Summary
Les niveaux élevés de protéine de fluide spinal peuvent être le résultat de la diffusion de la protéine de plasma à travers une barrière hémato-encéphalique altérée ou la synthèse intrathécale. Un protocole d'essai optimisé est présenté dans cet article qui aide à discriminer les deux cas et fournit des mesures quantitatives des protéines synthétisées intrathécally.
Abstract
Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un fluide trouvé dans le cerveau et la moelle épinière, est d'une grande importance pour la science fondamentale et clinique. L'analyse de la composition des protéines du FSC fournit des informations cruciales dans la recherche fondamentale en neurosciences ainsi que dans les maladies neurologiques. Une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et la transudation du sérum, et l'analyse des protéines de CSF ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre la transudation des protéines dans le sang et les protéines produites par voie intrathéque dans les modèles animaux ainsi que chez les humains, les mesures de profilage des protéines CSF à l'aide d'outils conventionnels d'analyse des protéines doivent inclure le calcul du quotient d'albumine CSF/sérum (Qalbumin), un marqueur de l'intégrité de l'interface sang-cerveau (BBI), et l'indice protéique (Qprotein/Qalbumin), une estimation de la synthèse intrathécale. Ce protocole illustre l'ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux quotients et aux calculs d'indices, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine et de l'affaiblissement de BBI dans des modèles de souris des désordres neurologiques.
Introduction
Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un liquide clair et incolore entourant le cerveau et la moelle épinière, détient une grande importance clinique et scientifique fondamentale. Le CSF préserve l'environnement électrolytique du système nerveux central (SNC), équilibre le statut systémique acide-base, fournit des nutriments aux cellules neuronales et gliales, fonctionne comme un système lymphatique pour le SNC, et transporte des hormones, neurotransmetteurs, cytokines et autres neuropeptides tout au long du SNC1. Ainsi, comme la composition du CSF reflète l'activité du SNC, ce fluide offre un accès précieux, bien qu'indirect, pour caractériser l'état physiologique et pathologique du SNC.
CSF a été utilisé pour diagnostiquer les conditions qui affectent le SNC depuis plus de cent ans, et pour la plupart de ce temps, il a été principalement étudié par les cliniciens comme un outil de diagnostic. Cependant, au cours des dernières années, les neurobiologistes ont reconnu le potentiel de la FSC pour l'étude de la physiopathologie du SNC. En particulier, plusieurs outils d'analyse des protéines à haut débit ont été introduits dans le domaine des neurosciences, ce qui a permis une étude détaillée de la composition des protéines du CSF, dans l'espoir que cette analyse pourrait aider à mieux comprendre les changements dynamiques. se produisent au sein du SNC.
Les développements technologiques dans les techniques d'immuno-analyse multiplex telles que Luminex et Simoa technologies2,3, fournissent aux chercheurs d'aujourd'hui la capacité de détecter des centaines de protéines à de très faibles concentrations. En outre, ces mêmes technologies permettent l'utilisation de petits volumes d'échantillons, favorisant ainsi des études chez les petits animaux, y compris les souris, dans lesquelles des volumes d'échantillons limités de CSF ont empêché des caractérisations détaillées du fluide jusqu'à récemment.
Néanmoins, une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et / ou la transudation du sérum en raison d'une interface sang-cerveau endommagée (BBI). Malheureusement, l'analyse des protéines de CSF seul ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre les protéines transudées et les protéines produites par voie intrathéque, les mesures des protéines CSF à l'aide de tout outil d'analyse des protéines disponible doit être ajustée en fonction de la variabilité individuelle des concentrations de sérum ainsi que de l'intégrité de la barrière. Cependant, bien que cet ajustement soit couramment utilisé dans la pratique clinique, par exemple, l'indice IgG de CSF, qui a la sensibilité élevée pour détecter la synthèse intrathécale d'IgG4,5,6, à ce jour très peu d'études de recherche ont corrigé des concentrations de protéine de CSF pour la concentration de sérum et l'intégrité de barrière7,8.
Actuellement, l'approche Reibergram est le meilleur moyen de déterminer la fonction de barrière et la synthèse intrathécale des protéines. Il s'agit d'une évaluation graphique dans les diagrammes du quotient cSF/sérum qui analyse, de manière intégrée, à la fois la fonction barrière (dys) et la synthèse des protéines intrathécales, se référant à une protéine exclusivement dérivée du sang9,10. L'albumine protéique très abondante est généralement choisie comme protéine de référence parce qu'elle est produite seulement dans le foie et parce que sa taille, approximativement 70 kDa, est intermédiaire entre les petites et grandes protéines11. Le diagramme d'analyse a été défini pour la première fois par Reiber et Felgenhauer en 1987 pour les principales classes d'immunoglobulines (Igs)11, étant empiriquement basé sur les résultats obtenus à partir de l'analyse de milliers d'échantillons humains9. L'approche a ensuite été confirmée par l'application des deux lois de diffusion de Fick dans la théorie de la diffusion moléculaire/taux de débit12. Une telle théorie démontre la diffusion d'une protéine à travers la barrière a une distribution hyperbolique et peut expliquer quantitativement la dynamique des protéines dans le SNC9,13. Dans l'ensemble, l'avantage d'utiliser le Reibergram pour démontrer la synthèse des protéines intrathécales est qu'il identifie simultanément la fraction de protéines qui pénètre dans le CSF à partir du sérum ainsi que la quantité de protéines trouvées dans le CSF en raison de la production locale.
Le présent article et le protocole connexe décrivent l'ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux calculs finaux corrigeant les niveaux de protéine de CSF, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine dans les modèles de souris de neurologique Troubles. Cette procédure fournit une ligne de base contre laquelle évaluer (1) l'origine pathophysiologique de toute protéine de CSF et (2) la stabilité et la signification fonctionnelle de l'intégrité de barrière. Cette procédure et ce protocole sont non seulement utiles pour évaluer les échantillons de CSF de souris, mais sont également utiles dans l'analyse de CSF dans une multitude de modèles animaux des maladies neurologiques et des patients humains.
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Protocol
Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth.
1. Collection de fluides
REMARQUE : Le sérum et le CSF sont exigés. Deux protocoles pour chaque collecte de fluides sont nécessaires pour la survie et l'autopsie.
- Collecte de sérum et de CSF en utilisant des procédures de survie
REMARQUE : Pour la collecte de fluide de survie, la collecte de sérum devrait précéder la collection de CSF car c'est une procédure moins envahissante. CSF doit être obtenu dans la semaine suivant le tirage du sérum.- Procédure de saignement rétro-orbital e pour la collecte de sérum.
REMARQUE: Cette procédure est pour le saignement de survie des souris14. La procédure décrite s'applique à n'importe quel âge, sexe et souche de souris. Étant donné que les règles de l'IACUC stipulent qu'un volume sanguin maximal de 1 % du poids corporel peut être enlevé en tant qu'un seul prélèvement sanguin, il est recommandé que la procédure ne soit effectuée que sur des souris pesant plus de 15 g.- Déplacez les cages contenant des souris de la grille à une zone de travail appropriée. Préparer la machine à gaz d'anesthésie en allumant le compteur d'oxygène à 1 L/min.
- Placer l'animal dans la chambre d'induction et fermer le couvercle hermétiquement. Allumez le vaporisateur d'isoflurane à 3,5 % et surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit couché.
- Retirez l'animal de la chambre et évaluez le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale, c'est-à-d., pincement ferme de pied. Assurer une profondeur adéquate de l'anesthésie avant d'effectuer la procédure: l'absence de réponse à une pincée ferme indique une anesthésie adéquate.
- Retenez la souris anesthésiée en saisissant la peau lâche derrière les oreilles avec le pouce et l'index de la main non dominante. Enbulge les yeux en utilisant l'index pour dessiner la peau au-dessus de l'œil et le pouce pour dessiner la peau sous les yeux.
- Placez la pointe d'une pipette Pasteur dans la douille de l'œil sous le globe oculaire(figure 1, panneau gauche), en dirigeant la pointe à environ 45 degrés vers le milieu de la prise oculaire(figure 1, panneau droit). Faites pivoter la pipette entre les doigts pendant le passage vers l'avant. Appliquer une pression douce, puis libérer jusqu'à ce que le sang pénètre dans la pipette.
REMARQUE : La quantité maximale de sang qui peut être retirée à un moment donné de cet endroit est d'environ 1% du poids corporel, par exemple, 0,2 ml d'une souris de 20 g. - Retirez délicatement le capillaire pour éviter les blessures à l'œil et placez le sang recueilli dans un tube centrifugeur de 1,5 ml. Fermez la paupière et appliquez une légère pression avec de la gaze pour éviter d'autres saignements. Une fois complètement alerte et mobile (généralement de 3 à 5 min), retournez la souris dans sa cage de retenue.
- Laisser le sang coaguler de 30 à 60 min à température ambiante (RT), puis centrifuger le sang pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC. À l'aide d'une technique de pipette propre, recueillir le sérum dans un nouveau flacon de 0,5 ml étiqueté. Congeler immédiatement la fiole de sérum à -80 oC.
- Collecte de CSF avec procédure de survie
REMARQUE: Cette procédure est pour la chirurgie de survie, et il est basé sur le protocole publié par Liu et Duff en 200815. Les souris sont anesthésiés par un cocktail de kétamine (20 mg/mL), de xylazine (0,5 mg/mL) et d'acépromazine (0,5 mg/mL) administré par voie intrapéritone.- Déplacez les cages contenant des souris du rack vers une zone de travail de chirurgie désignée. Préparer l'espace chirurgical dans un environnement stérile. Assurez-vous que tous les instruments et matériaux utilisés sont stérilisés avant la chirurgie.
- Peser la souris et calculer le volume d'anesthésie nécessaire (0,1 ml de cocktail d'anesthésie pour une souris de 20 g). Injecter l'anesthésie intrapéritone116. Après quelques minutes, testez la souris en pinçant le pavé pour assurer une anesthésie adéquate. Si plus d'anesthésique est nécessaire, injectez davantage 0,01 à 0,03 ml du cocktail anesthésique.
- Utilisez des ciseaux ou un rasage pour raser une petite zone de la tête, à l'extrémité caudale, médiale sur le crâne, pour exposer une zone de travail assez grande pour la collecte CSF. Placez la souris en position couchée sur l'instrument stéréotaxique, et stabilisez la tête en utilisant des barres d'oreille (Figure 2A).
REMARQUE : La souris est posée de façon à ce que la tête forme un angle de près de 135 degrés avec le corps (Figure 2A). Une fois que l'animal est placé, un drapé chirurgical est employé pour maintenir un champ stérile au site chirurgical. Les rideaux adhésifs clairs sont préférés pour la collecte de CSF chez les souris, car ils permettent la visualisation directe et plus ciblée de l'animal. - Swab le site chirurgical avec 30% de chlorhexidine diacétate. À l'aide d'un scalpel stérile, faire une incision sagittale de la peau inférieure à l'occiput pour exposer les muscles qui recèlent la cisterna magna.
- Par dissection émoussée avec des forceps, séparer le tissu sous-cutané et les muscles pour exposer la cisterna magna (Figure 2B). Utilisez des microrétracteurs pour maintenir les muscles à part (Figure 2B) et exposer la couche méningée dura mater sur la cisterna magna.
- Laver délicatement avec de la saline stérile tamponnée par le phosphate (PBS) pour éliminer toute contamination sanguine possible. Blot sécher le dura mater avec un coton-tige stérile et perforer doucement la membrane couvrant la cisterna magna avec une aiguille de 30 G. Insérez rapidement et doucement un petit tube capillaire en verre pour recueillir cSF (Figure 2C).
REMARQUE : La pression intracrânienne permet à CSF de s'écouler spontanément dans le capillaire(figure 2C). Selon l'âge et la taille de la souris, environ 5 à 12 L de CSF sont obtenus à partir de chaque souris. - Retirez soigneusement le tube capillaire de la membrane. Connectez le tube à une seringue de 3 ml à travers un tube en polyéthylène(tableau des matériaux)et injectez le CSF collecté dans un tube étiqueté de 0,5 ml (Figure 2D). Gardez les flacons dans la glace.
- Fermer l'incision en utilisant la suture de polydioxanone (PDS) avec l'aiguille jetable et en utilisant des sutures enterrées17. Nettoyez la zone de tout sang ou tissu séché.
- Injecter des souris, sous-cutanéeouillement ou intrapéritonement16, avec 0,05 à 0,1 mg/kg d'hydrochlorure de buprénorphine comme traitement analgésique. En outre, injecter sous-cutanée1 ml de saline stérile pour prévenir la déshydratation.
- Placez la souris dans une cage propre et chaude pour la récupération. Une fois que la souris est mobile et capable d'atteindre la nourriture et l'eau, placez la cage de nouveau sur le support.
- Centrifugeuse CSF pendant 10 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC. Vérifier le degré de contamination sanguine par inspection visuelle pour l'identification de la xanthochromie et la présence d'une pastille rouge dans le fond du tube. Jetez les échantillons contaminés par le sang.
REMARQUE : La formule utilisée pour la correction des quantités de protéines cSF dans les échantillons contaminés par le sang est basée sur des paramètres d'équation qui incluent la teneur en protéines dans le CSF et le sérum, l'hématocrit (HCT), et les globules rouges (RBC) comptent dans cSF et sang18. Cependant, une telle stratégie de correction ne peut pas être facilement appliquée aux spécimens de CSF de souris en raison du petit volume, limitant ainsi la stratégie de correction à une inspection visuelle. - À l'aide d'une technique de pipette propre, collectez le CSF dans un nouveau tube de 0,2 ml, laissant derrière lui le granule avec des cellules. Diluer CSF 1:3 avec PBS pour réduire la perte de volume due à l'aérosol. Congeler immédiatement le flacon de CSF à -80 oC.
- Procédure de saignement rétro-orbital e pour la collecte de sérum.
- Collecte de sérum et de FSC selon des procédures de non-survie
REMARQUE : Pour la collecte de fluides non-survie, la collecte de CSF précède la collecte de sérum car la souris a besoin d'avoir une impulsion.- Collection CSF chez necropsy
REMARQUE : Cette procédure est pour la chirurgie de non-survie, et approximativement 10-20 l de CSF est obtenue de chaque souris. Un champ chirurgical stérile est recommandé, mais pas nécessaire pour la chirurgie de non-survie.- Déplacez les cages contenant des souris de la grille à un espace de travail confortable. Suivez les étapes 1.1.2-1.1.2.7 et 1.1.2.11-1.1.2.12 pour la collecte CSF. Passez à la section 1.2.2 pour la collecte du sérum.
- Collecte de sang par perforation intracardiaque (approche ouverte)
REMARQUE : Les volumes de sang attendus sont d'environ 3 % du poids corporel, par exemple, 0,6 ml à partir d'une souris de 20 g.- Après la collecte CSF assurez-vous que la souris est encore suffisamment anesthésié en pinçant le pavé. Si une réaction est observée, administrer une deuxième dose d'anesthésique. Si aucune réaction n'est observée, procédez.
- Placez l'animal sur le dos et écouvillonnez la peau sur l'abdomen avec 70% d'alcool. À l'aide de ciseaux chirurgicaux, ouvrez la cavité thoracique et exposez le cœur. Insérer une aiguille de 25 G (attachée à une seringue de 3 ml) dans le ventricule gauche et appliquer délicatement une pression négative sur le piston à seringues. Retirez l'aiguille après la collecte de sang.
- Effectuez une méthode secondaire d'euthanasie comme la décapitation ou la luxation cervicale pour s'assurer que l'animal est décédé.
- Poussez le piston de la seringue vers le bas et injectez le sang recueilli dans un flacon de 1,5 ml. Laisser le sang clotpendant de 30 à 60 min à RT, puis le centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC.
- En utilisant la technique de pipette propre, recueillir le sérum dans un nouveau flacon de 0,5 ml étiqueté. Congeler immédiatement la fiole de sérum à un congélateur de -80 oC.
- Collection CSF chez necropsy
2. Analyse des protéines
- Utilisez une méthode préférée, par exemple, la technologie Luminex, pour quantifier les protéines cibles et l'albumine dans les échantillons de sérum et de FSC assortis.
REMARQUE : Ici, un exemple est donné avec la technologie magnétique DeLuminex, mais pratiquement n'importe quelle technique qui mesure des quantités de protéine, y compris les essais immunosorbent enzymatiques (ELISAs), peut être appliquée au protocole actuel. Idéalement, les échantillons de CSF et de sérum sont exécutés pour l'albumine et les protéines cibles sur la même plate-forme. Les conditions d'essai doivent être optimisées pour les étapes cruciales du protocole telles que la concentration d'accouplement de perles d'antigène, les dilutions d'échantillons de sérum et de CSF, les courbes standard les mieux adaptées pour chaque analyte et la composition tampon pour réduire la réactivité non spécifique. Si un kit commercial est utilisé pour la mesure des protéines, par exemple, le kit d'isotypage de l'immunoglobuline (Tableau des matériaux) utilisé pour obtenir des données présentées dansFigure 3, les instructions des fabricants doivent être suivies.- Lors de la décongélation et avant l'analyse, centrifugez les échantillons de CSF et de sérum (2 000 x g pendant 10 min) et utilisez le supernatant pour empêcher l'engorgement des plaques de filtre et/ou de la sonde. Suivez la procédure d'assiduie fournie avec le kit pour les dilutions appropriées de l'échantillon. Sinon, déterminez la dilution appropriée pour chaque analyte et fluide. Diluer les échantillons dans PBS en conséquence.
REMARQUE : S'il n'y a pas de directives ou d'instructions spécifiques, des dilutions pour chaque analyte et liquide doivent être établies avant le test d'étude, en déterminant les plages de dilution appropriées nécessaires pour obtenir des estimations de concentration qui se situent dans la plupart des gamme fiable d'une courbe standard. Connaître les caractéristiques de l'échantillon biologique à analyser, par exemple, les concentrations physiologiques et pathologiques dans le fluide, permet d'essayer différentes dilutions avec des échantillons de faible, moyenne, et haute teneur en analytes. Si l'étendue prévue des concentrations dans les échantillons est connue a priori, les dilutions peuvent être sélectionnées après avoir calculé combien de fois l'échantillon doit être dilué afin d'être dans la plage de courbe standard choisie.
CAUTION: En calculant les facteurs de dilution, rappelez-vous que CSF a déjà été dilué 1:3. - Préparer une courbe standard pour chaque protéine d'intérêt, par exemple, l'albumine et l'IgG utilisées pour générer des données dans la figure 3, en diluant en série les protéines standard de référence. Pendant la préparation des courbes standard, mélanger soigneusement chaque concentration plus élevée avant de faire la prochaine dilution.
REMARQUE : Quelle que soit la méthode de quantification choisie, il est essentiel d'inclure une courbe standard chaque fois que l'analyse est effectuée pour estimer la concentration en protéines dans les échantillons. Le meilleur choix pour une norme de référence est une concentration épurée et connue de la protéine d'intérêt. Décider des dilutions spécifiques, ainsi que du nombre de points de données et de répliques utilisés pour définir la courbe standard, dépend du degré de non-linéarité dans la courbe standard. - Sélectionnez les ensembles de perles magnétiques couplés à l'anticorps appropriés (Tableau des matériaux). Pour les flacons individuels de perles, sonicate chaque flacon pendant 30 s et vortex pendant 1 min. Préparer un « mélange de perles de travail » en diluant les stocks de perles à une concentration finale de 50 perles de chaque ensemble/l dans le tampon d'analyse/lavage (PBS, 1 % d'albumine de sérum bovin [BSA]). Ajouter 50 l de perles mélangées à chaque puits dans une assiette plate de 96 puits(tableau des matériaux).
CAUTION: Les perles fluorescentes sont sensibles à la lumière. Par conséquent, ils doivent être protégés contre une exposition prolongée à la lumière tout au long de la procédure. - Diagramme le placement des arrière-plans, des normes et des échantillons sur une feuille de travail de carte de puits.
- Ajoutez 50 ll de tampon d'analyse/lavage à chaque puits d'arrière-plan, et 50 l de chaque norme aux puits pour la courbe standard. Chargez 50 ml de chaque échantillon dilué dans les puits appropriés en dernier. Envelopper l'assiette de papier d'aluminium et couver d'agitation (800 tr/min) sur un shaker de plaque pendant 30 min à RT.
- Placez la plaque sur un aimant de poche (Table of Materials) et reposez la plaque sur l'aimant pendant 60 s pour permettre un réglage complet des perles magnétiques. Enlever le contenu du puits en décantant délicatement la plaque et en tapant sur les coussinets absorbants pour enlever le liquide résiduel.
- Laver la plaque en la retirant de l'aimant, en ajoutant 200 L de tampon d'assay/wash, en secouant pour 30 s, et enfin en le rattachant à l'aimant. Répéter le lavage 3x.
- Diluer l'anticorps de détection biotinylated, c.-à-d., anticorps étiquetés biotine élevés contre l'espèce hôte de protéine, à 4 'g/mL dans le tampon d'analyse/lavage. Ajouter 50 l l de l'anticorps de détection dilué à chaque puits. Couvrir l'assiette et couver pendant 30 min à RT sur le shaker à 800 tr/min. Placez la plaque sur l'aimant et répétez les étapes 2.1.6 et 2.1.7.
- Diluer la streptavidtine conjuguée à la phycoérythrine (PE) (SAPE) à 4 g/mL dans le tampon d'analyse/lavage. Ajouter 50 L de SAPE dilué à chaque puits. Couvrir l'assiette et couver pendant 30 min à RT sur le shaker à 800 tr/min. Placez la plaque sur l'aimant et répétez les étapes 2.1.6 et 2.1.7.
- Retirez la plaque de l'aimant et suspendez les perles dans 100 l de tampon d'assay/lavage. Lisez les puits à l'aide d'un double instrument de détection à flux laser qui permet de détecter l'ampleur de l'intensité de la fluorescence DE l'EP (FI).
REMARQUE : Le signal, p. ex., FI, généré est proportionnel à la quantité d'antigène cible fixée à la surface des perles. - Exporter des données brutes et créer des courbes standard en graphique signal de détection FI par rapport aux concentrations de protéines standard. Utilisez la courbe standard pour calculer la concentration de l'analyte dans les échantillons.
REMARQUE : L'albumine est exprimée de préférence en g/dL, tandis que les protéines d'intérêt sont exprimées de préférence en mg/dL.
- Lors de la décongélation et avant l'analyse, centrifugez les échantillons de CSF et de sérum (2 000 x g pendant 10 min) et utilisez le supernatant pour empêcher l'engorgement des plaques de filtre et/ou de la sonde. Suivez la procédure d'assiduie fournie avec le kit pour les dilutions appropriées de l'échantillon. Sinon, déterminez la dilution appropriée pour chaque analyte et fluide. Diluer les échantillons dans PBS en conséquence.
3. Calculs de l'indice intrathécal
- Organisez les valeurs de concentration de protéines dans une feuille de calcul et analysez les résultats en appliquant les formules suivantes.
- Calculer Qalbumin:
oùl'albumine CSF etl'albumine de sérum sont des concentrations d'albumine dans les spécimens assortis de sérum et de CSF, respectivement. - Calculer laprotéineQ :
où lesprotéines CSF etles protéines sériques sont des concentrations de protéines cibles dans des échantillons de sérum et de FSC appariés, respectivement. - Calculer l'indice protéique :
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Representative Results
Cette expérience représentative visait à comparer la synthèse intrathécale d'IgG dans deux modèles de rongeurs cliniquement pertinents de la sclérose en plaques (MS) : l'encéphalomyélite expérimentale expérimentale induite par le PLP 139-151 (R-EAE) et la maladie demyélinisation induite par le virus de la maladie d'Inthesélinisation induite par le virus PLP139-151(TMEV-IDD). R-EAE est un modèle utile pour comprendre la SP cyclique, tandis que le modèle TMEV-IDD présente une SP progressive chronique19.
Pour la présente étude, une analyse quantitative de la synthèse intrathécale igG dans R-EAE (n - 12) et TMEV-IDD (n - 28) a été effectuée. Les deux groupes ont été analysés au sommet de leur maladie. Un groupe additionnel de 10 souris a été simulé-traité et a servi en tant que groupes de commande age-assortis (cR-EAE n ' 4, cTMEV-IDD faux n - 6).
Une approche à base de perles magnétiques avec le kit disponible dans le commerce (Tableau des matériaux) a été utilisée pour mesurer le nombre total d'IgG dans les échantillons de sérum assortis et de CSF. La valeur totale d'IgG a été dérivée de la somme des valeurs inférieures IgG1, IgG2a, IgG2b et IgG3. Albumin a été mesuré avec un kit commercial albumin eLISA souris (Table of Materials) parce qu'un test Luminex pour l'albumine n'était pas disponible à ce moment-là. Toutes les mesures ont été effectuées avec soin suivant les instructions des fabricants. Le quotient d'albumine (Qalbumin) et l'index d'IgG (QIgG/Qalbumin)ont alors été employés pour différencier le sang- contre IgG cNS-dérivé dans le CSF.
Comme le montre la figure 3A, les niveaux réels d'IgG total sont considérablement augmentés dans le FSC des deux modèles de sp. par rapport aux contrôles fictifs correspondants par âge(p - 0,026). Cependant, les souris R-EAE montrent des valeursd'albumine Q considérablement améliorées(p - 0,019), ce qui indique une perméabilité accrue de la barrière chez ces souris (Figure 3B). Inversement, aucune différence dansl'albumin Q n'existe entre les souris TMEV-IDD et les souris fictives(p - 0,49), corroborant ainsi notre découverte précédente d'une barrière intacte chez les souris TMEV-IDD7,8. Afin de faire davantage d'distinction entre l'IgG transudate et l'IgG produit par voie intrathécale dans r-EAE et TMEV-IDD, l'indice IgG a été mesuré, montrant des valeurs significativement plus élevées chez les souris TMEV-IDD(p - 0,0006), et donc la production intrathécale d'IgG dans ce modèle (Figure 3C).
Une barrière intacte chez les souris TMEV-IDD avec un indice IgG élevé suggère que dans ce modèle, l'anticorps est produit dans le CNS. Inversement, dans R-EAE, une ventilation significative de barrière et un index bas d'IgG fournissent l'évidence que l'IgG de CSF est principalement produit par les cellules périphériques plutôt que intrathecal B, suggérant également que dans ce modèle aigu de SP, CSF IgG est principalement dérivé du sérum.
Figure 1 : Saignement rétro-orbital de souris. Gauche : Placement correct de l'aiguille par rapport au sinus rétro-orbital, au globe oculaire et à l'arrière de l'orbite. Droite : L'emplacement de Pipette commence dans le canthus médial de l'oeil et glisse à l'aspect dorsal de l'orbite. Le capillaire est inséré à un angle de 45 degrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Collection CSF chez la souris. (A) Les barres d'oreille soutiennent la tête de la souris, et la souris est posée de sorte que la tête forme un angle de 135 degrés avec le corps. La flèche pointe vers la cisterna magna exposée. (B) Par dissection émoussée avec des forceps, les muscles sont séparés pour exposer la cisterna magna (pointée par la flèche). Les microrétracteurs sont utilisés pour maintenir les muscles à part. (C) Un petit tube capillaire en verre est utilisé pour recueillir CSF de la magna cisterna. CSF s'écoule spontanément dans le capillaire, en raison de la pression intracrânienne. La flèche pointe vers le CSF collecté dans le capillaire. (D) Le CSF est transféré dans un tube de 0,5 ml à l'utilisation d'une seringue modifiée de 3 ml. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Fonction de barrière hémato-encéphalique et synthèse intrathécale de l'IgG dans R-EAE et TMEV-IDD. Dot blot représentant (A) les niveaux CSF de l'IgG total (mg/dL) mesurés par la technologie Luminex, (B) albumin CSF/serum quotients (Qalbumin), et (C) IgG indices (QIg/Qalbumin) in R-EAE and TMEV-IDD mice as well asage-matched control mice (cR-EAE and cTMEV-IDD). Les lignes horizontales représentent la valeur médiane de ce groupe. p lt; 0,0001; p lt; 0,001; p 'lt; 0.01; p lt; 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les méthodes quantitatives pour l'évaluation des concentrations accrues de protéines De CSF sont des outils utiles dans la caractérisation de l'état physiologique et pathologique du SNC. Cependant, au-delà de la quantification fiable des niveaux de protéines CSF, la détection des protéines CSF nécessite une expression de résultats qui discrimine entre les fractions dérivées du sang et du SNC dans le CSF. Cependant, à ce jour, les tests de quantification des protéines couramment utilisés ne permettent pas de discrimination entre les deux composants protéiques, même à l'aide d'outils à haut débit. Ainsi, des corrections spécifiques aux mesures de protéines ont été proposées afin de distinguer entre les protéines synthétisées dans le compartiment du SNC et les protéines dérivées du sang. Ces corrections compensent la variabilité individuelle des concentrations de sérum et de l'intégrité de la barrière. Dans l'ensemble, ces corrections sont basées sur des calculs d'un quotient CSF/sérum(protéineQ), qui réduit la variabilité due aux différences dans la concentration individuelle de protéines sériques. La variation de laprotéine Q liée aux différences individuelles dans la fonction de barrière peut être encore abaissée en reliant laprotéine Q à un quotient d'albumine cSF/sérum (Qalbumin). La combinaison des deux corrections est généralement connue sous le nom d'indice de protéine et est calculée comme rapport d'albumine deprotéinede Q/Q4,6.
L'albumine, synthétisée et sécrétée par le foie, est la principale protéine plasmatique qui circule dans la circulation sanguine. Étant donné que l'albumine est produite exclusivement en dehors du SNC et que ses niveaux dans le CSF sont faibles (0,15 g/dL), l'augmentation des niveaux d'albumine de CSF indique soit des dommages à la BBI ou une contamination sanguine due à une hémorragie intrathécale ou à une collecte traumatique de FSC. Dans l'une ou l'autre de ces conditions, l'albumine se transufie du sérum dans le CSF en proportion de sa concentration de sérum. Par conséquent, en l'absence de contamination sanguine,l'albumine Q peut être utilisé comme un indicateur de la fonction de barrière20. Inversement,l'albumin Q reste constant dans les gammes normales chez les humains et les animaux avec un BBI21intact . Une hypothèse fondamentale pour l'utilisation de ce quotient4,6 dans le calcul de synthèse des protéines intrathécales est que la quantité accrue de protéines CSF en présence d'une barrière qui fuit est proportionnelle à l'augmentation de la concentration d'albumine CSF. Cette hypothèse a été expérimentalement confirmée dans une étude de 19774, dans laquelle les auteurs ont suivi chez les patients atteints de SP le passage de sang-CSF de l'IgG radio-étiqueté et de l'albumine obtenus à partir du sérum humain sain.
Semblable à l'albumine, n'importe quelle protéine dans le sang peut traverser le BBI. Lorsque la barrière est intacte, laprotéine Q est relativement constante. Contrairement à l'albumine, cependant, de nombreuses protéines peuvent également être synthétisées au sein du SNC. En conséquence, uneprotéine Q altérée peut résulter d'une barrière endommagée et/ou d'une augmentation de la production de protéines intrathécales. Néanmoins, lorsqu'une concentration élevée de protéines CSF est due juste à un BBI compromis, les valeurs pour laprotéine Q etl'albumine Q sont augmentées, par rapport aux valeurs pour ces mêmes quotients chez les animaux avec une barrière intacte. En revanche, lorsque la barrière est intacte, l'augmentation des concentrations de protéines CSF sont très probablement dues à une synthèse intrathécale accrue, et seule laprotéine Q est finalement augmentée.
L'utilisation de l'indice protéique peut être partiellement limitée par cinq facteurs : 1) la grande variabilité de la concentration d'albumine de CSF chez les animaux sains, 2) le rayon hydrodynamique différent des protéines, 3) l'expression endogène de CNS des protéines, 4) différentes techniques d'échantillonnage, et 5) les différences morphologiques du BBI. La grande variabilité de la concentration d'albumine de CSF chez les animaux sains a comme conséquence la variabilité considérable dans les valeurs pour l'index final de protéine. Chez l'homme, par exemple,l'albuminQ est dépendant de l'âge puisqu'il augmente avec l'âgede 22ans. Un rapport précédent mentionnait également une différence fondée sur le sexe dansl'albumine Q dans une population en bonne santé23. De même, chez les souris, les concentrations d'albumine dépendent de l'âge et de la souche de souris24, par exemple,l'albumine Q pour les jeunes souris mâles, C57Bl/6 peut être différente del'albuminEq pour les souris anciennes, femelles, DBA/1J. Par conséquent, les intervalles de référence normalisés pour l'intégrité des barrières ne peuvent pas être établis à travers et à l'intérieur des espèces, et les seuils appropriés doivent être calculés en fonction des conditions expérimentales spécifiques.
Un autre facteur causant la variabilité des indices normaux parmi les protéines est leur taille moléculaire. Le passage des protéines sériques à travers le BBI dépend de leur taille moléculaire, et la corrélation entre le taux de dégagement et le poids moléculaire (MW) est largement utilisée pour évaluer la perméabilité du BBI. Les structures protéiques générales varient en taille de dizaines à plusieurs milliers d'acides aminés. Certaines protéines sont de taille moléculaire relativement petite, comme les chimiocines, avec un poids moléculaire allant de 8 à 20 kDa. Un tel MW bas favorise le croisement du BBI, ayant finalement pour résultat des index normaux plus élevés de protéine. Différemment, d'autres protéines, comme l'IgM, sont très grandes (900-950 kDa), montrant donc des indices très faibles dans des conditions normales6. Cependant, ce n'est pas toujours le cas, puisque, malgré un MW similaire, certaines protéines imprègnent la barrière beaucoup mieux que d'autres protéines, peut-être en raison d'une forme différente. Ainsi, le coefficient de diffusion d'une protéine, et donc le radii hydrodynamique calculé à partir de celle-ci, dépend à la fois de la taille et de la forme des molécules25. La différence fondamentale entre le volume géométrique et le volume hydrodynamique d'une protéine devient plus évidente avec de grandes protéines au-dessus de 150 kDa. Les taux de dégagement décroissants, par exemple, de ceruloplasmin (132 kDa), igG (150 kDa) et IgA (150 kDa) reflètent l'hétérogénéité hydrodynamique de ces trois protéines, qui ont des MW25similaires. Il est également possible qu'il y ait une production intrathécale de protéines dans des circonstances normales. Certaines chimionines, p. ex. CXCL10, sont généralement produites par voie intrathéque, tandis que d'autres, p. ex., CXCL13, ne sont pas26,27. Cela signifie que l'interprétation des indices protéiques dans la plupart des conditions expérimentales nécessite généralement l'analyse des contrôles non traités liés à l'âge, au sexe et à la souche.
Les niveaux de protéines dans les fluides peuvent également être affectés par différentes techniques d'échantillonnage. Bien que cela ne soit peut-être pas un problème pour la collecte de FSC tel que décrit ici -il n'y a aucune différence dans l'échantillonnage de CSF entre les procédures de survie et de non-survie décrites-, différentes méthodes de collecte de sang peuvent avoir un impact sur la quantité totale de protéine de sérum. Certaines méthodes de collecte de sang donnent du sang artériel, d'autres produisent du sang veineux, tandis que d'autres encore donnent un mélange des deux14. L'échantillon obtenu à partir de saignement rétro-orbital de survie est un mélange de sang veineux et de liquide tissulaire, tandis que la collecte terminale de sang de la ponction cardiaque peut donner du sang veineux ou artériel ou un mélange des deux14. Chez les animaux en bonne santé, la teneur totale en protéines et en albumine du sérum sanguin artériel peut être légèrement supérieure aux mêmes fractions du sérum sanguin veineux28. Cela doit être pris en considération lorsque les échantillons de survie et de non-survie sont comparés.
Enfin, une caractéristique importante à considérer est la structure morphologique hétérogène du BBI, qui comprend au moins deux barrières distinctes, la barrière hémato-encéphalique (BBB) située à l'endothélium des microvaisseaux cérébraux et la barrière de sang-CSF (BCSF) située à l'épithélium des plex choroides29. Les deux barrières restreignent et régulent le passage des molécules et des cellules entre les compartiments périphériques et céphalo-rachidiens, bien qu'elles le fassent par différents mécanismes. Alors que le BBB est une véritable barrière physique, caractérisée par une interaction complexe entre les cellules, le BCSF est plus d'une barrière physiologique, qui dépend principalement du flux CSF. Les réductions de la production, de la libération et du débit de CSF dues à des conditions neurologiques et/ou à un traumatisme altèrent la fonction bcSF, augmentant ainsil'albumineQ 9,30,31,32. Par conséquent,l'albumine Q sert de meilleur marqueur de la perméabilité BCSF plutôt que de la perméabilité BBB ou généralement BBI.
En résumé, le calcul d'un indice de protéines est une méthode relativement simple et bien caractérisée de discrimination entre les protéines transudées et les protéines produites par voie intrathéqueuse. L'avantage d'appliquer cette formule pour corriger la mesure générale des protéines dans les échantillons de CSF est qu'elle génère une variable objective pour quantifier la synthèse intrathécale des protéines et pour mesurer le BBI, en particulier BCSF, (dys)function. Compte tenu de la robustesse de cette approche, la correction des quantités de protéines CSF parl'albumine Q et l'indice de protéines fournit une base de référence pour évaluer (1) l'origine pathophysiologique de toute protéine CSF et (2) la stabilité et l'importance fonctionnelle de l'intégrité de la barrière. Ici, il est présenté un protocole détaillé, de CSF et la collecte de sang aux calculs finaux corrigeant la quantité totale de protéines CSF, qui s'applique aux modèles de souris pour les maladies neurologiques. Cependant, le même protocole peut être facilement adapté à l'étude du CSF et de la synthèse intrathécale des protéines chez n'importe quel animal, y compris les humains. L'albumine Q et l'indice IgG sont déjà couramment utilisés dans la pratique clinique pour le diagnostic des maladies neurologiques inflammatoires6. Ces mêmes paramètres ont également été utilisés avec succès pour évaluer un large éventail de cytokines et de chimiokines chez les patients atteints de maladies démyélinisatrices inflammatoires26,33,34.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins qu'ils ont soignés aux souris utilisées pour ces études. Le Fonds de recherche De Bornstein a financé cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
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