Summary
Para quantificar o fluxo microvascular de sequências de imagem capilar de fluxo de alta velocidade, desenvolvemos o software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Em todo o campo de imagem completo e ao longo do tempo, a EQUIPE avalia as velocidades de fluxo e gera uma sequência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas.
Abstract
As alterações na velocidade e distribuição do fluxo sanguíneo são vitais para manter a perfusão de tecidos e órgãos em resposta às diferentes necessidades celulares. Além disso, o aparecimento de defeitos na microcirculação pode ser um indicador primário no desenvolvimento de múltiplas patologias. Os avanços nas imagens ópticas fizeram da microscopia intravital (IVM) uma abordagem prática, permitindo imagens a nível celular e subcelular em animais vivos em alta velocidade ao longo do tempo. No entanto, apesar da importância de manter a perfusão de tecido adequada, a variabilidade espacial e temporal no fluxo capilar raramente é documentada. Na abordagem padrão, um pequeno número de segmentos capilares são escolhidos para imagens ao longo de um tempo limitado. Para quantificar de forma abrangente o fluxo capilar de uma forma imparcial, desenvolvemos a Análise Temporal Espacial do Fluxo De Campo (STAFF), uma macro para o software de análise de imagem de código aberto de FIJI. Usando sequências de imagem de alta velocidade de campos cheios de fluxo sanguíneo dentro de capilares, staff produz imagens que representam o movimento ao longo do tempo chamado kymographs para cada intervalo de tempo para cada segmento vascular. A partir dos kymographs STAFF calcula velocidades da distância que os glóbulos vermelhos se movem ao longo do tempo, e fornece os dados de velocidade como uma seqüência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas. Em fígados de camundongos normais, a STAFF analisa diferenças profundas quantificadas na velocidade do fluxo entre regiões pericentrais e periportal dentro dos lóbulos. Ainda mais inesperadas são as diferenças na velocidade do fluxo observadas entre os sinusoids que estão lado a lado e flutuações observadas dentro de segmentos vasculares individuais ao longo de segundos. A EQUIPE É uma nova ferramenta poderosa capaz de fornecer novos insights, permitindo a medição da complexa dinâmica espaçotemporal do fluxo capilar.
Introduction
A microvasculatura desempenha um papel crítico na fisiologia, garantindo uma perfusão eficaz de tecidos em condições de mudança. A disfunção microvascular está associada a inúmeras condições, incluindo morbidade cardiovascular e mortalidade a longo prazo, desenvolvimento de demência e doença de fígado e rim e, portanto, é um fator-chave de interesse em uma ampla gama de investigações biomédicas1,2,3,4,5. Embora várias técnicas tenham sido usadas para avaliar a perfusão de tecidos, apenas a microscopia intravital permite a coleta de dados na resolução temporal e espacial necessária para caracterizar o fluxo sanguíneo no nível de capilares individuais.
O fluxo microvascular pode ser visualizado em microscopia de fluorescência pelo movimento de microesferas fluorescentes ou pelo movimento dos glóbulos vermelhos no contexto de marcadores fluorescentes impermeant da membrana (por exemplo, dextran fluorescente-etiquetados ou albumina)6,7. O fluxo microvascular pode ser imageado em camadas de células superficiais usando microscopia widefield ou em profundidade usando microscopia confocal ou multifoton. No entanto, as taxas de fluxo capilar são tais que a passagem de glóbulos vermelhos geralmente não pode ser capturada a velocidades inferiores a 60 quadros/s. Uma vez que a maioria dos microscópios confocal e multifoton de varredura a laser exigem 1-5 s para digitalizar um campo de imagem completo, essa velocidade geralmente pode ser realizada apenas limitando o campo de visão, às vezes a uma única linha de digitalização8. O processo de limitação de medições a segmentos capilares selecionados (1) tem o potencial de introduzir viés de seleção e (2) torna impossível a captura de heterogeneidade espacial e temporal nas taxas de fluxo sanguíneo capilar. Em contraste, imagens de redes capilares podem ser coletadas em velocidades superiores a 100 fps usando microscópios digitais widefield equipados com câmeras científicas complementares de semicondutores de óxido metálico (sCMOS)9,10. Estes sistemas baratos, comuns em laboratórios biomédicos típicos tornam possível a imagem de fluxo microvascular em redes bidimensionais inteiras, essencialmente continuamente. O problema, em seguida, torna-se um de encontrar uma abordagem de análise que é capaz de extrair dados quantitativos significativos dos conjuntos de dados de imagem maciça e complexa gerada pela microscopia de vídeo de alta velocidade.
Para permitir a análise de dados de fluxo de campo completo, desenvolvemos a STAFF, novo software de análise de imagem que pode medir continuamente o fluxo microvascular em campos de microscópio inteiros de séries de imagens coletadas em alta velocidade11. A abordagem é compatível com uma variedade de diferentes sistemas experimentais e modalidades de imagem e o software de análise de imagem STAFF é implementado como um conjunto de ferramentas macro para a implementação de Fiji do ImageJ12. O princípio subjacente usado aqui para visualizar o fluxo microvascular é que, em primeiro lugar, algum contraste deve ser fornecido para ser capaz de imagem dos glóbulos vermelhos dentro de capilares. Em nossos estudos, o contraste é fornecido por uma sonda fluorescente em massa que é excluída pelos glóbulos vermelhos. A velocidade do fluxo pode então ser quantificada a partir do deslocamento dos glóbulos vermelhos que aparecem como uma mancha negativa dentro do plasma fluorescente mente rotulado em imagens coletadas em alta velocidade de um animal vivo8. Em seguida, usamos a EQUIPE para fazer parcelas de distância ao longo de cada segmento capilar ao longo de vários intervalos de tempo chamados kymographs, em seguida, detectar as encostas presentes nos kymographs13,e a partir dessas encostas calcular as taxas de fluxo microvascular. A abordagem pode ser aplicada a imagens coletadas de qualquer leito capilar que possa ser acessado para imagens. Aqui descrevemos a aplicação de IVM e STAFF para estudos de fluxo sanguíneo no fígado.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Indiana, e aderiram ao guia nrc para o cuidado e uso de animais.
1. Preparação cirúrgica para microscopia intravital
Nota: Isto não é uma cirurgia de sobrevivência. Uma vez iniciada a seção 1 "Preparação cirúrgica para microscopia intravital", os trabalhos não podem ser pausados até a conclusão da seção 2 "Microscopia Intravital".
- Aclimatize 9-10 ratos machos C57BL/6, por pelo menos 4 dias e rápido para 16 h antes dos estudos.
- Pese o animal, sedado com 5% isoflurane e coloque em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. Use uma taxa de fluxo de oxigênio de 1-2 L/min e mantenha a sedação com isoflurane de 1-2%. Verifique os reflexos por pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dia Monitore a temperatura usando um termômetro retal. Monitorar a freqüência cardíaca e respiração visualmente.
- Quando a anestesia é estável, raspar a área para a colocação de cannulação jugular e a área abaixo da caixa torácica para a exposição do fígado.
-
Para a cannulação jugular, faça uma incisão ventral esquerda de 1 cm 1-2 cm abaixo da mandíbula do mouse. Limpe toda a gordura e fáscia em torno da veia jugular. Amarre a extremidade anterior da jugular usando 06 corda de sutura para evitar sangramento.
- Faça um pequeno corte na veia jugular e deslize a cânula (30 G x 1/2 em, agulha), suporte de agulha e tubos de polietileno (0,011 x 0,024 polegadas2 ligado a um adaptador de restadura Luer e preenchido com 0,9% saline) em cerca de 1 cm, e seguro na extremidade posterior da jugular usando 0-6 suture string.
- Usando a cânula jugular entregar 70 kDa fluorescein dextran (a uma dose de 30 mg/kg através da injeção de 0,1 mL de uma solução de 9 mg/mL em sorino).
- Expor o fígado para a imagem, fazendo uma incisão de 4-6 cm em todo o tronco, 1-2 cm abaixo do meio da caixa torácica.
- Coloque um molhado (embebido em 0,9% saline) 2 x 2 polegadas2 esponja de gaze abaixo do lobo do fígado lateral esquerdo. Coloque a fita na periferia da janela de vidro de um prato de 40 mm com fundo de capa e aplique adesivo de cianoacrilato à fita. Pressione a placa de vidro para o fígado e usando aplicadores de algodão derrubado pressione a gaze na cola na fita para minimizar o movimento do tecido para microscopia.
- Mova o animal para o estágio do microscópio. Adicione a soro-a-leiina estérel de 0,9% no prato com fundo de deslizamento de capa para manter o fígado úmido durante toda a sessão de imagem. Mantenha a temperatura em 36-37 °C através das almofadas de aquecimento montadas no estágio, uma almofada de aquecimento coloc sobre o animal e um calededor objetivo.
2. Microscopia Intravital
- Realize microscopia intravital em um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma câmera de vídeo capaz de captura de imagem de alta velocidade.
Nota: Aqui, uma lâmpada de arco Xenon, excitação específica de fluoresceina (480-500 nm) e filtros de emissão (507-543 nm), Plano Fluor 20x, N.A. 0,75 objetivo de imersão de água e uma câmera sCMOS de alta velocidade foram usadas. - Selecione a área de interesse para a análise do fluxo sanguíneo capilar usando iluminação mínima.
- Defina o tempo de exposição curto o suficiente para que a câmera seja capaz de adquirir 100 fps. Ajuste o nível da iluminação para visualizar claramente sombras vermelhas da pilha de sangue e a topologia da vasculatura ao igualmente evitar a fototoxicidade e o photobleaching da ponta de prova fluorescente.
- Coletar imagens a uma taxa de 100 fps. Defina a resolução de pixels da câmera entre ~0,65 e ~1,3 μm/pixel. Defina o tamanho do quadro entre 512 x 512 e 1024 x 1024 pixels. Definir pouco de profundidade entre 8 e 16 bits. Use a maior resolução, tamanho do quadro e profundidade de bit que ainda permite a coleta de imagem de 100 fps no sistema.
- Economize o arquivo da série de tempo (s) como uma seqüência de arquivos TIF ou como formato de câmera/microscópio nativo se bioformatos14 em FIJI puderem abrir os arquivos de formato nativo.
- Imagem várias áreas ao longo do tempo. Mantenha o mouse no estágio do microscópio por até 2 h. Eutanasiar o mouse no final da imagem.
Nota: A duração da série de tempo será baseada em equilibrar a necessidade de imagem por um intervalo de tempo que abrange a variabilidade, sem afetar a viabilidade do tecido. A duração da série de tempo também pode ser ditada por considerações de tamanho do arquivo; uma série de tempo de 1 min de 1024 x 1024 pixel 16 bits imagens coletadas em 100 fps irá gerar um arquivo que é de 12 GB de tamanho. Considerações de tamanho do arquivo também podem ditar o tamanho do quadro e a profundidade do bit usada. Não há limites de tamanho explícitos dentro do STAFF.
3. Definir a rede vascular usando TrakEM2 em FIJI
Nota: O protocolo pode ser pausado após o trabalho de poupança em qualquer ponto da seção 3.
- Baixe e instale FIJI de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
Nota: Versão 1.51n de Fiji foi usado para este projeto, e pode ser baixado de https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Note que no Windows, FIJI deve ser instalado no espaço do usuário e não em arquivos do programa. - Abra o arquivo do filme em FIJI usando Arquivo > Aberto ou usando Arquivo > Importação > Sequência de imagem. Selecione uma única imagem das imagens estáveis entre respirações onde a topologia da rede vascular é fácil de ver. Selecione Image > Duplicar e duplicar a imagem única selecionada (não a pilha) e salvar a imagem em uma nova pasta. Não inclua espaços em nomes de arquivos ou pastas.
- Configure um novo projeto trakem2 em branco selecionando File > New > TrakEM2 (em branco). Selecione a nova pasta contendo a única imagem do filme como a pasta do projeto. As janelas trakem2 serão abertas.
- Clique à direita na principal área de trabalho e selecione Import > Imagem de Importação . Navegar para a única imagem salva na etapa 3.3 e selecioná-la.
- Clique direito na área de trabalho principal novamente e selecione Display > Autoresize tela /Camada definida. Clique à esquerda na janela de trabalho principal. A imagem encherá a área de trabalho.
- Para selecionar as áreas na imagem que contêm a rede vascular, a seleção da lista da área da configuração em TrakEM2. Na janela trakem2 menor (modelo, objetos do projeto, camadas) clique direito em "• qualquer coisa". Selecione Adicionar nova lista de crianças > área.
- Na janela trakem2 menor, arraste "Template > qualquer coisa" para "Project Objects > projeto". Em seguida, arraste "Template > qualquer coisa > • lista de área" para "Project Objects > projeto > qualquer coisa". Em "Project Objects > project > anything", • a lista de áreas agora estará presente.
- Na janela trakem2 principal a guia espacial Z, uma lista de área sacada em barra foi criada. Clique para selecioná-lo. Na janela principal trakem2 também selecionar a ferramenta pincel. Pressione shift e role a roda do mouse para selecionar um tamanho apropriado para o pincel, por exemplo, menor do que o diâmetro da vasculatura. Para salvar as chaves trakem2 de controle de imprensa de configuração + S.
- Pinte a rede vascular usando a ferramenta de pincel. Para apagar alt enquanto estiver usando a ferramenta de pincel. Não inclua regiões fora de foco. Economize com frequência usando controle + S.
- Quando a rotulagem da rede vascular estiver completa, clique à direita na janela principal do TrakEM2 e selecione Export > AreaLists como rótulos (tif). Na janela pop-up selecione Escala 100% e ExportA Lista de toda a área. Feche as janelas TrakEM2 e escolha sim para salvar projeto.
- A imagem de AreaLists abrirá e pode aparecer como uma imagem preta em branco. No menu principal fiji selecione imagem > ajuste > brilho/ contraste. Na janela B&C pressione o botão de automóvel e o AreaList ficará visível. No menu principal fiji selecionar Imagem > Lookup Tables > Invert LUT. Salve esta imagem de etiquetas pretas em fundo branco e feche a imagem.
- Abra o arquivo de etiquetas em FIJI. Selecione Plugins > Skeleton > Skeletonize. Salve a imagem esqueletizada como um tif. Use o arquivo skeleton.tif como um dos arquivos de entrada necessários para executar a análise de fluxo da EQUIPE. Ao salvar o arquivo, não use espaços no nome do arquivo.
- Edite manualmente o arquivo esqueleto conforme necessário, colocando uma lacuna (usando a ferramenta de tinta)no desenho de linha, por exemplo, em locais onde os ramos da vasculatura não foram capturados porque saem do plano de imagem.
4. Prepare a seqüência do filme para a análise da equipe de funcionários
- Abra o arquivo do filme em FIJI usando Arquivo > Aberto ou Arquivo > Importação > Sequência de imagem. Selecione um período de tempo da seqüência de imagem para análise de fluxo (pode ser segundos a minutos, centenas a dezenas de milhares de quadros), onde a posição do tecido permaneceu estável ao longo do tempo, exceto durante a respiração.
- Selecione Image > Duplicar e duplicar a parte selecionada da seqüência, digitando os números dos quadros de início e fim. Verifique a calibração espacial e temporal de imagem em Image > Propriedades e corrigir, se necessário. Salve o arquivo de imagem como um TIF (ou como um AVI não comprimido). Este movie.tif é necessário como um arquivo de entrada para executar a análise pessoal. Não inclua espaços no nome do arquivo.
5. Instalar macros pessoal em FIJI
NOTA: (Importante) Pastas múltiplas dentro dos subdiretores da pasta FIJI têm nomes de arquivos semelhantes, alguns capitalizados, outros não. Tenha certeza de que as pastas corretas são selecionadas ao instalar o PESSOAL.
- Baixe as macros staff de https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
-
Para instalar, primeiro abra a pasta FIJI.
- No Windows encontrar a pasta onde FIJI é instalado no espaço do usuário, mais comumente na área de trabalho. No MacOS encontre o ícone fiji na pasta de aplicativos, clique à direita e selecione Open.
- Na pasta FIJI, abra a pasta de plugins. Dentro da pasta dos plugins, abra a pasta Macros. Copie STAFF.ijm nesta pasta Macros: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
- Na pasta FIJI, abra a pasta de plugins. Copie STAFF_Dir.jar nesta pasta plugins: Fiji \plugins\STAFF_Dir.jar.
- Na pasta FIJI, abra a pasta macros. Dentro desta pasta macros, abra a pasta AutoRun. Copie STAFF_Loader.ijm nesta pasta AutoRun: Fiji\macros\AutoRun\STAFF_Loader.ijm.
- Iniciar FIJI e verificar a instalação macro. Para verificar a instalação, selecione Plugins > Macros. Quando instalado corretamente, o menu de entrega incluirá: Projeto open-create, analise esqueleto, edite intervalos de tempo, analise o fluxo e produza o mapa espacial.
- Se esses comandos não estiverem presentes no menu Macros, selecione Plugins > Macros > Instale,abra a pasta Fiji\plugins\Macros, selecione o arquivo STAFF.ijm e clique no botão OK. Os comandos devem agora aparecer no menu Plugins > Macros.
6. Quantificar o fluxo vascular usando a equipe de funcionários
- Criar um novo projeto.
- Selecione Plugins > Macros > Projeto Open-Create e siga solicitações para criar ou atualizar um arquivo de configuração.
- A partir do menu Open-Create Project, navegue e selecione o Diretório do Projeto, a Pasta de Arquivos de Entrada e os arquivos de entrada Movie.tif e Skeleton.tif. Eite os nomes de arquivos de saída auto-preenchidos, se necessário.
- Valores de entrada para o comprimento mais curto do segmento (20 μm), velocidade máxima medida (2.000 μm/s) e velocidade máxima mapeada (1.000 μm/s).
Nota: O produto do comprimento mais curto do segmento e dos quadros por segundo dá a velocidade máxima do fluxo que pode teòrica ser medida. As maiores velocidades de fluxo capilar relatadas na literatura são em torno de 2.000 μm/s15. No fígado, observamos que as velocidades capilares de fluxo geralmente em média em torno de 300 μm/s e raramente excediam 1.000 μm/s. - Digite os valores para o tamanho do pixel e taxa de quadros para a seqüência de imagem (a partir de metadados de imagem ou notas experimentais). Esses valores exigem a entrada do usuário. Verifique a caixa de correção flicker se as imagens tiverem cintilação periódica de intensidade de fundo.
- Selecione parâmetros para melhor visualização dos dados. Selecione a velocidade máxima mapeada para incluir cerca de 95% dos dados para que os dados sejam mapeados em toda a gama da escala de cores. A EQUIPE mapeia outliers de alta velocidade para a extremidade de alta velocidade da escala de cores.
- Analise o esqueleto.
- Selecione Plugins > Macros > Analise esqueleto. O arquivo skeleton.tif será aberto e o Gerente da Região de Interesse (ROI) abrirá e funcionará.
Nota: Analise skeleton classifica cada pixel por seu número de vizinhos como em um ponto final, em uma junção ou dentro de um segmento. Para cada segmento, um número de identificação (número de identificação), um comprimento de ramo calibrado e as coordenadas espaciais das extremidades do ramo são registrados. - Aguarde que as didas do segmento apareçam no esqueleto, a lista de segmentos apareça no gerente do ROI e um pop-up indicando que o arquivo roi manager para o esqueleto é salvo. Clique OK.
- Verifique se entre os movimentos respiratórios, o esqueleto permanece sobre onde os glóbulos vermelhos passam pelo capilar (por exemplo, não a borda e não fora do capilar). Exibir os segmentos rotulados como uma sobreposição no filme, abrindo o arquivo do filme, em seguida, arrastando o arquivo zip ROI para o filme aberto. Jogue o filme com os segmentos sobrepostos.
- Selecione Plugins > Macros > Analise esqueleto. O arquivo skeleton.tif será aberto e o Gerente da Região de Interesse (ROI) abrirá e funcionará.
- Selecione intervalos de tempo.
- Selecione Plugins > Macros > Select Time Intervals. Espere enquanto a macro gera um kymograph de um único segmento ao longo do tempo total para o filme. A partir deste kymograph, o usuário seleciona intervalos de tempo para análise. Use controle + + chaves para aumentar o tamanho do kymograph, se necessário.
- A ferramenta de seleção do retângulo é ativada automaticamente. Desenhe um retângulo em torno de cada intervalo de tempo. Um bom ponto de partida para o comprimento do intervalo de tempo é o intervalo de 1-2 entre as respirações, que são aparentes como regiões borradas horizontais no kymograph.
- Clique na tecla T ou no botão Adicionar no gerente de ROI para registrar seleções de intervalo de tempo. Repita por tantos intervalos de tempo quanto desejado. Faça seleções sequencialmente do topo (ou esquerda) para baixo (ou direita) do kymograph.
- Avalie as opções de parâmetros (do Open-Create Project) selecionando um pequeno número de intervalos de tempo (3 a 4) e completando a análise para apenas esses intervalos, uma vez que o Fluxo de Análise (o próximo passo) pode levar horas para grandes conjuntos de dados.
- Clique ok no Fazer um ROI para cada janela intervalo de tempo quando feito. Uma janela pop-up aparece quando os intervalos selecionados foram salvos na Pasta do Projeto. Clique OK.
- Analise o fluxo.
- Selecione Plugins > Macros > Analise o fluxo e a caixa de diálogo analisação dos parâmetros de fluxo abre e exibe os valores inseridos na etapa do Projeto Open-Create. Eite, se necessário, em seguida, clique OK.
- A caixa de diálogo Output File Names abre e exibe os nomes inseridos na etapa do Projeto Open-Create. Eite, se necessário, em seguida, clique OK.
- Uma caixa de diálogo abre perguntando se o usuário está pronto para começar a análise. Clique OK e a análise começará. Aguarde uma caixa de diálogo que se abre para indicar quando a Análise de Fluxo estiver concluída.
Nota: O tempo necessário depende da velocidade do processador e do tamanho do conjunto de dados. - Confirme que os arquivos de resultados foram armazenados como arquivos de planilha de formato .csv na Pasta do Projeto.
Nota: Os arquivos de saída incluem: segment_velocities.csv contém valores de velocidade que têm valores positivos e negativos indicando direção de fluxo. As células que representam segmentos inferiores ao comprimento mínimo contêm o texto SHORT. Células com valores de velocidade maiores do que a velocidade máxima medida contêm o texto OUT (para outlier). kym_ang.csv contém ângulos de kymografia medidos pelo plugin directionality em FIJI. good_fit.csv contém bondade de ajuste de uma curva para a distribuição de ângulos medidos a partir de cada kymograph. Pobre bondade de ajuste (< 0,8) pode indicar pontos de ramificação ocultos em um segmento, mudança de velocidade durante o intervalo de tempo, lâmpada ou cintilação de luz do quarto. - Verifique se segment_velocities.csv contém poucos valores out. Se houver um grande número de valores de OUT, verifique se o comprimento mínimo do segmento para analisar não é inferior a 15-20 μm, em seguida, reexecutar analisar o fluxo. Se o novo segment_velocities.csv ainda contém uma grande proporção de valores out, em seguida, verifique a caixa de correção de cintilação, em seguida, reexecutar analisar fluxo.
- Produzir mapas espaciais.
- Selecione Plugins > Macros > Produzir Mapa Espacial e a janela de parâmetros do mapa espacial será aberta, exibindo os valores inseridos na etapa do Projeto Open-Create. Eite, se necessário, ou para continuar a selecionar OK.
- Veja como uma seqüência temporal de mapas espaciais de velocidades de fluxo é gerada com cor indicando velocidade de fluxo. A saída é na forma de uma pilha de imagem .tif com uma imagem para cada intervalo de tempo. Percorra a pilha .tif para visualizar a variação espacial e temporal no fluxo. Salve a pilha como um arquivo AVI (descomprimido para a portabilidade máxima) para compartilhar como um filme.
7. Análise quantitativa usando a saída da equipe de funcionários
- Abra o arquivo segment_velocities.csv em uma planilha ou programa de análise estatística. Esses valores têm sinal positivo ou negativo que indica direção de fluxo em relação aos pontos de partida/parada desse segmento (registrados no arquivo ROI do Segmento).
- Faça uma nova página de planilha contendo os valores absolutos de todos os valores de velocidade. Use esses valores para calcular a velocidade média geral do fluxo, a velocidade média do fluxo para todos os segmentos vasculares ao longo do tempo, a velocidade do fluxo para cada segmento vascular ao longo do tempo e faça histogramas de distribuições de velocidade.
- Calcule valores em torno de regiões morfológicas específicas, ou de outras regiões de interesse, encontrando primeiro os segmentos relevantes específicos no esqueleto rotulado e, em seguida, realizando análises sobre esses segmentos selecionados.
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Representative Results
A análise da equipe gera um censo completo de velocidades microvasculares em campos de microscópio inteiros ao longo de períodos de tempo que se estende de segundos a minutos. Os resultados representativos são apresentados na Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4. A Figura 1 mostra um exemplo de uma série temporal da rede microvascular no fígado de um camundongo, a geração da imagem esqueletizada que é usada para definir o eixo do fluxo microvascular e o mapa gerado pela EQUIPE DE SEGMENTOs vasculares individuais identificados para quantificação. A EQUIPE usa a imagem esqueletizada para dividir a rede microvascular em segmentos individuais e, em seguida, gera imagens de kymographs para cada segmento. Essas imagens são fornecidas ao usuário, juntamente com ferramentas para identificar os intervalos de tempo a serem usados para análise de kymograph (Figura 2). A EQUIPE usa o esqueleto e os intervalos de tempo fornecidos pelo usuário para quebrar o kymograph de cada segmento em intervalos de tempo de segmento individuais. A EQUIPE identifica o ângulo predominante no kymograph de cada intervalo de tempo do segmento e fornece medidas de velocidade como arquivos de dados .csv (Figura 3)e na forma de pilhas de imagens de mapa de velocidade codificadas por cores (Figura 4). A fim de apoiar a exploração do pipeline de análise de dados, a STAFF também fornece arquivos .csv contendo todas as medições do ângulo do kymograph e valores de bondade de ajuste.
Figura 1: Gerando o esqueleto vascular. (A) Imagem original de um único quadro de imagens da série de tempo coletadas do fígado de um rato vivo. Barra de escala = 100 μm. (B)Imagem mostrada no Painel A com veias centrais (CV) e triads portal (PT) indicou, para identificar as principais direções do fluxo sinusoide. Imagemdo Painel A com sobreposição da segmentação trakem2 de sinusoids. (D)Imagem binária da segmentação TrakEM2. (E)Skeletonization da segmentação TrakEM2. (F)Imagem de saída de pessoal de segmentos vasculares individuais com rótulos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Análise do Kymograph. (A)Imagem ampliada de segmentos vasculares mostrados na Figura 1F. (B) Kymograph típico de um segmento coletado sobre dois intervalos de tempo interrespiratórios. Períodos de respiração são observados com flechas. (C) Kymographs para segmentos 240, 252 e 254 do painel A. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Análise de dados de velocidade. (A, B) Tabelas de medições de velocidade de quatro segmentos ao longo de 19 intervalos de tempo expressos como velocidade com direção (A)ou como velocidade absoluta(B). (C)Histograma mostrando distribuição de valores de velocidade absoluta em todo o campo durante todo o período de 20 anos. (D)Gráfico das velocidades dos três segmentos cujos kymographs são mostrados na Figura 2C durante todo o período de 20 s. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Mapa de velocidade. (A)Imagem de saída pessoal do mapa de velocidade codificado por cores para um único intervalo de tempo para o campo mostrado na Figura 1. (B) Composto de mapas de velocidade para todos os intervalos de tempo apresentados como um volume 3D. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Há vários passos críticos neste protocolo. Primeiro, a minimização do movimento durante a imagem intravital do fígado é essencial para gerar filmes que são utilizáveis para análise de fluxo capilar usando staff. Devido à proximidade do diafragma, ocorrem curtos períodos de movimento induzido pela respiração, com o fígado seguro retornando à sua posição inicial após cada respiração. Proteger o fígado exposto cirurgicamente contra o prato com fundo de coverslip usando gaze, em seguida, a imagem de baixo usando um microscópio invertido serve para imobilizar o órgão entre respirações16,17,18,19. Em segundo lugar, uma velocidade de aquisição de imagem de 100 fps é fortemente recomendada porque a velocidade de fluxo que pode ser medida é uma função da velocidade de aquisição de imagem e do comprimento mínimo dos segmentos em que o fluxo é medido11. Em terceiro lugar, produzir um esqueleto de alta qualidade, a representação de desenho de linha da rede vascular, é o próximo passo crítico na obtenção de velocidades de fluxo capilar usando staff. Os segmentos da linha de esqueleto devem encontrar-se perto do ponto médio da vasculatura entre respirações sobre o curso de tempo que está sendo analisado e ramificar vascular fora do plano da imagem deve ser identificado. Os locais desses ramos ocultos ao longo de um segmento vascular podem ser inferidos visualizando o filme, examinando o kymograph ou examinando os valores de velocidade ao longo do tempo para esse segmento. Vendo o filme, esses segmentos vasculares são vistos como tendo fluxo bidirecional, emanando longe ou convergindo para a localização do ramo invisível, ou como tendo uma mudança abrupta na velocidade do fluxo naquele ponto ao longo do segmento vascular. A localização dos pontos de ramificação ocultos pode ser identificada em kymographs como a localização de uma mudança no ângulo que é produzida pela mudança na direção ou velocidade do fluxo. Na planilha, segmentos vasculares com ramificações ocultas podem mudar de direção (sinal) de forma espúria ou alteração entre os valores dos dois segmentos contribuintes. Se a série de tempo inclui muitos pontos de ramificação que estão fora do plano de imagem, a análise da EQUIPE DEVE ser repetida após a edição manual do esqueleto, colocando uma lacuna (usando a ferramenta de pintura) no desenho de linha nos locais dos pontos de ramificação perdidos.
Descobrimos um problema comum na aquisição de imagem que normalmente passa despercebido, mas teve um forte efeito na medição de velocidades de fluxo usando staff. Na aquisição de imagem, instabilidade ou "cintilação" na intensidade da fonte de luz da lâmpada epi-iluminação ou da iluminação da área na sala do microscópio podem ocorrer. De qualquer fonte, faixas claros/escuros ao longo do tempo com o período da cintilação ocorre em ângulo zero nos kymographs. Se o pico do ângulo zero é o pico principal, a seguir mesmo se o ângulo produzido pelo movimento do sangue vermelho corpucles através da embarcação onde a velocidade de fluxo está sendo medida é óbvio ao olho humano, o plugin do directionality cabe uma curva ao pico zero e relata um valor muito perto de zero graus, tendo por resultado as medidas da velocidade que são fantasiosa elevadas. Mesmo que o pico de ângulo zero não seja o pico principal, ele influenciará o ajuste da curva de direcionalidade de tal forma que a velocidade relatada é deslocada em direção a um valor maior. Para resolver esse problema, a EQUIPE fornece uma opção de "correção flicker" que ignora os ângulos de pico que ocorrem a 0°. Esta modificação eliminou os efeitos da cintilação da lâmpada sem afetar quantifications da velocidade.
A principal limitação da obtenção de velocidades de fluxo usando microscopia widefield é que a aquisição de imagem é restrita a preparações finas, como vasculatura mesentérica, ou os vasos intersegmentais zebrafish ou as camadas superficiais de órgãos, como fígado ou fígado rim que pode ser exteriorizado.
Uma vantagem significativa de usar a EQUIPE DE FUNCIONÁRIOS sobre métodos existentes do quantification do fluxo é que permite a deteção rápida e imparcial de testes padrões espaciais e temporais do fluxo vascular. A coleta e análise de dados de fluxo microvascular usando sistemas de varredura de raster são geralmente limitadas a medições de capilares selecionados por usuário único ao tempo20,21,22,23. Existem métodos para extrair velocidades de fluxo atravésdoscampos24,25,26,no entanto, nenhuma dessas abordagens suporta a análise em campos inteiros e todas são trabalhosas. Usando a EQUIPE, a análise de cada segmento capilar ao longo do tempo em todo o campo de imagem de um conjunto de dados com dezenas de milhares de imagens pode ser realizada dentro de um dia. A análise manual de até mesmo um único conjunto de dados de fluxo vascular de campo completo levaria meses a anos. Assim, a análise manual é impraticável mesmo para caracterização do fluxo normal e claramente não permite a comparação de múltiplos grupos de tratamento.
A facilidade da quantificação do STAFF do padrão espaçotemporal do fluxo vascular oferece a oportunidade para que os usuários futuros ligem observações morfológicas vasculares aos efeitos na modelação capilar da velocidade do fluxo. Ao definir a relação entre as medidas de morfologia vascular dos diâmetros dos vasos e a topologia da rede para o padrão de velocidade do fluxo, podemos então ser capazes de prever padrões de fluxo da morfologia vascular. Da mesma forma, correlacionar o padrão de fluxo vascular e a morfologia vascular com eventos como tempo, localização e extensão da infiltração de células imunes, danos nos tecidos causados por exposição ou doença tóxica ou status de transporte intracelular, não só daria nós uma melhor compreensão do padrão de fluxo e função celular na saúde e na doença, mas também forneceria uma estrutura para identificar cenários fisiopatológicos particularmente prejudiciais.
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Disclosures
Os autores não relatam nenhum interesse concorrente.
Acknowledgments
Estudos apresentados aqui foram apoiados por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH U01 GM111243 e NIH NIDDK P30 DK079312). Estudos de microscopia intravital foram realizados no Indiana Center for Biological Microscopy. Agradecemos ao Dr. Malgorzata Kamocka por assistência técnica com microscopia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
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