Summary
为了量化高速毛细管流图像序列中的微血管流,我们开发了STAFF(场流空间时间分析)软件。在整个图像字段和时间上,STAFF 评估流速并生成一系列颜色编码的空间地图,用于可视化和表格输出,以便进行定量分析。
Abstract
血流速度和分布的变化对于维持组织和器官灌注以响应不同的细胞需求至关重要。此外,微循环缺陷的出现可能是多种疾病发展的主要指标。光学成像技术的进步使生命内显微镜(IVM)成为一种实用的方法,允许在细胞和亚细胞水平上对活的动物进行高速成像。然而,尽管保持足够的组织灌注的重要性,毛细管流动的空间和时间变异性很少被记录。在标准方法中,在有限的时间内选择少量毛细管段进行成像。为了以无偏的方式全面量化毛细管流,我们开发了基于场流的空间时态分析 (STAFF),这是 FIJI 开源图像分析软件的宏。STAFF 使用毛细血管内满场血流的高速图像序列,生成表示每个血管段每个时间间隔的称为 kymograph 的随时间运动的图像。STAFF 从 kymograph 计算红血球随时间移动的距离的速度,并将速度数据输出为一系列颜色编码的空间地图,用于可视化和表格输出,用于定量分析。在正常小鼠肝脏中,STAFF 分析定量了球状内近中心区域和近层区域之间的流动速度的深刻变化。更出乎意料的是,并排的正弦和数秒内在单个血管段内出现的波动之间,在流速上出现的差异。STAFF 是一种功能强大的新工具,能够通过测量毛细管流的复杂时空动力学来提供新颖的见解。
Introduction
微血管在生理学中起着至关重要的作用,确保在不断变化的条件下组织的有效灌注。微血管功能障碍与多种疾病有关,包括长期心血管发病率和死亡率、痴呆症的发展以及肝肾疾病,因此是生物医学调查1、2、3、4、5中关注的关键因素。虽然已使用多种技术来评估组织灌注,但只有生命内显微镜能够以必要的时间和空间分辨率收集数据,以表征单个毛细血管级别的血流。
微血管流可以通过荧光微球的运动或在膜内荧光标记(例如荧光标记的dextran或白蛋白)6、7的背景下红血球的运动在荧光显微镜中可视化。微血管流可以使用宽场显微镜在表面细胞层中成像,也可以使用共聚焦或多光子显微镜在深度成像。然而,毛细管流速使红血球的通过一般不能以低于60帧/秒的速度捕获。由于大多数激光扫描共聚焦和多光子显微镜需要1~5s扫描完整图像场,这种速度通常只能通过限制视场来实现,有时只能限制一个扫描线8。将测量限制在选定的毛细管段 (1) 的过程可能会引入选择偏差,(2) 使得无法捕获毛细管血流速率的空间和时间异质性。相比之下,毛细管网络的图像可以收集超过100fps的速度使用广域数字显微镜配备科学互补金属氧化物半导体(sCMOS)相机9,10。这些廉价的系统,在典型的生物医学实验室中很常见,使得在整个二维网络中成像微血管流成为可能,基本上都是连续的。问题就变成了找到一种分析方法,该方法能够从高速视频显微镜生成的大量复杂图像数据中提取有意义的定量数据。
为了能够分析全场流数据,我们开发了STAFF,新的图像分析软件,可以连续测量整个显微镜领域的微血管流量,以高速收集图像系列11。该方法与各种不同的实验系统和成像模式兼容,STAFF图像分析软件作为FIJI实现ImageJ12的宏观工具集而实现。这里用来可视化微血管流动的基本原理是,首先,必须提供一些对比度才能成像毛细血管内的红血球。在我们的研究中,对比是由红血球排除的散装荧光探针提供的。然后,流速可以从红血球的位移中量化,红血球在荧光标记的血浆中显示为负斑,图像从活的动物8高速收集。然后,我们使用STAFF在称为kymograph的多个时间间隔内沿每个毛细管段绘制距离图,然后检测Kymograph13中存在的斜坡,并从这些斜坡上计算微血管流速。该方法可应用于从任何毛细管床上采集的图像,这些图像可用于成像。在这里,我们描述了IVM和STAFF在肝脏血流研究中的应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验均根据印第安纳大学机构动物护理和使用委员会准则获得批准和进行,并遵守 NRC 关于动物护理和使用指南。
1. 术中显微镜的外科准备
注:这不是生存手术一旦第1节"生命内显微镜的外科准备"开始,工作不能暂停,直到第2节"生命内显微镜"完成。
- 在研究前,使9-10周大的雄性C57BL/6小鼠至少4天,禁食16小时。
- 称量动物,用5%的异苯可勒,放在加热垫上以保持体温。使用 1⁄2 L/min 的氧气流速,并使用 1-2% 的非氧保持镇流。通过脚趾捏检查反射。使用直肠温度计监测温度。目视监测心率和呼吸。
- 当麻醉稳定时,为排卵管放置区域和肋骨笼下方区域进行骨节放置,以暴露肝脏。
-
对于壶颈切口,在小鼠下颚下方 1⁄2 厘米的左心室切口。清除周围血管周围的脂肪和筋膜。使用 06 缝合线将壶的前端系上,以防止出血。
- 在壶脉中做一个小刻痕,用约 1 厘米的速度滑动管(30 G x 1/2 英寸)、针头支架和聚乙烯管(0.011 x 0.024 英寸2连接到 Luer 存根适配器上,并填充 0.9% 盐水),并使用 0-6 缝合串固定在管的后端。
- 使用环状管提供70 kDa荧光素dextran(剂量30mg/kg,通过注射0.1 mL的9mg/mL溶液在盐水中)。
- 通过在肋骨中央下方 1⁄2 厘米的躯干上切开 4⁄6 厘米切口,露出肝脏进行成像。
- 将湿(浸泡在 0.9% 盐水中)2 x 2 英寸2纱布海绵放在左侧侧侧肝叶下方。将胶带放在 40 mm 盖板底盘的玻璃窗外围,并在胶带上涂抹氰丙烯酸酯粘合剂。将玻璃板压到肝脏上,并使用棉质贴片将纱布压入胶带上的胶水,以尽量减少显微镜的组织运动。
- 将动物移到显微镜阶段。将无菌的0.9%盐水加入盖玻底盘中,在整个成像过程中保持肝脏湿润。通过安装在舞台上的加热垫、放置在动物身上的加热垫和客观加热器,将温度保持在 36°37 °C。
2. 术中显微镜
- 在配有能够高速图像捕获的摄像机的倒置表荧光显微镜上执行生命内显微镜。
注:这里使用了 Xenon 电弧灯、荧光素特异性激励 (480–500 nm) 和发射 (507–543 nm) 滤光片、计划荧光 20x、N.A. 0.75 水浸物和高速 sCMOS 摄像机。 - 使用最少的照明选择毛细管血流分析的感兴趣区域。
- 将曝光时间设置为足够短,以便摄像机能够获取 100 fps。设置照明级别,以清晰显示红血球阴影和血管拓扑,同时避免荧光探针的光毒性和光漂白。
- 以 100 fps 的速度收集图像。将相机像素分辨率设置为 ±0.65 和 ±1.3 μm/像素。将帧大小设置为 512 x 512 和 1024 x 1024 像素之间。将位深度设置为 8 位和 16 位之间。使用最高分辨率、帧大小和位深度,仍允许在系统上收集 100 fps 图像。
- 如果 FIJI 中的 BioFormat14可以打开本机格式文件,则保存时间序列文件作为 TIF 文件的序列或本机相机/显微镜格式。
- 随时间显示多个区域。将鼠标保持在显微镜台上长达 2 小时。在成像结束时使小鼠安乐死。
注:时间序列的持续时间将基于平衡对图像的需求,以包含可变性的时间间隔,同时不影响组织的可行性。时间序列的持续时间也可能由文件大小注意事项决定;以 100 fps 速度收集的 1024 x 1024 像素 16 位图像的 1 分钟时间序列将生成大小为 12 GB 的文件。文件大小注意事项也可能决定所使用的帧大小和位深度。STAFF 中没有明确的大小限制。
3. 在 FIJI 中使用 TrakEM2 定义血管网络
注:在第 3 节中的任何点保存工作后,可以暂停该协议。
- 从https://imagej.net/Fiji/Downloads下载并安装 FIJI。
注:斐济的1.51n版本用于这个项目,可以从https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip下载。请注意,在 Windows 上,FIJI 应安装在用户空间中,而不是程序文件中。 - 使用文件>打开或使用文件>导入> 图像序列在 FIJI 中打开影片文件。从呼吸之间的稳定图像中选择单个图像,其中血管网络的拓扑易于查看。选择图像>复制和复制选定的单个图像(而不是堆栈),并将图像保存到新文件夹中。请勿在文件或文件夹名称中包含空格。
- 通过选择"文件>新建> TrakEM2"(空白)来设置新的空白 TrakEM2 项目。选择包含影片中单个图像的新文件夹作为项目文件夹。TrakEM2 窗口将打开。
- 在主工作区右键单击并选择"导入>导入图像"。导航到步骤 3.3 中保存的单个图像并选择它。
- 再次在主工作区右键单击,然后选择"显示>自动调整画布/图层集"。在主工作窗口中左键单击。图像将填充工作区。
- 要选择图像中包含血管网络的区域,请在 TrakEM2 中设置区域列表选择。在较小的 TrakEM2 窗口中(模板、项目对象、图层)右键单击"+ 任何"。选择添加新子项 >区域列表。
- 在较小的 TrakEM2 窗口中,将"模板>任何"拖到"项目对象>项目"上。然后拖动"模板>任何> = 区域列表"到"项目对象 > 项目 > 任何"。在"项目对象 > 项目>任何"下,现在将存在" 区域列表"。
- 在Z 空间选项卡下的主 TrakEM2 窗口中,创建了一个标记为区域列表的条形列表。单击以将其选中。在主 TrakEM2 窗口中也选择画笔工具。按下Shift并滚动鼠标滚轮,为画笔选择适当尺寸,例如,小于血管直径。要保存 TrakEM2 设置,请按"控制 + S"键。
- 使用画笔工具绘制血管网络。使用画笔工具时,要擦除按住Alt。不包括焦点外区域。经常使用控制+ S保存 。
- 完成血管网络标签后,右键单击主 TrakEM2 窗口中,然后选择"导出>区域列表"作为标签(tif)。在弹出窗口中选择"缩放 100%"和"导出所有区域"列表。关闭 TrakEM2 窗口,并为"保存"项目选择"是"。
- "区域列表"的图像将打开,并可能显示为空白黑色图像。在主 FIJI 菜单中选择"图像>调整>亮度/对比度"。在 B&C 窗口中,按下自动按钮,区域列表将变为可见。在主 FIJI 菜单中,选择"图像>查找表>反转 LUT"。将此黑色标签的图像保存在白色背景上并关闭图像。
- 在 FIJI 中打开标签文件。选择插件>骷髅>骨架。将骨架化图像另存为 tif。使用骨架.tif 文件作为运行 STAFF 流分析所需的输入文件之一。保存文件时,不要在文件名中使用空格。
- 根据需要手动编辑骨架文件,在线条图中放置间隙(使用绘制工具),例如在血管中的分支由于离开图像平面而未捕获的位置。
4. 准备电影序列,以便进行工作人员分析
- 使用"打开"或"文件">导入 >图像序列在 FIJI 中打开影片文件。选择图像序列的时间段进行流量分析(可以是秒到分钟,数百到数万帧),其中组织位置随时间保持稳定,呼吸期间除外。
- 通过键入开始帧和结束帧的编号,选择图像>复制和复制序列的选定部分。在图像>属性下检查图像空间和时间校准,并在必要时更正。将图像文件另存为 TIF(或未压缩的 AVI)。此影片.tif 需要作为输入文件来运行 STAFF 分析。文件名中不要包含空格。
5. 将 STAFF 宏安装到 FIJI
注: (重要) FIJI 文件夹子目录中的多个文件夹都有类似的文件名,有些大写,有些没有。在安装 STAFF 时,请务必选择正确的文件夹。
- 从https://github.com/icbm-iupui/STAFF下载 STAFF 宏。
-
要安装,请首先打开 FIJI 文件夹。
- 在 Windows 上查找在用户空间中安装 FIJI 的文件夹,最常见的是在桌面上。在 MacOS 上,在"应用程序"文件夹中找到 FIJI 图标,右键单击并选择"打开"。
- 在 FIJI 文件夹中,打开插件文件夹。在插件文件夹中,打开宏文件夹。将 STAFF.ijm 复制到此宏文件夹:斐济_插件_宏/MACROs_STAFF.ijm。
- 在 FIJI 文件夹中,打开插件文件夹。将STAFF_Dir.jar 复制到此插件文件夹:斐济_插件_STAFF_Dir.jar。
- 在 FIJI 文件夹中,打开宏文件夹。在此宏文件夹中,打开"自动运行"文件夹。将STAFF_Loader.ijm 复制到此自动运行文件夹:斐济_宏_自动运行_STAFF_Loader.ijm。
- 启动 FIJI 并验证宏安装。要验证安装,请选择插件>宏。正确安装后,下拉菜单将包括:开放式创建项目、分析骨架、编辑时间间隔、分析流和生成空间地图。
- 如果这些命令在宏菜单中不存在,请选择插件>宏> 宏 >安装,打开斐济\插件\宏文件夹,选择 STAFF.ijm 文件,然后单击"确定"按钮。命令现在应出现在插件>宏菜单中。
6. 使用 STAFF 量化血管流量
- 创建新项目。
- 选择插件>宏>打开-创建项目,然后按照提示创建或更新配置文件。
- 从"打开-创建项目"菜单中,导航到并选择"项目目录"、"输入文件夹"和"输入文件"影片.tif 和 Skeleton.tif。如有必要,编辑自动填充的输出文件名。
- 最短分段长度(20 μm)、测量的最大速度(2,000 μm/s)和映射的最大速度(1,000 μm/s)的输入值。
注:最短段长和每秒帧的积具有理论上可以测量的最大流速。文献中报告的最高毛细管流速约为2000μm/s15。在肝脏中,我们观察到毛细管流速一般在300μm/s左右,很少超过1000μm/s。 - 键入图像序列的像素大小和帧速率值(从图像元数据或实验注释)。这些值需要用户输入。如果图像具有周期性的背景强度闪烁,请选中"闪烁校正"框。
- 选择参数以最佳可视化数据。选择映射的最大速度以包含大约 95% 的数据,以便数据在整个色阶范围内映射。STAFF 将高速异常值映射到色阶的高速端。
- 分析骨架。
- 选择插件>宏>分析骨架。骨架.tif 文件将打开,感兴趣区域 (ROI) 管理器将打开并运行。
注:分析骨架按相邻像素数将每个像素分类为在端点、交汇点或线段内。对于每个段,将记录一个标识号(ID 号)、一个经过校准的分支长度和分支末端的空间坐标。 - 等待段 ID 显示在骨架上,段列表显示在 ROI 管理器中,并弹出一个弹出窗口,指示骨架的 ROI 管理器文件已保存。单击"确定"。
- 验证在呼吸运动之间,骨骼仍然停留在红血球通过毛细管的位置(例如,不是边缘,而不是毛细管外)。通过打开影片文件,然后将 ROI zip 文件拖动到打开的影片上,将标记的线段显示为影片上的叠加。播放覆盖的片段影片。
- 选择插件>宏>分析骨架。骨架.tif 文件将打开,感兴趣区域 (ROI) 管理器将打开并运行。
- 选择时间间隔。
- 选择插件>宏>选择时间间隔。等待宏从单个片段生成影片总时间的图形。通过此图形,用户选择时间间隔进行分析。如果需要,请使用控制 + +键来增加图形的大小。
- 矩形选择工具将自动激活。在每个时间间隔周围绘制一个矩形。时间间隔长度的一个好起点是呼吸之间的 1⁄2 s 间隔,在 kymograph 中,这些间隔明显为水平模糊区域。
- 单击 ROI 管理器中的T键或"添加"按钮以记录时间间隔选择。根据需要重复一些时间间隔。从图形仪的顶部(或左侧)到底部(或右侧)按顺序进行选择。
- 通过选择少量的时间间隔(3 到 4)并仅完成这些间隔的分析来评估参数选择(从 Open-Create Project 中),因为分析流(下一步)对于大型数据集可能需要数小时。
- 完成后,单击"为每个时间间隔窗口创建 ROI"。"将所选间隔保存在"项目文件夹"中时,将显示一个弹出窗口。单击"确定"。
- 分析流。
- 选择插件>宏>分析流和分析流参数对话框将打开并显示在"打开-创建项目"步骤中输入的值。如果需要编辑,然后单击"确定"。
- 将打开"输出文件名"对话框并显示在"打开-创建项目"步骤中输入的名称。如果需要编辑,然后单击"确定"。
- 将打开一个对话框,询问用户是否已准备好开始分析。单击"确定",分析将开始。等待打开的对话框,指示流分析何时完成。
注:所需时间取决于处理器速度和数据集大小。 - 确认结果文件已作为 .csv 格式电子表格文件存储在项目文件夹中。
注:输出文件包括:segment_velocities.csv包含速度值,这些速度值具有指示流动方向的正负值和负值。表示段小于最小长度的单元格包含文本 SHORT。速度值大于最大测量速度的单元格包含文本 OUT(对于异常值)。kym_ang.csv包含由 FIJI 中的方向性插件测量的图形角度。good_fit.csv包含曲线拟合的优度与从每个图形测量的角度分布。拟合度差(< 0.8)可以指示段中的隐藏分支点、时间间隔内速度的变化、灯或房间光闪烁。 - 检查以验证segment_velocities.csv 是否包含很少的 OUT 值。如果存在大量 OUT 值,请验证要分析的最小段长度不小于 15~20 μm,然后重新运行分析流。如果新segment_velocities.csv 仍包含很大比例的 OUT 值,则选中闪烁校正框,然后重新运行分析流。
- 生成空间地图。
- 选择插件>宏>生成空间地图和空间地图参数窗口将打开,显示在打开-创建项目步骤中输入的值。如果需要编辑,或继续选择"确定"。
- 观察流速度的空间地图的时间序列,使用颜色指示流速。输出的形式为 .tif 图像堆栈,每个时间间隔有一个图像。滚动浏览 .tif 堆栈,以可视化流量的空间和时间变化。将堆栈另存为 AVI 文件(未压缩以实现最大可移植性),以作为影片共享。
7. 使用工作人员产出进行定量分析
- 在电子表格或统计分析程序中打开segment_velocities.csv 文件。这些值具有正或负表示数,指示相对于该段的开始/停止点(记录在段 ROI 文件中)的流量方向。
- 制作一个新的电子表格页面,其中包含所有速度值的绝对值。使用这些值计算总体平均流速、一段时间内所有血管段的平均流速、一段时间内每个血管段的流速,并制作速度分布的直方图。
- 首先查找标记骨架中的特定相关段,然后对这些选定线段执行分析,从而计算特定形态区域或其他感兴趣区域的值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STAFF 分析可生成整个显微镜场的微血管速度的完整普查,时间从数秒到几分钟不等。代表性的结果如图1、图2、图3和图4所示。图1显示了小鼠肝脏中微血管网络的时间序列示例、用于定义微血管流轴的骨架图像的生成,以及为定量而识别的单个血管段的 STAFF生成的映射。然后,STAFF 使用骨架化的图像将微血管网络分解为各个段,然后为每个段生成 Kymograph 图像。这些图像提供给用户,以及用于识别用于测速分析的时间间隔的工具(图2)。然后,STAFF 使用骨架和用户提供的时间间隔将每个段的 kymograph 分解为单独的段时间间隔。然后,STAFF 从每个分段时间间隔识别 kymograph 中的主要角度,并将速度测量作为 .csv 数据文件 (图 3) 和彩色编码速度图图像堆栈的形式提供(图 4)。为了支持数据分析管道的探索,STAFF 还提供包含所有 kymograph 角度测量和拟合优值的 .csv 文件。
图1:生成血管骨架。(A) 从活老鼠肝脏收集的时序图像中单帧的原始图像。比例尺 = 100 μm. (B) 面板 A 中显示的图像,其中中央静脉 (CV) 和门户三重轴 (PT) 表示,用于识别正弦流的主要方向。(C) 面板 A 的图像,其中叠加了正弦的 TrakEM2 分割。(D) TrakEM2 分段的二进制图像。(E) TrakEM2 分段的骨架化.(F) STAFF 输出带有标签的单个血管段的图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:测速仪分析。(A)图1F所示的血管段放大图像。(B) 从一个片段中收集的典型心象仪,在两个呼吸间时间间隔内收集。呼吸周期用箭头记录。(C) 面板 A 中第 240、252 和 254 段的 Kymograph。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:速度数据分析。(A, B)在 19 个时间间隔内四个段的速度测量表表示为带方向(A) 或绝对速度(B) 的速度。(C) 直方图显示整个20s时间段内整个场的绝对速度值分布。(D) 整个20个周期中,图2C显示其图形图的三个段的速度图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:速度贴图。(A) 工作人员输出图像的颜色编码速度映射的单个时间间隔的字段如图1所示。(B) 以 3D 体积形式呈现的所有时间间隔的速度图的合成。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
此协议中有多个关键步骤。首先,在肝脏的术中成像过程中尽量减少运动对于生成可用于使用 STAFF进行毛细管流量分析的短片至关重要。由于隔膜的接近,呼吸引起的运动时间很短,每次呼吸后,固定肝脏将恢复到初始位置。使用纱布将手术暴露的肝脏固定在盖板底盘上,然后用倒置显微镜从下面成像,用于在呼吸16、17、18、19之间固定器官。其次,强烈建议图像采集速度为 100 fps,因为可以测量的流速是图像采集速度和测量流量的段的最小长度的函数。第三,生产高质量的骨架,血管网络的线条绘制表示,是利用STAFF获得毛细管流速的下一个关键步骤。在分析的时间过程中,骨架线段应位于呼吸之间的血管中点附近,并且应确定图像平面外血管分支。通过观看影片、检查 kymograph 或检查该段随时间而显示的速度值,可以推断出沿血管段的这些隐藏分支的位置。观看影片时,这些血管段被视为具有双向流动,从看不见的分支位置流出或汇合,或者沿血管段的流速突然变化。隐藏分支点的位置可以在图形中标识为由流动方向或速度变化产生的角度变化的位置。在电子表格中,具有隐藏分支位置的血管段可能会虚假地改变方向(符号)或两个贡献段的值之间更改。如果时间序列包含太多出图像平面的分支点,则在手动编辑骨架后,通过在缺失分支点的位置的线条绘图中放置间隙(使用绘制工具),应重复 STAFF 分析。
我们发现了图像采集中的一个常见问题,这个问题通常不被人注意,但对使用 STAFF 测量流速有很强的影响。在图像采集中,在外光照明灯光源的强度或显微镜室的区域照明中可能发生不稳定或"闪烁"。从任一源,光/暗带随时间的闪烁周期发生在零角度在Kymograph。如果零角峰是主峰,那么即使红血通过测量流速的血管的运动产生的角度对人眼是很明显的,定向插件也会将曲线拟合到零峰,并报告一个非常接近零度的值,从而导致速度测量不切高。即使零角峰不是主峰,也会影响方向曲线拟合,使报告的速度向较高值移动。为了解决这个问题,STAFF 提供了一个"闪烁校正"选项,忽略 0° 处出现的峰值角度。这种修改消除了灯闪烁的影响,而不影响速度量化。
使用宽场显微镜获取流速的主要限制是图像采集仅限于薄制剂,如肠血管,或斑马鱼分段间血管或器官的表面层,如肝脏或可外化的肾脏。
与现有的流量定量方法不同,使用STAFF的一个显著优点是,它可以快速、公正地检测血管流动的空间和时间模式。使用栅格扫描系统收集和分析微血管流动数据通常限于在20、21、22、23时间测量单个用户选择的毛细血管。存在提取跨字段24、25、26的流速的方法,但是这些方法都不支持整个领域的分析,并且所有方法都是劳动密集型的。使用 STAFF,可以在一天内完成对数据集整个图像字段中每个毛细管段的分析,其中包含数以万计的图像。即使对一个全场血管流量数据集进行手动分析,也可能需要数月到数年的时间。因此,即使对正常流量进行表征,手动分析也是不切实际的,显然不允许对多个治疗组进行比较。
STAFF对血管流时空模式的轻松量化为未来用户提供了将血管形态学观察与毛细血管流速模式影响联系起来的机会。通过定义血管直径的血管形态测量与网络拓扑与流速模式的关系,我们可以从血管形态预测流动模式。类似地,将血管流动模式和血管形态与免疫细胞渗透的时间、定位和程度、毒物暴露或疾病造成的组织损伤或细胞内迁移状态等事件联系起来,不仅会导致我们更好地了解流动模式和细胞功能在健康和疾病,但也将提供一个框架,以确定特别有害的病理生理学情况。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者报告没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这里提出的研究得到了国家卫生研究院(NIH U01 GM111243和NIH NIDDK P30 DK079312)的资助。在印第安纳州生物显微镜中心进行了生命内显微镜研究。我们感谢马尔戈扎塔·卡莫卡博士在显微镜方面提供技术支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
Micro scissors | Castro Viejo | ||
Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
Needle holder | Olsen-Hegar | ||
Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).