Summary
Verhoogde ruggenmergvloeistof eiwit niveaus kunnen ofwel het resultaat van diffusie van plasma eiwit over een veranderde bloed-hersen barrière of intrathecale synthese. Een geoptimaliseerd testprotocol wordt in dit artikel gepresenteerd dat helpt om beide gevallen te discrimineren en kwantitatieve metingen van intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten verschaft.
Abstract
Cerebrospinale vloeistof (CSF), een vloeistof gevonden in de hersenen en het ruggenmerg, is van groot belang voor zowel de basis-als de klinische wetenschap. De analyse van de CSF-eiwit samenstelling levert cruciale informatie in fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek en neurologische ziekten. Een voorbehoud is dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en transudatie uit serum, en eiwitanalyse van CSF kan alleen de som van deze twee componenten bepalen. Om onderscheid te maken tussen eiwit transudatie uit het bloed en intrathecaal geproduceerde eiwitten in diermodellen en bij mensen, de metingen van het CSF-eiwit profiel met behulp van conventionele eiwitanalyse hulpmiddelen moeten de berekening omvatten van het albumine CSF/serum quotiënt (Q-albumine), een marker van de integriteit van de bloed-hersen interface (BBI) en de eiwit index (q-eiwit/q-albumine), een schatting van intrathecale eiwitsynthese. Dit protocol illustreert de gehele procedure, van CSF en bloedinzameling tot quotiënten en indices berekeningen, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese en de beperking van BBI in muismodellen van neurologische aandoeningen.
Introduction
Cerebrospinale vloeistof (CSF), een heldere en kleurloze vloeistof rond de hersenen en het ruggenmerg, houdt grote klinische en fundamentele wetenschappelijke betekenis. De CSF behoudt de elektrolytische omgeving van het centrale zenuwstelsel (CNS), balanceert de systemische zuur-base status, levert voedingsstoffen aan neuronale en gliale cellen, functioneert als een lymfatisch systeem voor het CZS, en vervoert hormonen, neurotransmitters, cytokines en andere neuropeptiden in het CZS1. Dus, aangezien de CSF-samenstelling de activiteit van het CZS weerspiegelt, biedt deze vloeistof een waardevolle, hoewel indirecte, toegang om de fysiologische en pathologische toestand van het CZS te karakteriseren.
CSF is gebruikt voor de diagnose van aandoeningen die invloed hebben op het CNS voor meer dan honderd jaar, en voor de meeste van deze tijd, het werd voornamelijk bestudeerd door clinici als een diagnostisch instrument. In de afgelopen jaren hebben neuro biologen echter het potentieel van CSF erkend voor het bestuderen van de pathofysiologie van het CZS. In het bijzonder zijn er verschillende eiwitanalyse hulpmiddelen met hoge doorvoer geïntroduceerd in het neurowetenschaprijk, waardoor een gedetailleerde studie van de eiwit samenstelling van het CSF mogelijk is, met de verwachting dat deze analyse kan helpen om inzicht te geven in de dynamische veranderingen die zich binnen het CZS voordoen.
Technologische ontwikkelingen in multiplex immunoassay technieken zoals luminex en simoa Technologies2,3, bieden onderzoekers vandaag de mogelijkheid om honderden eiwitten te detecteren bij zeer lage concentraties. Bovendien maken deze zelfde technologieën het gebruik van kleine monsterhoeveelheden mogelijk, waardoor studies bij kleine dieren, waaronder muizen, worden bevorderd, waarbij beperkte monstervolumes van CSF tot voor kort de gedetailleerde kenmerken van de vloeistof hebben uitgesloten.
Niettemin is een voorbehoud dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en/of transudatie uit het serum als gevolg van een beschadigde bloed-hersen interface (BBI). Helaas, eiwitanalyse van CSF alleen kan alleen de som van deze twee componenten te bepalen. Om onderscheid te maken tussen transudaat en intrathecaal geproduceerde eiwitten, moeten de CSF-eiwit metingen met behulp van een beschikbare proteïne-Analysetool worden aangepast voor individuele variabiliteit in serumconcentraties en barrière-integriteit. Hoewel deze aanpassing vaak wordt gebruikt in de klinische praktijk, bijvoorbeeld de CSF IgG-index, die een hoge gevoeligheid heeft voor het opsporen van intrathecale IgG-synthese4,5,6, hebben tot op heden zeer weinig onderzoeken de CSF-eiwit concentraties gecorrigeerd voor de serumconcentratie en barrière-integriteit7,8.
Momenteel is de Reibergram aanpak de beste manier om de barrièrefunctie en intrathecale synthese van eiwitten te bepalen. Het is een grafische evaluatie in CSF/serum quotiënt diagrammen die, op een geïntegreerde manier, zowel de barrière (dys) functie en intrathecale eiwitsynthese analyseert, verwijzend naar een uitsluitend bloed-afgeleid eiwit9,10. De zeer overvloedige eiwit albumine wordt meestal gekozen als referentie-eiwit omdat het alleen in de lever wordt geproduceerd en omdat de grootte, ongeveer 70 kDa, intermediair is tussen kleine en grote eiwitten11. Het analyseschema werd voor het eerst gedefinieerd door Reiber en Felgenhauer in 1987 voor de belangrijkste klassen van immunoglobulinen (IGS)11, empirisch gebaseerd op de resultaten verkregen uit de analyse van duizenden menselijke monsters9. De aanpak werd vervolgens bevestigd door de toepassing van de twee Fick-wetten van diffusie in de theorie van de Moleculaire diffusie/debiet12. Een dergelijke theorie toont aan dat de diffusie van een eiwit door de barrière een hyperbolische verdeling heeft en de dynamiek van eiwitten in het CZS9,13kwantificatief kan verklaren. Over het algemeen is het voordeel van het gebruik van het Reibergram voor het aantonen van intrathecale eiwitsynthese dat het gelijktijdig de eiwitfractie identificeert die de CSF uit het serum binnenkomt, evenals de hoeveelheid eiwit die in het CSF wordt aangetroffen vanwege lokale productie.
Het huidige artikel en het bijbehorende protocol beschrijven de hele procedure, van CSF en bloedafname tot de uiteindelijke berekeningen die de GSK-eiwit niveaus corrigeren, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese in muismodellen van neurologische Aandoeningen. Deze procedure vormt een basis voor de beoordeling (1) van de pathofysiologische oorsprong van elk CSF-eiwit en (2) de stabiliteit en de functionele betekenis van de barrière-integriteit. Deze procedure en het protocol zijn niet alleen nuttig voor het beoordelen van muis CSF-voorbeelden, maar zijn ook nuttig bij het analyseren van CSF in een veelheid van diermodellen van neurologische ziekten en menselijke patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle werk van dieren maakt gebruik van protocollen die zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Geisel school of Medicine bij Dartmouth.
1. inzameling van vloeistoffen
Opmerking: zowel serum als CSF zijn vereist. Voor overleving en obductie zijn twee protocollen voor elke vloeistof verzameling nodig.
- Serum en CSF-inzameling met behulp van overlevings procedures
Opmerking: voor de collectie Survival Fluid moet de serum verzameling voorafgaan aan de CSF-collectie omdat het een minder invasieve procedure is. Het CSF moet binnen één week na de serum trekking worden verkregen.- Retro-orbitale bloeden procedure voor serum collectie.
Opmerking: deze procedure is voor overleving bloeden van muizen14. De beschreven procedure geldt voor elke leeftijd, geslacht en stam van muizen. Aangezien de IACUC-regels bepalen dat een maximaal bloed volume van 1% van het lichaamsgewicht kan worden verwijderd als een enkelvoudige bloed uittrekking, wordt aanbevolen de procedure alleen te laten uitvoeren op muizen die meer dan 15 g wegen.- Verplaats de kooien met muizen van het rek naar een geschikt werkgebied. Bereid de anesthesie gasmachine door het inschakelen van de zuurstof debietmeter 1 L/min.
- Plaats het dier in de inductie kamer en sluit het deksel strak. Zet de Isofluraan vaporizer aan tot 3,5% en bewaak het dier totdat het is teruggebogen.
- Verwijder het dier uit de kamer en beoordeel het niveau van de anesthesie door pedaal reflex, d.w.z. stevige voetpad knijpen. Zorg voor voldoende diepte van anesthesie voordat u de procedure: gebrek aan reactie op een stevige knijp geeft voldoende anesthesie.
- Restrain de verdoofd Mouse door het grijpen van de losse huid achter de oren met de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand. Bult de ogen met behulp van de wijsvinger om terug te trekken van de huid boven het oog en de duim terug te trekken van de huid onder de ogen.
- Plaats de punt van een Pasteur-pipet in het oogcontact onder de oogbol (Figuur 1, linkerpaneel) en zet de punt op ongeveer 45 ° naar het midden van het oogcontact (Figuur 1, rechter paneel). Draai de pipet tussen de vingers tijdens de voorwaartse passage. Breng zachte druk aan en laat vervolgens los totdat er bloed in de pipet komt.
Opmerking: maximale hoeveelheid bloed die in één keer uit deze locatie kan worden gehaald, is ongeveer 1% van het lichaamsgewicht, bijvoorbeeld 0,2 mL van een 20 g muis. - Verwijder voorzichtig het capillair om letsel aan het oog te voorkomen en plaats het verzamelde bloed in een centrifugebuis van 1,5 mL. Sluit het ooglid en breng milde druk met gaas aan om verdere bloedingen te voorkomen. Eenmaal volledig alert en mobiel (meestal 3 − 5 min), keert u de muis terug naar de vasthoud kooi.
- Laat gedurende 30 − 60 minuten bloed stollen bij kamertemperatuur (RT) en centrifugeer bloed gedurende 10 minuten bij 2.000 x g in een gekoelde centrifuge van 4 °c. Gebruik een schone pipet techniek en verzamel serum in een nieuwe, gelabelde 0,5 mL injectieflacon. Onmiddellijk invriezen flacon serum bij-80 °C.
- CSF-collectie met overlevings procedure
Let op: deze procedure is voor een overlevings operatie, en is gebaseerd op het Protocol gepubliceerd door Liu en Duff in 200815. De muizen worden geanesthetiseerd door een ketamine (20 mg/mL), xylazine (0,5 mg/mL) en Acepromazine (0,5 mg/mL) cocktail toegediend intraperitoneaal.- Verplaats de kooien met muizen van het rek naar een aangewezen operatie werkgebied. Bereid operatieruimte voor in een steriele omgeving. Zorg ervoor dat alle gebruikte instrumenten en materialen voor de operatie gesteriliseerd worden.
- Weeg de muis en bereken de anesthesie volume nodig (0,1 mL anesthesie cocktail voor een 20 g muis). Injecteer anesthesie intraperitoneaal16. Na een paar minuten, test de muis door het voetpad te knijpen om voldoende anesthesie te garanderen. Als er meer verdoving nodig is, Injecteer dan verder 0,01 − 0,03 mL van de verdovings cocktail.
- Gebruik ofwel een schaar of een scheerapparaat om een klein gedeelte van het hoofd te scheren, op het caudal einde, mediaal op de schedel, om groot genoeg werkgebied voor de CSF-collectie bloot te leggen. Plaats de muis in de liggende positie op het stereotaxsch instrument en zet het hoofd stabiel met behulp van oorstangen (Figuur 2a).
Opmerking: de muis is zo vastgelegd dat het hoofd een hoek van bijna 135 ° vormt met het lichaam (Figuur 2a). Zodra het dier is gepositioneerd, wordt een chirurgische draperen gebruikt om een steriel veld op de chirurgische plaats te behouden. Doorzichtige lijm gordijnen hebben de voorkeur voor de CSF-collectie in muizen, omdat ze directe en meer gerichte visualisatie van het dier mogelijk maken. - Veeg de operatieplaats met 30% chloorhexidine DIACETAAT. Met behulp van een steriele scalpel, maken een sagittale incisie van de huid inferieur aan de achterhoofdsknobbel om de spieren boven de Cisterna magna bloot.
- Door botte dissectie met Tang, scheid het subcutane weefsel en de spieren om de Cisterna magna bloot te leggen (Figuur 2b). Gebruik microretractors om de spieren uit elkaar te houden (Figuur 2b) en stel de dura mater Meningeale laag bloot aan de Cisterna magna.
- Was voorzichtig met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om mogelijke bloed verontreiniging te verwijderen. DEP de dura mater droog met een steriel wattenstaafje en prik het membraan dat de Cisterna magna bedekt met een 30 G naald zachtjes door. Voeg snel en voorzichtig een kleine glazen capillaire buis voor het verzamelen van CSF (figuur 2c).
Opmerking: intracraniële druk zorgt ervoor dat CSF spontaan in het capillair stroomt (figuur 2c). Afhankelijk van de leeftijd en de grootte van de muis wordt ongeveer 5 − 12 μL CSF van elke muis verkregen. - Verwijder voorzichtig de capillaire buis van het membraan. Verbind de buis met een 3 mL spuit door een polyethyleen slang (tabel van materialen) en Injecteer de verzamelde CSF in een gelabelde 0,5 ml tube (figuur 2D). Bewaar de injectieflacons in ijs.
- Sluit incisie met behulp van polydioxanon hechtmiddel (PDS) met wegwerp naald en met behulp van begraven hechtingen17. Reinig het gebied van een gedroogd bloed of weefsel.
- Injecteer muizen, subcutaan of intraperitoneaal16, met 0,05 − 0,1 mg/kg buprenorfine hydrochloride als analgetische behandeling. Injecteer ook subcutaan 1 mL steriele zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de muis terug in een schone en warme kooi voor herstel. Zodra de muis is mobiel en in staat om voedsel en water te bereiken, plaats de kooi terug op het rek.
- Centrifugeer CSF gedurende 10 minuten bij 1.000 x g in een gekoelde centrifuge van 4 °c. Controleer de mate van bloed verontreiniging door visuele inspectie voor de identificatie van xanthochromie en de aanwezigheid van een rode pellet in de bodem van de buis. Gooi bloed vervuilde monsters weg.
Opmerking: de formule die wordt gebruikt voor de correctie van CSF-eiwit bedragen in met bloed besmette specimens is gebaseerd op vergelijkings parameters die het eiwitgehalte in CSF en serum bevatten, hematocriet (HCT) en rode bloedcellen (RBC) tellen in CSF en Blood18. Een dergelijke correctie strategie kan echter niet gemakkelijk worden toegepast op muizen CSF-specimens als gevolg van het geringe volume, waardoor de correctie strategie wordt beperkt tot een visuele inspectie. - Gebruik een schone pipet techniek en verzamel CSF in een nieuwe tube van 0,2 mL, die de pellet met cellen achterlaat. Verdun CSF 1:3 met PBS om het volumeverlies als gevolg van aërosol te verminderen. De injectieflacon met CSF onmiddellijk bevriezen bij-80 °C.
- Retro-orbitale bloeden procedure voor serum collectie.
- Serum en CSF-inzameling met behulp van niet-overlevings procedures
Opmerking: voor niet-Survival Fluid Collection, CSF Collection voorafgaat aan serum collectie als de muis moet een puls hebben.- CSF collectie bij obductie
Opmerking: deze procedure is voor niet-overlevings operaties en ongeveer 10 − 20 μL CSF wordt verkregen van elke muis. Een steriel chirurgische veld wordt aanbevolen, maar is niet vereist voor een niet-overlevings operatie.- Verplaats de kooien met muizen van het rek naar een comfortabele werkruimte. Volg de stappen 1.1.2.2 − 1.1.2.7 en 1.1.2.11 − 1.1.2.12 voor de CSF-collectie. Ga verder naar punt 1.2.2 voor serum verzameling.
- Bloedafname via intracardiale punctie (open aanpak)
Opmerking: de verwachte bloed volumes zijn ongeveer 3% van het lichaamsgewicht, bijvoorbeeld 0,6 mL van een 20 g muis.- Na de CSF-collectie zorgt u ervoor dat de muis nog steeds voldoende verdoiliseerd wordt door de voetpad te knijpen. Als er een reactie wordt waargenomen, dien dan een tweede dosis anestheticum toe. Als er geen reactie wordt waargenomen, gaat u verder.
- Plaats het dier op de rug en veeg de huid op de buik met 70% alcohol. Met chirurgische schaar, open de thoracische Holte en bloot het hart. Plaats een 25 G naald (bevestigd aan een 3 mL spuit) in de linker ventrikel en breng zachtjes een negatieve druk aan op de zuiger van de spuit. Trek de naald terug nadat het bloed is verzameld.
- Voer een secundaire methode van euthanasie zoals onthoofding of cervicale dislocatie om ervoor te zorgen dat het dier is overleden.
- Duw de zuiger van de spuit naar beneden en Injecteer het verzamelde bloed in een Injectieflacon van 1,5 mL. Laat bloed stollen voor 30-60 min bij RT en Centrifugeer het gedurende 10 min bij 2.000 x g in een gekoelde centrifuge van 4 °c.
- Gebruik een schone pipet techniek en verzamel serum in een nieuwe, gelabelde 0,5 mL injectieflacon. Onmiddellijk invriezen flacon serum bij a-80 °C vriezer.
- CSF collectie bij obductie
2. eiwitanalyse
- Gebruik een voorkeursmethode, bijvoorbeeld luminex-technologie, voor het kwantificeren van doel proteïne (s) en albumine in gecompenseerde serum-en CSF-specimens.
Opmerking: hier wordt een voorbeeld gegeven met magnetische luminex-technologie, maar vrijwel elke techniek die eiwit hoeveelheden meet, inclusief enzym-gebonden immunosorbens (Elisa's), kan worden toegepast op het huidige protocol. Idealiter worden CSF-en serummonsters uitgevoerd voor zowel albumine als doelwit eiwitten op hetzelfde platform. De testomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor cruciale stappen in het Protocol, zoals antigeen-kraal koppelings concentratie, serum-en CSF-monster verdunningen, de best passende standaard curven voor elke analyt en buffer samenstelling om niet-specifieke reactiviteit te verminderen. Als een commerciële Kit wordt gebruikt voor de meting van de proteïne (s), bijvoorbeeld de immunoglobuline isotyping Kit (Tabel met materialen) gebruikt om gegevens te verkrijgenFiguur 3, moeten de instructies van de fabrikant worden opgevolgd.- Na ontdooien en voorafgaand aan de analyse, centrifugeer CSF en serummonsters (2.000 x g gedurende 10 min) en gebruik het supernatant om verstopping van de filterplaten en/of sonde te voorkomen. Volg de testprocedure die met de kit is meegeleverd voor geschikte monster verdunningen. Anders, bepaal de juiste verdunning voor elke analyt en vloeistof. Monsters in PBS dienovereenkomstig verdunnen.
Opmerking: als er geen specifieke richtsnoeren of instructies zijn, moeten voor elke analyt en vloeistof verdunningen worden vastgesteld vóór de studie test, door de juiste verdunnings reeksen te bepalen die nodig zijn om concentratie ramingen te verkrijgen die binnen de meest betrouwbaar bereik van een standaard curve. Het kennen van de kenmerken van het te analyseren biologisch monster, bijvoorbeeld fysiologische en pathologische concentraties in de vloeistof, maakt het mogelijk verschillende verdunningen te proberen met monsters met een laag, gemiddeld en hoog analyt gehalte. Indien het verwachte aantal concentraties in de monsters a priori bekend is, kunnen de verdunningen worden geselecteerd na berekening van het aantal malen dat het monster moet worden verdund om binnen het gekozen standaard curve bereik te zijn.
Let op: door het berekenen van de verdunningsfactoren, vergeet niet dat CSF al is verdund 1:3. - Bereid een standaard curve voor elk eiwit van belang, bijvoorbeeld albumine en IgG zoals gebruikt voor het genereren van gegevens in Figuur 3, door middel van Serial verdunnen referentiestandaard eiwitten. Tijdens de bereiding van standaard curven, grondig mengen elke hogere concentratie voor het maken van de volgende verdunning.
Opmerking: ongeacht de gekozen methode van kwantificering is het essentieel om elke keer dat de test wordt uitgevoerd een standaard curve op te nemen om de eiwit (s) concentratie in monsters te schatten. De beste keuze voor een referentienorm is een gezuiverde, bekende concentratie van het eiwit van belang. Het bepalen van de specifieke verdunningen, evenals het aantal gegevenspunten en replicaties die worden gebruikt om de standaard curve te definiëren, is afhankelijk van de mate van niet-lineariteit in de standaard curve. - Selecteer de juiste met antilichamen gekoppelde magnetische kraal sets (tabel met materialen). Voor individuele flacons met kralen, sonicatie elke injectieflacon voor 30 s en Vortex gedurende 1 minuut. bereid een "werk kralen mengsel" voor door verdunning van de kraal voorraden tot een eindconcentratie van 50 parels van elke verzameling/μL in de test-/wasbuffer (PBS, 1% boviene serumalbumine [BSA]). Voeg 50 μL van de gemengde kralen toe aan elk goed in een vlakke bodem 96-well plate (tabel met materialen).
Let op: de fluorescerende kralen zijn lichtgevoelig. Daarom moeten zij gedurende de gehele procedure worden beschermd tegen langdurige blootstelling aan licht. - Diagram de plaatsing van achtergronden, standaarden en voorbeelden op een goed kaart werkblad.
- Voeg 50 μL assay/Wash buffer toe aan elke achtergrond, en 50 μL van elke standaard naar de putjes voor de standaard curve. Laad de 50 mL van elk verdund monster in de daarvoor bestemde putjes. Wikkel de plaat met folie en incuberen met agitatie (~ 800 rpm) op een plaat Shaker gedurende 30 min bij RT.
- Plaats de plaat op een handheld magneet (tabel met materialen) en rust de plaat op de magneet voor ~ 60 s om volledige instelling van magnetische kralen toe te staan. Verwijder goed inhoud door de plaat voorzichtig te decanteren en op de plaat te tikken op absorberende pads om restvloeistof te verwijderen.
- Was de plaat door deze uit de magneet te verwijderen, door 200 μL assay/Wash buffer toe te voegen, door te schudden voor ~ 30 s, en tot slot door deze aan de magneet te bevestigen. Herhaal het wassen 3x.
- Verdun het biotinyleerd detectie-antilichaam, d.w.z. het met biotine gelabelde antilichaam dat tegen de eiwithoudende gastheer wordt opgewekt, tot 4 μg/ml in de test-/wasbuffer. Voeg aan elke put 50 μL van het verdunde detectie-antilichaam toe. Bedek de plaat en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT op de plaat Shaker bij ~ 800 rpm. Plaats de plaat op de magneet en herhaal de stappen 2.1.6 en 2.1.7.
- Verdund phycoerythrin (PE)-geconjugeerde streptavidine (SAPE) tot 4 μg/mL in de assay/Wash-buffer. Voeg aan elk goed 50 μL verdunde SAPE toe. Bedek de plaat en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT op de plaat Shaker bij ~ 800 rpm. Plaats de plaat op de magneet en herhaal de stappen 2.1.6 en 2.1.7.
- Verwijder de plaat van de magneet en breng de parels in 100 μL van de test-/wasbuffer. Lees putten met een dubbel laser stroom-gebaseerd detectie-instrument waarmee de grootte van de intensiteit van de PE fluorescentie (FI) kan worden opgespoord.
Opmerking: het signaal, bijvoorbeeld, FI, is evenredig met de hoeveelheid doel antigeen die aan het oppervlak van de kralen is bevestigd. - Exporteer onbewerkte gegevens en creëer standaard curven door grafisch detectiesignaal FI versus standaard eiwit concentraties. Gebruik de standaard curve (s) om de concentratie van de analyt (s) in de monsters te berekenen.
Opmerking: albumine wordt bij voorkeur uitgedrukt in g/dL, terwijl eiwitten van belang bij voorkeur worden uitgedrukt in mg/dL.
- Na ontdooien en voorafgaand aan de analyse, centrifugeer CSF en serummonsters (2.000 x g gedurende 10 min) en gebruik het supernatant om verstopping van de filterplaten en/of sonde te voorkomen. Volg de testprocedure die met de kit is meegeleverd voor geschikte monster verdunningen. Anders, bepaal de juiste verdunning voor elke analyt en vloeistof. Monsters in PBS dienovereenkomstig verdunnen.
3. intrathecale index berekeningen
- Organiseer eiwitconcentratie waarden in een spreadsheet en analyseer de resultaten door de volgende formules toe te passen.
- Bereken Qalbumine:
Wanneer CSF-albumine en serumalbumine concentraties albumine zijn in respectievelijk GECOMPENSEERDE serum en CSF-specimens. - Bereken Q-eiwitten:
Wanneer CSF-eiwit en serumproteïne concentraties van doel proteïne (s) zijn in respectievelijk GECOMPENSEERDE serum en CSF-specimens. - Bereken de eiwit index:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit representatieve experiment was bedoeld om de intrathecale synthese van IgG te vergelijken in twee klinisch relevante knaagdieren modellen van multiple sclerose (MS): de PLP139-151-geïnduceerde recidief experimentele auto-immune encefalomyelitis (R-EAE) en de chronische progressieve, Theiler Murine encefalomyelitis virus-geïnduceerde demyelinerende ziekte (tmev-IDD) R-EAE is een nuttig model voor het begrijpen van relapsing-reeft MS, terwijl het TMEV-IDD-model chronische progressieve MS19bevat.
Voor de huidige studie is een kwantitatieve analyse uitgevoerd van de intrathecale IgG-synthese in R-EAE (n = 12) en TMEV-IDD (n = 28). Beide groepen werden op het hoogtepunt van hun ziekte geanalyseerd. Een extra groep van 10 muizen werd behandeld met een placebo en diende als leeftijds gecompenseerde controlegroepen (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD Sham n = 6).
Een op magnetische kraal gebaseerde benadering met de in de handel verkrijgbare Kit (tabel met materialen) werd gebruikt voor het meten van de totale IgG in gecompenseerde serum-en CSF-specimens. De totale IgG-waarde is afgeleid van de som van de subklasse IgG1, IgG2a, IgG2b en IgG3 waarden. Albumine werd gemeten met een commerciële muis albumine ELISA-kit (tabel van materialen) omdat een luminex-test voor albumine op dat moment niet beschikbaar was. Alle metingen werden zorgvuldig uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Albumine quotiënt (Q-albumine) en IgG-index (qIgG/qalbumine) werden vervolgens gebruikt om bloed-versus CNS-afgeleide IgG in het CSF te differentiëren.
Zoals blijkt uit Figuur 3a, zijn de werkelijke concentraties van het totale IgG significant toegenomen in het CSF van beide knaagdieren modellen van MS in vergelijking met de overeenkomstige op leeftijd afgestemde Sham-controles (p ≤ 0,026). R-EAE-muizen vertonen echter significant verbeterde Q-albumine waarden (p ≤ 0,019), wat duidt op een verhoogde permeabiliteit van de barrière bij deze muizen (Figuur 3b). Omgekeerd bestaan er geen verschillen in Q-albumine tussen tmev-IDD en Sham-muizen (p = 0,49), waardoor onze eerdere bevinding van een intacte barrière in tmev-IDD muizen7,8wordt bevestigd. Om verder te discrimineren tussen transudaat en intrathecaal geproduceerde IgG in R-EAE en TMEV-IDD, werd de IgG-index gemeten, met significant hogere waarden in TMEV-IDD-muizen (p ≤ 0,0006), en dus intrathecale IgG-productie in dit model (figuur 3c).
Een intacte barrière in TMEV-IDD muizen samen met een hoge IgG index suggereert dat in dit model antilichamen worden geproduceerd binnen het CZS. Omgekeerd leveren in R-EAE een aanzienlijke barrière-uitsplitsing en een lage IgG-index het bewijs dat het CSF-IgG meestal wordt geproduceerd door perifere in plaats van intrathecale B-cellen, hetgeen ook suggereert dat CSF IgG in dit acute model van MS meestal is afgeleid van het serum.
Figuur 1: Retro-orbitaal bloeden van muizen. Links: juiste plaatsing van de naald ten opzichte van de retro-orbitale sinus, de oogbol en de achterkant van de baan. Rechts: de pipet locatie begint in de mediale Canthus van het oog en glijdt naar het rugoppervlak van de baan. Het capillair wordt ingebracht onder een hoek van 45 °. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: CSF-collectie bij muizen. A) de gehoor stangen ondersteunen het hoofd van de muis en de muis is zo vastgelegd dat het hoofd een hoek van 135 ° met het lichaam vormt. De pijl wijst naar de blootgestelde Cisterna magna. (B) door stompe dissectie met Tang, worden de spieren gescheiden om de Cisterna magna bloot te leggen (aangegeven door de pijl). Microretractors worden gebruikt om de spieren uit elkaar te houden. C) een klein glazen capillair wordt gebruikt om CSF uit de Cisterna magna te verzamelen. CSF stroomt spontaan in het capillair, vanwege de intracraniële druk. De pijl wijst naar de verzamelde CSF in het capillair. D) het CSF wordt overgebracht in een buis van 0,5 ml door middel van een gemodificeerde injectiespuit van 3 ml. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bloed-hersen barrièrefunctie en intrathecale synthese van IgG in R-EAE en tmev-IDD. Punt vlek die (a) de GSK-niveaus van totaal IgG (mg/DL), gemeten met luminex-technologie, weergeeft;B) albumine CSF/serum quotiënten (q-albumine) en (C) IgG-indices (qIG/q-albumine) bij R-EAE-en tmev-IDD-muizen, alsmede op leeftijdsgebonden controle muizen (CR-EAE en ctmev-IDD). Horizontale lijnen vertegenwoordigen de mediaanwaarde voor die groep. p < 0,0001; p < 0,001; * *p < 0,01; *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kwantitatieve methoden voor de evaluatie van verhoogde GSK-eiwit concentraties zijn nuttige hulpmiddelen bij de karakterisering van de fysiologische en pathologische toestand van het CZS. Afgezien van een betrouwbare kwantificering van het CSF-eiwitgehalte, vereist de opsporing van CSF-eiwitten echter een uitdrukking van de resultaten die discrimineert tussen in bloed en CNS afgeleide fracties in het CSF. Echter, tot nu toe, de veelgebruikte eiwit kwantificering assays niet toestaan discriminatie tussen de twee eiwit componenten, zelfs met behulp van high-throughput tools. Er zijn dus specifieke correcties op eiwit metingen voorgesteld om onderscheid te maken tussen eiwitten die in het CZS-compartiment zijn gesynthetiseerd en eiwitten afkomstig van het bloed. Dergelijke correcties compenseren de individuele variabiliteit in zowel de serumconcentraties als de barrière-integriteit. Over het algemeen zijn deze correcties gebaseerd op berekeningen van een CSF/serum quotiënt (Q-eiwit), wat de variabiliteit vermindert als gevolg van verschillen in de individuele concentratie van serumeiwitten. Variatie van het Q-eiwit gerelateerd aan individuele verschillen in barrièrefunctie kan verder worden verlaagd door het q-eiwit te CORRELEREN met een CSF/serumalbumine quotiënt (qalbumine). De combinatie van beide correcties is algemeen bekend als eiwit index en wordt berekend als Qeiwit/qalbumine ratio4,6.
Albumine, gesynthetiseerd en uitgescheiden door de lever, is de belangrijkste plasma-eiwit dat circuleert in de bloedbaan. Omdat albumine uitsluitend buiten het CZS wordt geproduceerd en de concentraties ervan in CSF laag zijn (~ 0,15 g/dL), geven verhoogde concentraties van CSF albumine ofwel schade aan de BBI of bloed verontreiniging als gevolg van intrathecale bloeding of traumatische CSF-verzameling. In een van deze voorwaarden, albumine transudates van serum in het CSF in verhouding tot de serumconcentratie. Daarom kan, bij afwezigheid van bloed verontreiniging, de Q-albumine worden gebruikt als indicator van de barrièrefunctie20. Omgekeerd blijft de Q-albumine binnen de normale waarden bij mensen en dieren constant met een intact BBI21. Een fundamentele aanname voor het gebruik van dit quotiënt4,6 in de berekening van de intrathecale eiwitsynthese is dat de toegenomen hoeveelheid CSF-eiwitten in de aanwezigheid van een ledende barrière evenredig is aan de toename van de concentratie van CSF-albumine. Deze veronderstelling is experimenteel bevestigd in een studie van 19774, waarin auteurs gecontroleerd bij MS-patiënten het bloed – CSF passage van van IgG en albumine verkregen uit gezonde menselijke sera.
Net als bij albumine kan elk eiwit in het bloed de BBI oversteken. Wanneer de barrière intact is, is het Q-eiwit relatief constant. In tegenstelling tot albumine kunnen echter ook veel eiwitten worden gesynthetiseerd binnen het CZS. Als gevolg hiervan kan een gewijzigd Q-eiwit voortvloeien uit een beschadigde barrière en/of verhoogde intrathecale eiwitproductie. Niettemin, wanneer een verhoogde CSF-eiwitconcentratie slechts te wijten is aan een gecompromitteerde BBI, worden waarden voor zowel Q-eiwitten als q-albumine verhoogd, vergeleken met waarden voor deze zelfde quotiënten bij dieren met een intacte barrière. In tegenstelling, wanneer de barrière intact is, toegenomen CSF eiwit concentraties zijn hoogstwaarschijnlijk te wijten aan verhoogde intrathecale synthese, en alleen de Q-eiwit wordt uiteindelijk verhoogd.
Het gebruik van de eiwit index kan gedeeltelijk worden beperkt door vijf factoren: 1) de grote variabiliteit van de concentratie van CSF-albumine bij gezonde dieren, 2) de verschillende hydrodynamische straal van eiwitten, 3) de endogene CZS-expressie van eiwitten, 4) verschillende bemonsterings technieken, en 5) de morfologische verschillen van de BBI. De grote variabiliteit van de concentratie van CSF-albumine bij gezonde dieren leidt tot aanzienlijke variabiliteit in de waarden voor de uiteindelijke eiwit index. Bij mensen is het Q-albumine bijvoorbeeld leeftijdsgebonden omdat het met de leeftijd van22toeneemt. Een eerder rapport noemde ook een sex-based verschil in Qalbumine in een gezonde populatie23. Evenzo, in muizen albumine concentraties afhankelijk van leeftijd en muis stam24, bijvoorbeeld, de q-albumine voor jonge, mannelijke, C57Bl/6 muizen kunnen afwijken van de q-albumine voor oude, vrouwelijke, DBA/1J muizen. Daarom kunnen gestandaardiseerde referentie-intervallen voor barrière-integriteit niet worden vastgesteld tussen en binnen soorten, en moeten passende drempels worden berekend op basis van de specifieke experimentele omstandigheden.
Een andere factor die variabiliteit in normale indexen tussen eiwitten veroorzaakt, is hun moleculaire grootte. De doorgang van serumeiwitten via de BBI is afhankelijk van hun moleculaire grootte, en de correlatie tussen het klaring percentage en het molecuulgewicht (MW) wordt veel gebruikt om de permeabiliteit van de BBI te evalueren. Algemene eiwit structuren variëren in grootte van tientallen tot enkele duizend aminozuren. Sommige eiwitten zijn van relatief kleine moleculaire grootte, zoals chemokines, met een molecuulgewicht variërend tussen 8 en 20 kDa. Zo'n laag MW bevordert het oversteken van de BBI, wat uiteindelijk resulteert in hogere normale eiwit indexen. Anders, andere eiwitten, zoals IgM, zijn zeer groot (900 − 950 kDa), dus tonen zeer lage indexen in normale omstandigheden6. Dit is echter niet altijd het geval, omdat, ondanks een soortgelijk MW, sommige eiwitten de barrière veel beter doordringen dan andere eiwitten, mogelijk vanwege een andere vorm. Zo is de diffusiecoëfficiënt van een eiwit, en dus de hydrodynamische radii die daaruit berekend is, afhankelijk van zowel de grootte als de vorm van moleculen25. Het fundamentele verschil tussen de meetkundige en het hydrodynamische volume van een eiwit wordt het meest duidelijk met grote eiwitten boven 150 kDa. De afnemende klaring percentages van bijvoorbeeld Ceruloplasmine (132 kDa), IgG (150 kDa) en IgA (150 kDa) weerspiegelen de hydrodynamische heterogeniteit van deze drie eiwitten, die vergelijkbare MW25hebben. Het is ook mogelijk dat er intrathecale productie van eiwitten onder normale omstandigheden. Sommige chemokines, bijvoorbeeld CXCL10, worden meestal intrathecaal geproduceerd, terwijl andere, bijvoorbeeld CXCL13, niet26,27zijn. Dit betekent dat de interpretatie van eiwit indexen onder de meeste experimentele omstandigheden in het algemeen vereist analyse van de leeftijd-, geslacht-en stam-gecompenseerde onbehandelde controles.
Eiwit niveaus in vloeistoffen kunnen ook worden beïnvloed door verschillende bemonsterings technieken. Hoewel dit geen probleem kan zijn voor de verzameling van CSF zoals hier beschreven-zijn er geen verschillen in de CSF-bemonstering tussen de beschreven overlevings-en niet-overlevings procedures-, kunnen verschillende bloedverzamelings methoden een invloed hebben op het totale serumeiwit bedrag. Sommige methoden van bloedafname opbrengst arteriële bloed, anderen leveren veneuze bloed, terwijl nog anderen opleveren een mengsel van beide14. Het monster dat is verkregen uit overlevings retro-orbitale bloedingen is een mengsel van veneuze bloed-en weefsel vloeistof, terwijl de terminale bloedafname van de hart punctie veneuze of arteriële bloed of een mengsel van beide14kan opleveren. Bij gezonde dieren kan het totale gehalte aan eiwitten en albumine van het arteriële bloed serum iets hoger zijn dan dezelfde fracties van het veneuze bloed serum28. Hiermee moet rekening worden gehouden wanneer overleving en niet-overlevings monsters worden vergeleken.
Tot slot, een belangrijk kenmerk om te overwegen is de heterogene morfologische structuur van de BBI, die bestaat uit ten minste twee verschillende barrières, de bloed-hersen barrière (BBB) gelegen in het endotheel van de micro vaten van de hersenen en de bloed-CSF barrière (bcsf) gelegen op het epitheel van de vaatvlies plexi29. Beide barrières beperken en reguleren de passage van moleculen en cellen tussen de perifere en cerebrospinale compartimenten, hoewel zij dit doen door verschillende mechanismen. Hoewel de BBB een echte fysieke barrière is, gekenmerkt door een complex samenspel tussen cellen, is de BCSF meer een fysiologische barrière, die meestal afhangt van de CSF-stroom. Verlagingen van de productie, afgifte en debiet van CSF als gevolg van neurologische aandoeningen en/of trauma belemmeren de bcsf-functie, waardoor de Q-albumine9,30,31,32toeneemt. Daarom dient Qalbumine als een betere marker van de permeabiliteit van de bcsf in plaats van de BBB of over het algemeen BBI permeabiliteit.
Samenvattend is de berekening van een eiwit index een relatief eenvoudige en goed gekarakteriseerde methode voor discriminatie tussen transudaat en intrathecaal geproduceerde eiwitten. Het voordeel van het toepassen van deze formule om de algemene meting van eiwitten in CSF-monsters te corrigeren, is dat het een objectieve variabele genereert om de intrathecale synthese van eiwitten te kwantificeren en de BBI-specifieke BCSF-functie (dys) te meten. Gezien de robuustheid van deze benadering biedt de correctie van het GSK-eiwit bedragen via de Q-albumine -en eiwit index een basislijn waartegen moet worden beoordeeld (1) de pathofysiologie-oorsprong van elk CSF-eiwit en (2) de stabiliteit en het functionele belang van barrière-integriteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd, van CSF en bloedafname tot de definitieve berekeningen die het totale CSF-eiwit bedrag corrigeren, dat van toepassing is op Muismodellen voor neurologische aandoeningen. Echter, hetzelfde protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van CSF en intrathecale synthese van eiwitten in een dier, met inbegrip van de mens. Q-albumine en IgG-index worden al vaak gebruikt in de klinische praktijk voor de diagnose van inflammatoire neurologische aandoeningen6. Deze zelfde parameters zijn ook met succes gebruikt voor het evalueren van een breed scala van cytokines en chemokines bij patiënten met inflammatoire demyeliniserende ziekten26,33,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de medewerkers van het centrum voor vergelijkende geneeskunde en onderzoek (CCMR) bij Dartmouth voor hun deskundige verzorging van de muizen die voor deze studies werden gebruikt. Het onderzoeksfonds Bornstein financierde dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
- Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
- Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
- Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
- DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
- Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
- Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
- Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
- Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
- Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
- Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
- Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
- Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
- Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
- Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
- Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
- Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
- Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
- Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
- Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
- Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
- Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).
