Summary
Yüksek hızlı kılcal akış görüntü dizilerinden mikrovasküler akışı ölçmek için, PERSONEL (Alan Sala¤›l›K A¤›n›n Mekansal Zamansal Analizi) yaz›l›m› gelifltirildi. Tam görüntü alanı boyunca ve zaman içinde, STAFF akış hızlarını değerlendirir ve nicel analizler için görselleştirme ve tabular çıktı için renk kodlu uzamsal haritalar dizisi oluşturur.
Abstract
Kan akımı hızı ve dağılımındaki değişiklikler, değişen hücresel ihtiyaçlara yanıt olarak doku ve organ perfüzyonu nun sürdürülmesinde hayati önem taşımaktadır. Ayrıca, mikrosirkülasyonda kusurların ortaya çıkması birden fazla patolojinin gelişiminde birincil bir gösterge olabilir. Optik görüntülemedeki gelişmeler intravital mikroskopiyi (IVM) pratik bir yaklaşım haline getirerek, canlı hayvanlarda hücreli ve hücre altı düzeyde zaman içinde yüksek hızda görüntülemeye izin verebilmiştir. Ancak, yeterli doku perfüzyonu bakımının önemine rağmen, kapiller akış mekansal ve zamansal değişkenlik nadiren belgelenmiştir. Standart yaklaşımda, sınırlı bir süre içinde görüntüleme için az sayıda kılcal segment seçilir. Kapiller akışı tarafsız bir şekilde kapsamlı bir şekilde ölçmek için FIJI açık kaynak görüntü analizi yazılımı için bir makro olan Fieldwise Flow'un (STAFF) Mekansal Zamansal Analizini geliştirdik. Kapiller içinde kan akışının tam alanlarının yüksek hızlı görüntü dizilerini kullanarak, STAFF her vasküler segment için her zaman aralığı için kymographs denilen zaman içinde hareket temsil görüntüler üretir. Kymographs STAFF kırmızı kan hücrelerinin zaman içinde hareket mesafe hızları hesaplar ve kantitatif analizler için görselleştirme ve tabular çıkış için renk kodlu uzamsal haritalar dizisi olarak hız verileri çıktı. Normal fare karaciğerlerinde, PERSONEL lobüller içindeki pericentral ve periportal bölgeler arasındaki akış hızındaki derin farklılıkları analiz eder. Daha da beklenmeyen yan yana olan sinüzoidler ile saniyeler içinde tek tek vasküler segmentlerde görülen dalgalanmalar arasında görülen akış hızı farklılıklarıdır. STAFF, kılcal damar akışının karmaşık spatiotemporal dinamiklerinin ölçülmesini sağlayarak yeni bilgiler sağlayabilen yeni bir araçtır.
Introduction
Mikrovaskülatür fizyolojide kritik bir rol oynar, değişen koşullar altında dokuların etkili perfüzyon sağlanması. Mikrovasküler disfonksiyon uzun vadeli kardiyovasküler morbidite ve mortalite, demans gelişimi ve karaciğer ve böbrek hastalığı da dahil olmak üzere sayısız koşullar ile ilişkilidir ve böylece biyomedikal araştırmaların geniş bir yelpazede ilgi önemli bir faktördür1,2,3,4,5. Doku perfüzyonu değerlendirmek için birden fazla teknik kullanılırken, sadece intravital mikroskopi, bireysel kılcal damarlar düzeyinde kan akışını karakterize etmek için gerekli olan zamansal ve mekansal çözünürlükte veri toplamayı sağlar.
Mikrovasküler akış floresan mikrosferlerin hareketi ya da membran impermeant floresan belirteçleri arka plan karşı kırmızı kan hücrelerinin hareketi ile floresan mikroskopi mikroskopi görselleştirilmiş olabilir (örneğin, floresan etiketli dextran veya albumin)6,7. Mikrovasküler akış geniş alan mikroskobu kullanılarak yüzeysel hücre tabakalarında veya konfokal veya multifoton mikroskopi kullanılarak derinlemesine görüntülenebilir. Ancak, kılcal akış hızları kırmızı kan hücrelerinin geçişi genellikle 60 kare /s'den daha düşük hızlarda yakalanamaz. Çoğu lazer tarama confocal ve multifoton mikroskoplar tam bir görüntü alanı taramak için 1-5 s gerektirdiğinden, bu hız genellikle sadece görüş alanı sınırlayarak, bazen tek bir tarama hattı8gerçekleştirilebilir . Ölçümleri seçilen kılcal segmentlerle sınırlandırma süreci (1) seçim önyargısını ortaya koyma potansiyeline sahiptir ve (2) kapiller kan akımı oranlarında mekansal ve zamansal heterojenliği yakalamayı imkansız kılmıştır. Buna karşılık, kılcal ağların görüntüleri bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kameralar9,10ile donatılmış geniş alan lı dijital mikroskoplar kullanılarak 100 fps'yi aşan hızlarda toplanabilir. Tipik biyomedikal laboratuvarlarda yaygın olan bu ucuz sistemler, mikrovasküler akımı nisble tüm iki boyutlu ağlarda, aslında sürekli olarak görüntülemeyi mümkün kılmaktadır. Sorun daha sonra yüksek hızlı video mikroskobu tarafından oluşturulan büyük ve karmaşık görüntü veri kümelerinden anlamlı nicel veri ayıklama yeteneğine sahip bir analiz yaklaşımı bulma biri olur.
Tam alan akış verilerinin analizini sağlamak için, yüksek hızda toplanan görüntü serilerinin tüm mikroskop alanlarında mikrovasküler akışı sürekli olarak ölçebilen STAFF, yeni görüntü analiz yazılımı geliştirdik11. Yaklaşım farklı deneysel sistemler ve görüntüleme yöntemleri çeşitli ile uyumludur ve STAFF görüntü analizi yazılımı ImageJ12FIJI uygulaması için bir makro araç seti olarak uygulanmaktadır. Mikrovasküler akışı görselleştirmek için burada kullanılan temel ilke, ilk olarak, bazı kontrast kılcal damarlar içinde kırmızı kan hücrelerini görüntü edebilmek için sağlanmalıdır. Çalışmalarımızda kontrast, kırmızı kan hücreleri tarafından dışlanan toplu floresan sonda ile sağlanmaktadır. Akış hızı daha sonra canlı birhayvan8 yüksek hızda toplanan görüntülerde floresan etiketli plazma içinde negatif bir leke olarak görünen kırmızı kan hücrelerinin yerinden ölçülebilir . Daha sonra kymographs denilen zaman birden fazla aralıklar üzerinde her kılcal segment boyunca mesafe çizimleri yapmak için PERSONEL kullanın, daha sonra kymographs mevcut yamaçlarında tespit13, ve bu yamaçlardan mikrovasküler akış oranlarını hesaplamak. Bu yaklaşım, görüntüleme için erişilebilen herhangi bir kılcal yataktan toplanan görüntülere uygulanabilir. Burada karaciğerde kan akımı çalışmaları için IVM ve PERSONEL uygulama açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine göre onaylandı ve gerçekleştirildi ve hayvanların bakımı ve kullanımı için NRC kılavuzuna bağlı kaldılar.
1. İntravital Mikroskopi için Cerrahi Hazırlık
NOT: Bu bir hayatta kalma ameliyatı değil. Bölüm 1 "İntravital mikroskopi için cerrahi hazırlık" başladıktan sonra, bölüm 2 "Intravital mikroskopi" tamamlanınncaya kadar çalışma duraklatılamaz.
- 9-10 haftalık erkek C57BL/6 fareleri, çalışmalardan önce en az 4 gün ve 16 saat boyunca hızlı bir şekilde hızlandırın.
- Hayvan tartın,% 5 izofluran ile yatıştırıcı ve vücut ısısını korumak için bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. 1-2 L/dk oksijen akış hızı kullanın ve% 1-2 isofluran ile sedasyon korumak. Refleksleri ayak sıkışması ile kontrol edin. Rektal termometre kullanarak sıcaklığı izleyin. Kalp hızını ve solunumu görsel olarak izleyin.
- Anestezi stabil olduğunda, juguler kanülasyon yerleşimi için alanı tıraş ve karaciğer maruziyeti için göğüs kafesi altında alan.
-
Juguler kanülasyon için farenin çenesinin 1-2 cm altında 1 cm sol ventral kesi yapın. Juguler ven çevreleyen tüm yağ ve fasya temizleyin. Kanamayı önlemek için 06 dikiş ipi kullanarak juguler ön ucunu bağlayın.
- Juguler ven küçük bir nick olun ve kanül slayt (30 G x 1/2 in, iğne), iğne tutucu ve polietilen boru (0.011 x 0.024 inç2 Luer sapı adaptörü bağlı ve 0.9% tuzlu ile dolu) yaklaşık 1 cm, ve 0-6 suture dize kullanarak jugular posterior ucunda güvenli.
- Juguler kanül kullanarak 70 kDa floresan dextran (bir doz a itimat 30 mg /kg enjeksiyon yoluyla 0.1 mL 9 mg/mL çözeltisi tuzlu).
- Göğüs kafesinin ortasından 1-2 cm aşağıda, gövde boyunca 4-6 cm'lik bir kesi yaparak karaciğeri görüntüleme için ortaya çıkarın.
- Sol lateral karaciğer lob altında ıslak bir (% 0.9 tuzlu batırılmış) 2 x 2 inç2 gazlı bez sünger yerleştirin. 40 mm'lik kapak dipli bir kabın cam penceresinin çevresine bant yerleştirin ve banta siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Cam plakayı karaciğere bastırın ve pamuk uçlu aplikatörleri kullanarak mikroskopisi için doku hareketini en aza indirmek için gazlı bezi banttaki tutkala bastırın.
- Hayvanı mikroskop aşamasına taşıyın. Görüntüleme seansı boyunca karaciğeri nemli tutmak için kapak dipli tabağa %0,9 tuzlu tuz ekleyin. Sahneye monte edilmiş ısıtma pedleri, hayvanın üzerine yerleştirilen bir ısıtma yastığı ve objektif bir ısıtıcı ile sıcaklığı 36-37 °C'de koruyun.
2. İntravital Mikroskopi
- Yüksek hızlı görüntü yakalama yeteneğine sahip bir video kamera ile donatılmış ters epifloresan mikroskobu üzerinde intravital mikroskopi gerçekleştirin.
NOT: Burada, Bir Xenon ark lambası, floresan özgü uyarma (480-500 nm) ve emisyon (507-543 nm) filtreler, Plan Flor 20x, N.A. 0.75 su daldırma hedefi ve yüksek hızlı sCMOS kamera kullanılmıştır. - Minimal aydınlatma kullanarak kılcal kan akışı analizi için ilgi alanını seçin.
- Kameranın 100 fps kazanabilmesi için pozlama süresini yeterince kısa ayarlayın. Floresan sondanın fototoksisite ve fotobeyazlmasını önlerken, kırmızı kan hücresi gölgelerini ve damar topolojisini net bir şekilde görselleştirmek için aydınlatma düzeyini ayarlayın.
- 100 fps hızında resim toplamak. Kamera piksel çözünürlüğünü ~0,65 ile ~1,3 m/piksel arasında ayarlayın. Çerçeve boyutunu 512 x 512 ile 1024 x 1024 piksel arasında ayarlayın. Bit derinliğini 8 ile 16 bit arasında ayarlayın. Sistemde 100 fps görüntü koleksiyonuna hala izin veren en yüksek çözünürlüğü, kare boyutunu ve bit derinliğini kullanın.
- Fiji'deki Bio-Formats14 yerel format lı dosyaları açabiliyorsa, zaman serisi dosya(lar)ı TIF dosyaları dizisi olarak veya yerel kamera/mikroskop biçimi olarak kaydedin.
- Zaman içinde birden çok alanı görüntüleyin. Mikroskop aşamasında fareyi 2 saate kadar koruyun.
NOT: Zaman serisinin süresi, dokunun canlılığını etkilemezken, değişkenliği kucaklayan bir zaman aralığı için görüntü ihtiyacını dengelemeye dayanır. Zaman serisinin süresi de dosya boyutu dikkate göre dikte edilebilir; 1024 x 1024 piksel 16-bit görüntülerin 100 fps toplanan 1 dk zaman serisi boyutu 12 GB bir dosya oluşturacaktır. Dosya boyutu hususları da kullanılan çerçeve boyutunu ve bit derinliğini dikte edebilir. STAFF içinde açık boyut sınırı yoktur.
3. FIJI'de TrakEM2 kullanarak Vasküler Ağı Tanımlayın
NOT: Protokol, bölüm 3'teki herhangi bir noktada iş tasarrufu ndan sonra duraklatılabilir.
- https://imagej.net/Fiji/Downloads'dan FIJI'yi indirin ve kurun.
NOT: Fiji Sürüm 1.51n bu proje için kullanılmıştır ve https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip indirilebilir. Windows'da FIJI'nin Program Dosyaları'nda değil, kullanıcı alanına yüklenmesi gerektiğini unutmayın. - Dosya > Dosya > İçe Aktar > Görüntü dizisinikullanarak FIJI'deki film dosyasını açın. Vasküler ağın topolojisinin kolayca görülmesinin kolay olduğu solunumlar arasındaki kararlı görüntülerden tek bir görüntü seçin. Görüntü > Yinelenen ve seçili tek görüntüyü (yığın değil) çoğaltın ve görüntüyü yeni bir klasöre kaydedin. Dosya veya klasör adlarında boşluk eklemeyin.
- Dosya > Yeni > TrakEM2 (boş)seçeneğini seçerek yeni bir boş TrakEM2 projesi ayarlayın. Proje klasörü olarak filmden tek görüntüyü içeren yeni klasörü seçin. TrakEM2 pencereleri açılacaktır.
- Ana çalışma alanına sağ tıklayın ve Görüntü Aktar'ı seçin. Adım 3.3'te kaydedilen tek görüntüye gidin ve seçin.
- Ana çalışma alanına tekrar sağ tıklayın ve Görüntüle > Otomatik Retore tuval/Katman kümesiniseçin. Ana çalışma penceresinde sol tıklatın. Görüntü çalışma alanını doldurur.
- Görüntüde vasküler ağ içeren alanları seçmek için, TrakEM2'deki kurulum alanı listesi seçimi. Küçük TrakEM2 penceresinde (Şablon, Proje Nesneleri, Katmanlar) "• herhangi bir şeye" sağ tıklayın. Yeni alt ekle > alan listesiniseçin.
- Küçük TrakEM2 penceresinde , "Template > anything" üzerine "Project Objects > project" sürükleyin. Daha sonra "Şablon > şey > • alan listesi" üzerine " ProjectObjects > project > anything" sürükleyin. "Project Objects > project > anything" altında • alan listesi artık mevcut olacaktır.
- Z boşluk sekmesininaltındaki ana TrakEM2 penceresinde, bir çubuk etiketli alan listesi oluşturuldu. Seçmek için tıklatın. Ana TrakEM2 penceresinde de paintbrush aracıseçin. Shift tuşuna basın ve korkülatür çapından daha küçük, örneğin, paintbrush için uygun bir boyut seçmek için fare tekerleği rulo. TrakEM2 kurulumundan kaydetmek için Control + S tuşlarına basın.
- Paintbrush aracınıkullanarak vasküler ağı boyayın. Paintbrush aracını kullanırken Alt'ı basılı tutmak için basılı tutun. Odak dışı bölgeleri dahil etmeyin. Denetim + Skullanarak sık sık kaydedin.
- Vasküler ağın etiketlemi tamamlandığında, ana TrakEM2 penceresine sağ tıklayın ve Etiket Olarak Dışa Aktar > Alan Listelerini (tif) seçin. Açılan pencerede Ölçek %100'ü seçin ve Tüm alan listesini dışaaktarın. TrakEM2 pencerelerini kapatın ve Projeyi Kaydetiçin evet'i seçin.
- Alan Listeleri'nin görüntüsü açılır ve boş siyah bir resim olarak görünebilir. Ana FIJI Menüsünde Resim > Ayarla > Parlaklık/Kontrast'ıseçin. B&C penceresinde otomatik düğmeye basın ve AreaList görünür hale gelecektir. Ana FIJI menüsünde Resim > Arama Tabloları > İnvert LUT'useçin. Siyah etiketlerin bu görüntüsünü beyaz arka plana kaydedin ve görüntüyü kapatın.
- FIJI'deki etiketler dosyasını açın. Eklentiler > İskelet > İskelet 'iseçin. Bir tif olarak iskeletleştirilmiş görüntü kaydedin. STAFF akış analizini çalıştırmak için gereken giriş dosyalarından biri olarak skeleton.tif dosyasını kullanın. Dosyayı kaydederken, dosya adında boşluk kullanmayın.
- İskelet dosyasını gerektiğinde, örneğin vaskülatürdeki dalların görüntü düzleminden çıktıkları için yakalanmadığı yerlerde ki çizgi çizimine (boya aracınıkullanarak) boşluk yerleştirerek el ile düzenleyin.
4. Film Dizisini PERSONEL Analizine Hazırlayın
- Dosya > Dosya > Dosya > İçe Aktar > Görüntü sırasınıkullanarak FIJI'deki film dosyasını açın. Akış analizi için görüntü dizisinin bir zaman dilimini seçin (saniyeden dakikaya, yüzlerce ila on binlerce kare) doku pozisyonunun solunum sırasında hariç zaman içinde sabit kaldığı bir zaman dilimi seçin.
- Resim > Başlangıç ve bitiş karelerinin numaralarını yazarak dizinin seçili kısmını kopyala ve yineleyin. Görüntü > Özellikleri altında görüntü mekansal ve zamansal kalibrasyonu kontrol edin ve gerekirse düzeltin. Resim dosyasını TIF (veya sıkıştırılmamış AVI olarak) olarak kaydedin. Bu movie.tif PERSONEL analizi çalıştırmak için bir giriş dosyası olarak gereklidir. Dosya adına boşluklar eklemeyin.
5. PERSONEL Makrolarını FIJI'ye Yükleyin
NOT: (Önemli) FIJI klasör alt dizinleri içinde birden çok klasör benzer dosya adları var, bazı büyük harf, bazı değil. STAFF'ı yüklerken doğru klasörlerin seçildiğinden emin olun.
- https://github.com/icbm-iupui/STAFF'dan PERSONEL makrolarını indirin.
-
Yüklemek için önce FIJI klasörünü açın.
- Windows'da, FIJI'nin kullanıcı alanında, en sık masaüstünde yüklü olduğu klasörü bulun. MacOS'ta Uygulamalar klasöründe FIJI simgesini bulun, sağ tıklayın ve Aç'ıseçin.
- FIJI klasöründe eklentiler klasörünü açın. Eklentiler klasöründe Makrolar klasörünü açın. STAFF.ijm'i bu Makrolar klasörüne kopyalayın: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
- FIJI klasöründe eklentiler klasörünü açın. STAFF_Dir.jar'ı bu eklentiler klasörüne kopyalayın: Fiji\eklentileri\STAFF_Dir.jar.
- FIJI klasöründe makrolar klasörünü açın. Bu makrolar klasöründe AutoRun klasörünü açın. STAFF_Loader.ijm'i bu AutoRun klasörüne kopyalayın: Fiji\macros\AutoRun\STAFF_Loader.ijm.
- FIJI'yi başlatın ve makro yüklemeyi doğrulayın. Yüklemeyi doğrulamak için Eklentiler > Makrolar'ıseçin. Doğru yüklendiğinde açılır menü şunları içerecektir: Proje aç, İskeleti Analiz Et, Zaman Aralıklarını Edin, Akışı Analiz Et ve Uzamsal Harita Üret.
- Makrolar menüsünde bu komutlar yoksa, Eklentiler > Makrolar > Yükle,Fiji\eklentileri\Makrolar klasörünü açın, STAFF.ijm dosyasını seçin ve ardından Tamam düğmesini tıklatın. Komutlar artık Eklentiler > Makrolar menüsünde görünmelidir.
6. PERSONEL Kullanarak Vasküler Akış Ölçme
- Yeni bir proje oluşturun.
- Eklentiler > Makrolar > Proje Aç'ı seçin ve yapılandırma dosyası oluşturmak veya güncelleştirmek için istemleri izleyin.
- Proje Aç menüsünden Proje Dizini, Giriş Dosya Klasörü ve Movie.tif ve Skeleton.tif giriş dosyalarına gidin ve seçin. Gerekirse otomatik doldurulan çıktı dosya adlarını edin.
- En kısa segment uzunluğu (20 μm), ölçülen maksimum hız (2.000 μm/s) ve maksimum hız eşlenen (1.000 μm/s) için giriş değerleri.
NOT: En kısa segment uzunluğuve saniyede çerçevelerin ürünü teorik olarak ölçülebilen maksimum akış hızını verir. Literatürde bildirilen en yüksek kılcal akış hızları yaklaşık 2.000 μm/s15'tir. Karaciğerde kılcal akış hızlarının genellikle ortalama 300 m/s civarında olduğunu ve nadiren 1.000 μm/s'yi aştığını gözlemledik. - Görüntü dizisi için piksel boyutu ve kare hızı (görüntü meta verileri veya deneysel notlardan) için değerleri yazın. Bu değerler kullanıcı girişi gerektirir. Görüntülerin periyodik arka plan yoğunluğu titremesi varsa Titreme Düzeltme kutusunu işaretleyin.
- Verilerin en iyi görselleştirilmesi için parametreleri seçin. Verilerin renk skalasının tüm aralığında eşlenerek verilerin yaklaşık %95'ini içerecek şekilde eşlenen maksimum hızı seçin. STAFF, renk skalasının yüksek hızlı sonuna kadar yüksek hızlı aykırılıkları eşler.
- İskeleti analiz et.
- Eklentiler > Makrolar > İskeleti Çözümle'yi seçin. Skeleton.tif dosyası açılacak ve İlgi Alanı (YG) Yöneticisi açılacak ve çalışacaktır.
NOT: İskelet çözümle, her pikseli komşu sayısına göre bir bitiş noktasında, bir kavşakta veya bir segment içinde olarak sınıfa göre sınıflandırın. Her kesim için tanımlayıcı bir sayı (kimlik numarası), kalibre edilmiş bir dal uzunluğu ve dal uçlarının uzamsal koordinatları kaydedilir. - Segment iD'lerinin iskelette görünmesini, segment listesinin YG yöneticisinde görünmesini ve iskelet için YG Yöneticisi dosyasının kaydettiğini belirten bir açılır pencereyi bekleyin. Tamam'ıtıklatın.
- Solunum hareketleri arasında iskeletin kırmızı kan hücrelerinin kılcal damardan geçtiği yerde kaldığını doğrulayın (örn. kenar değil ve kılcal damarın dışında değil). Film dosyasını açarak ve ardından YG zip dosyasını açık filmin üzerine sürükleyerek, etiketli segmentleri film üzerinde bir kaplama olarak görüntüleyin. Bölümleri kaplaid ile film oynayın.
- Eklentiler > Makrolar > İskeleti Çözümle'yi seçin. Skeleton.tif dosyası açılacak ve İlgi Alanı (YG) Yöneticisi açılacak ve çalışacaktır.
- Zaman aralıklarını seçin.
- Eklentiler > Makrolar > Zaman Aralıklarını Seçin. Makro, filmin toplam süresi boyunca tek bir segmentten bir kymograph oluştururken bekleyin. Bu kymograph itibaren, kullanıcı analiz için zaman aralıkları seçer. Gerekirse kymograph boyutunu artırmak için Kontrol + + tuşları kullanın.
- Dikdörtgen seçim aracı otomatik olarak etkinleştirilir. Her zaman aralığı etrafında bir dikdörtgen çizin. Zaman aralığı uzunluğu için iyi bir başlangıç noktası, mimografta yatay bulanık bölgeler olarak görünen solunumlar arasındaki 1-2 s aralığıdır.
- Zaman aralığı seçimlerini kaydetmek için YG yöneticisindeki T tuşuna veya Ekle düğmesine tıklayın. İstenildiği kadar zaman aralığı için tekrarlayın. Seçimleri kymograph'ın üstkısmından (veya solundan) alt (veya sağ) sırayla yapın.
- Az sayıda zaman aralığı (3-4) seçerek ve yalnızca bu aralıklar için çözümlemesi tamamlayarak parametre seçeneklerini (Open-Create Project'ten) değerlendirin, çünkü Analyze Flow (bir sonraki adım) büyük veri kümeleri için saatler sürebilir.
- Bittiğinde her zaman aralığı penceresi için Yatırım Getirisi Yap'da Tamam'ı tıklatın. Seçili aralıklar Proje Klasörü'nekaydedildiğinde açılır pencere görüntülenir. Tamam'ıtıklatın.
- Akışı analiz et.
- Eklentiler > Makrolar > Akış Analiz et ve Çözümle Akış Parametreleri diyalog kutusunu açar ve Proje Aç adımında girilen değerleri görüntüler. Gerekirse edit Sonra Tamam'ıtıklatın.
- Çıktı Dosya Adları iletişim kutusunu açar ve Proje Aç adımında girilen adları görüntüler. Gerekirse edit Sonra Tamam'ıtıklatın.
- Kullanıcının çözümlemeye başlamaya hazır olup olmadığını soran bir diyalog kutusu açılır. Tamam'ı tıklatın ve çözümleme başlayacak. Akış Çözümlemesi'nin ne zaman tamamlanır olduğunu belirtmek için açılan bir iletişim kutusunu bekleyin.
NOT: Gereken süre işlemci hızına ve veri kümesinin boyutuna bağlıdır. - Sonuç dosyalarının Project Klasöründe .csv biçimi elektronik tablo dosyaları olarak depolandığını doğrulayın.
NOT: Çıktı dosyaları şunlardır: segment_velocities.csv akış yönünü gösteren pozitif ve negatif değerlere sahip hız değerleri içerir. En düşük uzunluktan daha az kesimleri temsil eden hücreler, KıSA metin içerir. Hız değerleri maksimum ölçülen hızdan daha büyük hücreler OUT (outlier için) metni içerir. kym_ang.csv, FIJI'deki Yönlülük eklentisi ile ölçülen kymograph açıları içerir. good_fit.csv her kymograph ölçülen açıların dağılımı için bir eğri uygun iyilik içerir. Sığdırma kötü iyilik (< 0.8) bir segmentteki gizli dal noktalarını gösterebilir, zaman aralığında hız değişimi, lamba veya oda ışığı titremesi. - segment_velocities.csv'nin birkaç OUT değeri içerdiğini doğrulamak için denetleyin. Çok sayıda OUT değeri varsa, çözümlemek için en az segment uzunluğunun 15-20 μm'den az olmadığını doğrulayın, ardından Analyze Akışını yeniden çalıştırın. Yeni segment_velocities.csv hala OUT değerlerinin büyük bir kısmını içeriyorsa, titreme düzeltme kutusunu işaretleyin, ardından Analyze Flow'u yeniden çalıştırın.
- Uzamsal haritalar üretin.
- Eklentiler > Makrolar > Uzaysal Harita Oluştur'u seçin ve Proje Aç adımında girilen değerleri görüntüleyerek Uzamsal Harita Parametreleri penceresi açılır. Gerekirse edin veya Tamam'ıseçmeye devam edin.
- Akış hızlarının uzaysal haritaların zamansal bir dizi akış hızını gösteren renk ile oluşturulur gibi izleyin. Çıktı, her zaman aralığı için bir görüntüiçeren bir .tif görüntü yığını biçimindedir. Akıştaki uzamsal ve zamansal değişimi görselleştirmek için .tif yığınında ilerleyin. Yığını bir film olarak paylaşmak üzere AVI dosyası (maksimum taşınabilirlik için sıkıştırılmamış) olarak kaydedin.
7. PERSONEL Çıktısını Kullanarak Nicel Analiz
- segment_velocities.csv dosyasını elektronik tablo veya istatistiksel analiz programında açın. Bu değerler, o kesimin başlangıç/durdurma noktalarına göre akış yönünü gösteren pozitif veya negatif işarete sahiptir (Segment YG dosyasında kaydedilir).
- Tüm hız değerlerinin mutlak değerlerini içeren yeni bir elektronik tablo sayfası yapın. Genel ortalama akış hızını, zaman içindeki tüm vasküler segmentler için ortalama akış hızını, zaman içindeki her vasküler segment için akış hızını hesaplamak ve hız dağılımlarının histogramlarını yapmak için bu değerleri kullanın.
- Önce etiketli iskeletteki belirli ilgili segmentleri bularak ve daha sonra bu seçili segmentler üzerinde analizler yaparak belirli morfolojik bölgeler veya diğer ilgi alanları etrafındaki değerleri hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PERSONEL analizi, saniyeden dakikaya kadar uzanan süreler boyunca tüm mikroskop alanlarında mikrovasküler hızların tam bir sayımını oluşturur. Temsil sonuçları Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4'tesunulmuştur. Şekil 1, bir farenin karaciğerindeki mikrovasküler ağın bir zaman serisi, mikrovasküler akış eksenini tanımlamak için kullanılan iskeletleştirilmiş görüntünün oluşumu ve sayısallaştırma için tanımlanan bireysel vasküler segmentlerin PERSONEL tarafından oluşturulan haritasını gösterir. STAFF daha sonra mikrovasküler ağı tek tek parçalara ayırmak için iskeletleştirilmiş görüntüyü kullanır, sonra her segment için kymographs görüntüleri oluşturur. Bu görüntüler, kymograph analizinde kullanılacak zaman aralıklarını belirlemek için araçlarla birlikte kullanıcıya sağlanır (Şekil 2). PERSONEL daha sonra iskeleti ve kullanıcı tarafından sağlanan zaman aralıklarını her segmentin kymograph'ını ayrı segment-zaman aralıklarına ayırmak için kullanır. PERSONEL daha sonra her segment-zaman aralığından kymograph baskın açı tanımlar ve hız ölçümleri sağlar .csv veri dosyaları olarak(Şekil 3) ve renk kodlu hız harita görüntüleri yığınları şeklinde (Şekil 4). Personel, veri analizi boru hattının araştırılmasını desteklemek için tüm kymograph açısı ölçümlerini ve uygunluk açısından uygun değerler içeren .csv dosyaları da sağlar.
Şekil 1: Vasküler iskeletin oluşturulması. (A) Yaşayan bir farenin karaciğerinden toplanan zaman serisi görüntülerinden tek bir çerçevenin orijinal görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Sinüzoid akımının ana yönlerini belirlemek için merkezi damarlar (CV) ve portal triadları (PT) ile Panel A'da gösterilen görüntü gösterilir. (C) Sinüzoidlerin TrakEM2 segmentasyonunun bindirmeli A Panelinden görüntü. (D) TrakEM2 segmentasyonunun ikili görüntüsü. (E) TrakEM2 segmentasyonunun iskeletleşmesi. (F) Etiketlerle bireysel vasküler segmentlerin PERSONEL çıkış görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kymograph analizi. (A) Şekil 1F'degösterilen vasküler segmentlerin büyütülmüş görüntüsü . (B) Bir segmentten tipik kymograf iki solunum yolu arası zaman aralığında toplanır. Solunum süreleri oklarla belirtilir. (C) A panelinden 240, 252 ve 254 segmentleri için kymographs Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Hız veri analizi. (A, B) 19 zaman aralığındaki dört parçanın hız ölçümlerinin tabloları ya yön(A)ile hız olarak ya da mutlak hız(B)olarak ifade edilir. (C) Histogram tüm 20 s zaman dilimi boyunca tüm alan genelinde mutlak hız değerlerinin dağılımını gösteren. (D) Kymografları Şekil 2C'de 20'li dönemin tamamında gösterilen üç segmentin hızlarının grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hız haritası. (A) Şekil 1'degösterilen alan için tek bir zaman aralığı için renk kodlu hız haritasının PERSONEL çıkış görüntüsü . (B) 3B hacim olarak sunulan tüm zaman aralıkları için hız haritalarının bileşimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde birden çok kritik adım vardır. İlk olarak, karaciğerintravital görüntüleme sırasında hareket en aza indirilmesi PERSONEL kullanarak kılcal akış analizi için kullanılabilir filmler üretmek için gereklidir. Diyaframın yakınlığı nedeniyle, solunuma bağlı kısa süreli hareket oluşur ve güvenli karaciğer her nefesten sonra ilk pozisyonuna geri döner. Gazlı bez kullanarak kapak dipli çanak karşı cerrahi maruz karaciğer güvenliğini, daha sonra ters mikroskop kullanarak aşağıdan görüntüleme solunum arasında organ immobilize etmek için hizmet vermektedir16,17,18,19. İkinci olarak, 100 fps'lik bir görüntü edinme hızı şiddetle tavsiye edilir, çünkü ölçülebilen akış hızı görüntü edinme hızının bir fonksiyonudur ve akış11olarak ölçüldüğü segmentlerin minimum uzunluğudur. Üçüncü olarak, yüksek kaliteli bir iskelet üreten, vasküler ağ çizgi çizim temsili, STAFF kullanarak kılcal akış hızları elde bir sonraki kritik adımdır. İskelet çizgi segmentleri analiz edilen zaman içinde solunumlar arasındaki vaskülatürorta noktasına yakın yatmalı ve görüntü düzleminden vasküler dallanma tespit edilmelidir. Bir vasküler segment boyunca bu gizli dalların yerleri film izleyerek, kymograph inceleyerek veya o segment için zaman içinde hız değerleri inceleyerek çıkarılabilir. Filmi inceleyen bu vasküler segmentler ya çift yönlü akışa sahip olarak, görünmeyen dalanın bulunduğu yere doğru yayılan ya da görünmeyen şubenin bulunduğu yere yakınlaşan ya da vasküler segment boyunca o noktada akış hızında ani bir değişim olarak görülürler. Gizli dal noktalarının konumu kymographs akış yönü veya hız değişikliği tarafından üretilen açı değişikliği konumu olarak tanımlanabilir. Elektronik tabloda, gizli dal konumlarına sahip vasküler segmentler, gönderen iki segmentin değerleri arasında doğruyönde (işaret) veya değişiklik yapabilir. Zaman serisi görüntü düzleminin dışında çok fazla dal noktası içeriyorsa, PERSONEL analizi, gözden kaçırılan dal noktalarının konumlarındaki çizgi çizimine bir boşluk (boya aleti kullanılarak) yerleştirilerek iskeleti elle düzenledikten sonra tekrarlanmalıdır.
Biz genellikle fark edilmeden gider ama STAFF kullanarak akış hızları ölçme üzerinde güçlü bir etkisi vardı görüntü edinimi ortak bir sorun ortaya çıkardı. Görüntü ediniminde, epi-illumination lamba ışık kaynağının yoğunluğunda veya mikroskop odasındaki alan aydınlatmasında kararsızlık veya "titreme" oluşabilir. Her iki kaynaktan da, titreme dönemi ile zaman içinde açık/koyu bantlama kymographs sıfır açıda oluşur. Eğer sıfır açı zirvesi ana tepe ise, akış hızının ölçüldüğü damardan kırmızı kan korpuslarının hareketi ile üretilen açı insan gözüne açık olsa bile, yönlülük eklentisi sıfır noktasına bir eğri sığar ve sıfır dereceye çok yakın bir değer rapor eder ve bu da gerçekçi olmayan derecede yüksek hız ölçümlerine neden olur. Sıfır açı lı tepe ana tepe olmasa bile, bildirilen hızın daha yüksek bir değere kaydığı yön eğrisini etkileyecektir. Bu sorunu gidermek için STAFF, 0°'de oluşan tepe açılarını yok sayan bir "Titreme düzeltme" seçeneği sunar. Bu modifikasyon hız niceliklerini etkilemeden lamba titremesinin etkilerini ortadan kaldırdı.
Geniş alan mikroskobu kullanılarak akış hızlarının elde edilmesinin temel sınırlaması, görüntü ediniminin mezenterik vaskülatür veya zebrabalığı intersegmental damarları veya karaciğer veya dışa doğru dışa doğru böbrek.
Flow quantification mevcut yöntemler üzerinde STAFF kullanarak önemli bir avantajı vasküler akış mekansal ve zamansal desenlerin hızlı ve tarafsız tespiti sağlar. Toplama ve raster tarama sistemleri kullanarak mikrovasküler akış verilerinin analizi genellikle bir seferde tek kullanıcı seçilmiş kılcal damarölçümleri ile sınırlıdır20,21,22,23. 24,25,26alanları arasında akış hızları ayıklamak için yöntemler var, ancak bu yaklaşımların hiçbiri tüm alanlarda analizi desteklemek ve tüm emek yoğun. STAFF kullanılarak, on binlerce görüntüiçeren bir veri kümesinin tüm görüntü alanı boyunca zaman içindeki her kılcal segmentinin analizi bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Tam alan vasküler akış bile tek bir veri kümesinin manuel analizi aylar ila yıllar sürer. Bu nedenle, manuel analiz normal akış karakterizasyonu için bile pratik değildir ve açıkça birden fazla tedavi gruplarının karşılaştırılmasına izin vermez.
Vasküler akışın spatiotemporal desenlenmesinin PERSONEL niceliklerinin kolaylığı, gelecekteki kullanıcılara damar selektif akış hızı desenlemesi üzerindeki etkilere vasküler morfolojik gözlemleri bağlama fırsatı sağlar. Damar çaplarının vasküler morfoloji silemleri ile ağ topolojisi arasındaki ilişkiyi tanımlayarak akış hızı desenle daha sonra vasküler morfolojiden akış desenlerini tahmin edebiliriz. Benzer şekilde, vasküler akış desenleme ve vasküler morfolojiile zamanlanma, lokalizasyon ve immün hücre infiltrasyonunun kapsamı, toksik maruziyet veya hastalıktan kaynaklanan doku hasarı veya hücre içi taşıma durumu gibi olaylarla ilişkilendirilmesi, bize sağlık ve hastalık akış desenleme ve hücresel fonksiyon daha iyi bir anlayış, ama aynı zamanda özellikle zararlı patofizyolojik senaryoları belirlemek için bir çerçeve sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları rapor.
Acknowledgments
Burada sunulan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH U01 GM111243 ve NIH NIDDK P30 DK079312) tarafından desteklenmiştir. Indiana Biyolojik Mikroskobu Merkezi'nde intravital mikroskopi çalışmaları yapılmıştır. Dr. Malgorzata Kamocka'ya mikroskopi konusunda teknik yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
