stærk effekt på måling af strømningshastigheder ved hjælp af personale. I billed erhvervelse, ustabilitet eller "flimmer" i intensiteten af EPI-belysning lampe lyskilde eller fra områdebelysning i mikroskopet rum kan forekomme. Fra begge kilder, lys/mørk banding over tid med perioden af flimren sker ved nulvinkel i kymografer. Hvis nulvinklen peak er den største top, så selv om vinklen produceret af bevægelse af røde blodlegemer gennemfart øjet, hvor strømningshastigheden måles, er indlysende for det menneskelige øje, den directionalitet plugin passer en kurve til nulpunktet peak og rapporterer en værdi meget nær nul grader, hvilket resulterer i hastighedsmålinger, der er urealistisk høj. Selv hvis nulvinklen peak ikke er den største top, vil det påvirke direktionalitet kurve passer sådan, at hastigheden rapporteret er forskudt mod en højere værdi. For at løse dette problem, giver personalet en "flimren korrektion" indstilling, der ignorerer spids vinkler forekommer ved 0 °. Denne ændring elimineret virkningerne af lampe flimmer uden at påvirke hastighed kvantifikationer.
Den væsentligste begrænsning af opnåelse af strømningshastigheder ved hjælp af widefield-mikroskopi er, at billed erhvervelse er begrænset til tynde præparater, såsom mesenterisk vaskulatur, eller Zebra intersegmental-beholdere eller de overfladiske lag af organer såsom lever eller nyre, der kan være ekstruderet.
En betydelig fordel ved at bruge personale i forhold til eksisterende metoder for flow kvantificering er, at det giver mulighed for hurtig og upartisk påvisning af rumlige og tidsmæssige mønstre af vaskulære flow. Indsamling og analyse af mikrovaskulære flow data ved hjælp af raster scanning systemer er generelt begrænset til målinger af enkelt bruger udvalgte kapillærer på et tidspunkt20,21,22,23. Der findes metoder til at udtrække strømningshastigheder på tværs af felter24,25,26, men ingen af disse tilgange understøtter analyse på tværs af hele felter, og alle er arbejdskraftintensive. Brug af personale, analyse af hvert kapillar segment over tid på tværs af hele billedet felt af et datasæt med titusinder af billeder kan opnås inden for en dag. Manuel analyse af selv et enkelt datasæt af fuld felt vaskulære flow ville tage måneder til år. Således, manuel analyse er upraktisk selv for karakterisering af normale flow og klart ikke tillader sammenligning af flere behandlingsgrupper.
Den lethed af personalet kvantificering af spatiotemporale mønster af vaskulære flow giver mulighed for fremtidige brugere til at forbinde vaskulære morfologiske observationer til effekter på kapillar flowhastighed mønster. Ved at definere forholdet mellem de vaskulære morfologiske målinger af fartøjs diametre og netværkstopologien til strømnings hastigheds mønstret kan vi så kunne forudsige strømningsmønstre fra vaskulær morfologi. Tilsvarende, korrelation vaskulære flow mønster og vaskulær morfologi med hændelser såsom timing, lokalisering og omfanget af immuncelle infiltration, vævsskader fra toksisk eksponering eller sygdom, eller status af intracellulær transport, ville ikke kun give os en bedre forståelse af flow mønstret og cellulær funktion i sundhed og sygdom, men ville også give en ramme for at identificere særligt skadelige patofysiologiske scenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Undersøgelser præsenteret her blev støttet af finansiering fra National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 og NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital mikroskopi undersøgelser blev udført på Indiana Center for biologisk mikroskopi. Vi takker Dr. Malgorzata Kamocka for teknisk assistance med mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
