Summary
Níveis elevados de proteína do fluido espinhal podem ser o resultado da difusão da proteína plasmática através de uma barreira hemato-cerebral alterada ou síntese intratérica. Um protocolo de teste otimizado é apresentado neste artigo que ajuda a discriminar ambos os casos e fornece medições quantitativas de proteínas sintetizadas intrathecally.
Abstract
O líquido cefalorraquidiano (CSF), um fluido encontrado no cérebro e na medula espinhal, é de grande importância para a ciência básica e clínica. A análise da composição da proteína CSF fornece informações cruciais na pesquisa básica de neurociência, bem como doenças neurológicas. Uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e da transudação do soro, e a análise da proteína de CSF pode somente determinar a soma destes dois componentes. Para discriminar entre a transudação de proteínas do sangue e proteínas intrathecally produzidas em modelos animais, bem como em seres humanos, as medições de perfil de proteína CSF usando ferramentas convencionais de análise de proteínadevem incluir o cálculo do quociente de csf/soro albumina(q albumina),um marcador da integridade da interface sangue-cérebro (BBI) e do índice de proteína(q proteína/q albumina), uma estimativa de síntese de proteína intrathecal. Este protocolo ilustra todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue para quocientes e cálculos de índices, para a medição quantitativa da síntese intratês de proteínas e imparidade BBI em modelos de camundongos de distúrbios neurológicos.
Introduction
O líquido cefalorraquidiano (CSF), um líquido claro e incolor em torno do cérebro e da medula espinhal, tem grande importância científica clínica e básica. O CSF preserva o ambiente eletrólitico do sistema nervoso central (SNC), equilibra o estado sistêmico de base ácida, fornece nutrientes para células neuronais e gliais, funciona como um sistema linfático para o SNC, e transporta hormônios, neurotransmissores, citocinas e outros neuropeptídeos em todo o CNS1. Assim, como a composição do CSF reflete a atividade do SNC, esse fluido oferece um acesso valioso, embora indireto, para caracterizar o estado fisiológico e patológico do SNC.
A CSF tem sido usada para diagnosticar condições que afetam o SNC há mais de cem anos, e durante a maior parte desse tempo, foi estudada principalmente pelos clínicos como uma ferramenta de diagnóstico. No entanto, nos últimos anos, os neurobiólogos reconheceram o potencial da CSF para estudar a fisiopatologia do SNC. Em particular, várias ferramentas de análise de proteína de alta taxa de vesperção foram introduzidas no reino da neurociência, permitindo um estudo detalhado da composição proteica do CSF, com a expectativa de que esta análise possa ajudar a fornecer informações sobre as mudanças dinâmicas ocorrendo dentro do SNC.
Desenvolvimentos tecnológicos em técnicas de imunoensaio multiplex, como luminex e simoa tecnologias2,3, fornecer pesquisadores hoje com a capacidade de detectar centenas de proteínas em concentrações muito baixas. Além disso, essas mesmas tecnologias permitem o uso de pequenos volumes de amostras, promovendo assim estudos em pequenos animais, incluindo camundongos, nos quais volumes de amostras limitados de CSF impediram caracterizações detalhadas do fluido até recentemente.
No entanto, uma ressalva é que as proteínas medidas em CSF podem derivar da síntese intrathecal e/ou transudação do soro devido a uma interface sangue-cérebro danificada (BBI). Infelizmente, a análise de proteínas da CSF por si só só pode determinar a soma desses dois componentes. Para discriminar entre proteínas produzidas transudate e intrathecally, as medidas da proteína de CSF usando toda a ferramenta disponível da análise da proteína devem ser ajustadas para a variabilidade individual em concentrações do soro assim como a integridade da barreira. No entanto, embora esse ajuste seja comumente usado na prática clínica, por exemplo, o índice CSF IgG, que tem alta sensibilidade para detectar a síntese intrathecal igg4,5,6, até o momento, muito poucos estudos de pesquisa corrigiram concentrações de proteína CSF para concentração de soro e integridade de barreira7,8.
Atualmente, a abordagem Reibergram é a melhor maneira de determinar a função de barreira e síntese intratérica de proteínas. É uma avaliação gráfica em diagramas quocientes csf/sérico que analisa, de forma integrada, tanto a função de barreira (dys) quanto a síntese intratais de proteínas, referindo-se a uma proteína exclusivamente derivada do sangue9,10. A albumina de proteína altamente abundante é geralmente escolhida como proteína de referência porque é produzida apenas no fígado e porque seu tamanho, aproximadamente 70 kDa, é intermediário entre proteínas pequenas e grandes11. O diagrama de análise foi definido pela primeira vez por Reiber e Felgenhauer em 1987 para as principais classes de imunoglobulinas (Igs)11, sendo empiricamente com base nos resultados obtidos a partir da análise de milhares de amostras humanas9. A abordagem foi posteriormente confirmada pela aplicação das duas leis de difusão de Fick na teoria da difusão molecular/taxa de fluxo12. Tal teoria demonstra que a difusão de uma proteína através da barreira tem uma distribuição hiperbólica e pode explicar quantitativamente a dinâmica das proteínas no SNC9,13. No geral, a vantagem de usar o Reibergram para demonstrar a síntese intrathecal de proteínaé que ela identifica simultaneamente a fração de proteína que entra no CSF do soro, bem como a quantidade de proteína encontrada no CSF por causa da produção local.
O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem todo o procedimento, desde csf e coleta de sangue até os cálculos finais corrigindo os níveis de proteína CSF, para a medição quantitativa da síntese intrathecal de proteínas em modelos de camundongos de Distúrbios. Este procedimento fornece uma linha de base contra a qual avaliar (1) a origem fisiopatológica de qualquer proteína CSF e (2) a estabilidade e o significado funcional da integridade da barreira. Este procedimento e protocolo não são apenas úteis para avaliar amostras de CSF de camundongos, mas também são úteis na análise de CSF em uma infinidade de modelos animais de doenças neurológicas e pacientes humanos.
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Protocol
Todo o trabalho animal utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Geisel School of Medicine em Dartmouth.
1. Coleta de fluidos
NOTA: Tanto o soro quanto o CSF são necessários. Dois protocolos para cada coleta de fluidos são necessários para a sobrevivência e necropsia.
- Coleta de soro e CSF usando procedimentos de sobrevivência
NOTA: Para a coleta de fluidos de sobrevivência, a coleta de soro deve preceder a coleta de CSF, pois é um procedimento menos invasivo. CSF deve ser obtido dentro de uma semana de sorteio de soro.- Procedimento retro-orbital do sangramento para a coleção do soro.
NOTA: Este procedimento é para a sobrevivência sangrando de ratos14. O procedimento descrito aplica-se a qualquer idade, sexo e cepa de camundongos. Uma vez que as regras da IACUC ditam que um volume máximo de sangue de 1% do peso corporal pode ser removido como um único levantamento de sangue, recomenda-se que o procedimento seja realizado apenas em camundongos com peso superior a 15 g.- Mova as gaiolas contendo ratos do rack para uma área de trabalho apropriada. Prepare a máquina de gás da anestesia girando sobre o medidor de fluxo do oxigênio a 1 L/min.
- Coloque o animal na câmara de indução e feche a tampa firmemente. Ligue o vaporizador isoflurano para 3,5% e monitorar o animal até reclinar.
- Retire o animal da câmara e avalie o nível de anestesia por reflexo do pedal, ou seja, pitada firme de footpad. Assegurar profundidade adequada de anestesia antes de realizar o procedimento: a falta de resposta a uma pitada firme indica anestesia adequada.
- Contenha o rato anestesiado agarrando a pele solta atrás das orelhas com o polegar e o dedo indicador da mão não dominante. Aprotuberância os olhos usando o dedo indicador para desenhar para trás a pele acima do olho e do polegar para desenhar para trás a pele abaixo dos olhos.
- Coloque a ponta de uma pipeta Pasteur na órbita ocular debaixo do globo ocular(Figura 1,painel esquerdo), direcionando a ponta em aproximadamente 45° em direção ao meio da órbita ocular(Figura 1,painel direito). Gire a pipeta entre os dedos durante a passagem para a frente. Aplique pressão suave e, em seguida, solte até que o sangue está entrando na pipeta.
NOTA: A quantidade máxima de sangue que pode ser retirada ao mesmo tempo a partir deste local é de cerca de 1% do peso corporal, por exemplo, 0,2 mL de um rato de 20 g. - Retire suavemente o capilar para evitar lesões no olho e coloque o sangue coletado em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Feche a pálpebra e aplique pressão leve com gaze para evitar mais sangramento. Uma vez totalmente alerta e móvel (geralmente 3-5 min), devolva o mouse à sua gaiola de espera.
- Permita que o sangue coagule por 30 a 60 min à temperatura ambiente (RT), depois o sangue centrífuga por 10 min a 2.000 x g em uma centrífuga refrigerada de 4 °C. Usando uma técnica de pipeta limpa, coletar soro em um novo frasco de 0,5 mL rotulado. Congele imediatamente o frasco do soro em -80 °C.
- Coleção CSF com procedimento de sobrevivência
NOTA: Este procedimento é para cirurgia de sobrevivência, e é baseado no protocolo publicado por Liu e Duff em 200815. Os camundongos são anestesiados por um coquetel de cetamina (20 mg/mL), xilazine (0,5 mg/mL) e acepromazine (0,5 mg/mL) administrado intraperitoneally.- Mova as gaiolas contendo ratos do rack para uma área de trabalho de cirurgia designada. Prepare o espaço da cirurgia em um ambiente estéril. Certifique-se de que todos os instrumentos e materiais utilizados sejam esterilizados antes da cirurgia.
- Pese o mouse e calcule o volume de anestesia necessário (0,1 mL de coquetel de anestesia para um mouse de 20 g). Injetar anestesia intraperitoneally16. Depois de alguns minutos, teste o mouse apertando o bloco de pouso para garantir anestesia adequada. Se for necessário mais anestésico, injete ainda mais 0,01 a 0,03 mL do coquetel anestésico.
- Use uma tesoura ou um barbeador para raspar uma pequena área da cabeça, na extremidade caudal, medial no crânio, para expor grande área de trabalho suficiente para a coleta de CSF. Posicione o mouse na posição prona no instrumento estereotipado, e estabilize a cabeça usando barras de ouvido (Figura 2A).
NOTA: O rato é colocado de modo que a cabeça dá forma a um ângulo de quase 135° com o corpo (figura 2A). Uma vez que o animal é posicionado, uma cortina cirúrgica é usada para manter um campo estéril no local cirúrgico. Cortinas adesivas claras são preferidas para a coleta de CSF em camundongos, pois permitem a visualização direta e mais focada do animal. - Cotonete o local cirúrgico com 30% de cloroxina diacetate. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão softal da pele inferior ao occiput para expor os músculos sobrepondo a cisterna magna.
- Por dissecação contundente com fórceps, separe o tecido subcutâneo e músculos para expor a cisterna magna (Figura 2B). Use micrortratores para manter os músculos separados(Figura 2B)e expor a camada meningeal dura mater sobre a cisterna magna.
- Lave delicadamente com soline fosfato-amortecedor estéril (PBS) para remover toda a contaminação possível do sangue. Borrar secar a dura mater com um cotonete estéril e delicadamente perfurar a membrana que cobre a cisterna magna com uma agulha de 30 G. Rapidamente e delicadamente inserir um pequeno tubo capilar de vidro para coletar CSF (Figura 2C).
NOTA: A pressão intracraniana permite que a CSF flua espontaneamente para o capilar(Figura 2C). Dependendo da idade e tamanho do mouse, aproximadamente 5 a 12 μL de CSF é obtido de cada mouse. - Retire cuidadosamente o tubo capilar da membrana. Conecte o tubo a uma seringa de 3 mL através de uma tubulação de polietileno(Mesa de Materiais)e injete o CSF coletado em um tubo de 0,5 mL rotulado(Figura 2D). Mantenha frascos no gelo.
- Close incisão usando sutura de polidioxanona (PDS) com agulha descartável e usando suturas enterradas17. Limpe a área de qualquer sangue seco ou tecido.
- Injetar camundongos, subcutânea ou intraperitoneally16, com 0,05-0,1 mg /kg de cloridrato de buprenorfina como tratamento analgésico. Além disso, injetar subcutâneamente 1 mL de soline estéril para evitar a desidratação.
- Coloque o rato de volta em uma gaiola limpa e quente para a recuperação. Uma vez que o mouse é móvel e capaz de alcançar comida e água, coloque a gaiola de volta no rack.
- Centrífuga CSF por 10 min a 1.000 x g em uma centrífuga refrigerada de 4 °C. Verifique o grau de contaminação do sangue por inspeção visual para identificação de xantocromia e presença de uma pelota vermelha no fundo do tubo. Descarte amostras contaminadas com sangue.
NOTA: A fórmula utilizada para a correção de quantidades de proteína CSF em espécimes contaminados pelo sangue é baseada em parâmetros de equação que incluem teor de proteína em CSF e soro, hematócrito (HCT) e glóbulos vermelhos (RBC) contam em CSF e sangue18. No entanto, essa estratégia de correção não pode ser facilmente aplicada aos espécimes de CSF de camundongos devido ao pequeno volume, limitando assim a estratégia de correção a uma inspeção visual. - Usando uma técnica de pipeta limpa, coletar CSF em um novo tubo de 0,2 mL, deixando para trás a pelota com células. Diluir CSF 1:3 com PBS para reduzir a perda de volume devido ao aerossol. Congele imediatamente o frasco de CSF em -80 °C.
- Procedimento retro-orbital do sangramento para a coleção do soro.
- Coleta de soro e CSF usando procedimentos de não sobrevivência
NOTA: Para a coleta de fluidos de não sobrevivência, a coleta de CSF precede a coleta de soro, pois o mouse precisa ter pulso.- Coleção CSF na necropsia
NOTA: Este procedimento é para cirurgia de não sobrevivência, e aproximadamente 10 a 20 μL de CSF é obtido de cada mouse. Um campo cirúrgico estéril é recomendado, mas não necessário para a cirurgia da não-sobrevivência.- Mova as gaiolas contendo ratos do rack para um espaço de trabalho confortável. Siga os passos 1.1.2.2-1.1.2.7 e 1.1.2.11-1.1.2.12 para a coleta de CSF. Agvire-se à seção 1.2.2 para a coleção do soro.
- Coleta de sangue por perfuração intracardíaca (aproximação aberta)
NOTA: Os volumes de sangue esperados é de aproximadamente 3% do peso corporal, por exemplo, 0,6 mL de um mouse de 20 g.- Após a coleta de CSF garantir que o mouse ainda é suficientemente anestesiado, beliscando o footpad. Se alguma reação for observada, administrar uma segunda dose de anestesia. Se nenhuma reação for observada, prossiga.
- Coloque o animal nas costas e pele de cotonete no abdômen com 70% de álcool. Com tesoura cirúrgica, abra a cavidade torácica e exponha o coração. Insira uma agulha de 25 G (presa a uma seringa de 3 mL) no ventrículo esquerdo e aplique suavemente pressão negativa sobre o desentupidor de seringa. Retire a agulha depois que o sangue foi coletado.
- Realize um método secundário de eutanásia, como decapitação ou luxação cervical, para garantir que o animal seja falecido.
- Empurre o desentupidor da seringa para baixo e injetar o sangue coletado em um frasco de 1,5 mL. Permitir que o sangue coagular por 30-60 min em RT e, em seguida, centrífuga por 10 min a 2.000 x g em uma centrífuga refrigerada de 4 °C.
- Usando a técnica de pipeta limpa, coletar soro em um frasco novo, rotulado 0,5 mL. Congele imediatamente o frasco do soro em um congelador de -80°C.
- Coleção CSF na necropsia
2. Análise de proteínas
- Use um método preferido, por exemplo, a tecnologia Luminex, para quantificar a proteína alvo (s) e albumina em espécimes combinados de soro e CSF.
NOTA: Aqui, um exemplo é dado com a tecnologia magnética Luminex, mas praticamente qualquer técnica que meça quantidades de proteínas, incluindo ensaios imunosorbentligados por enzimas (ELISAs), pode ser aplicada ao protocolo atual. Idealmente, as amostras de CSF e soro são executadas para proteínas de albumina e alvo na mesma plataforma. As condições de ensaio devem ser otimizadas para etapas cruciais no protocolo, como concentração de acoplamento de antígeno, diluições de amostras de soro e CSF, curvas padrão mais adequadas para cada análito e composição tampão para reduzir a reatividade não específica. Se um kit comercial é usado para medição de proteínas, por exemplo, o kit de isotipagem de imunoglobulina (Tabela de Materiais) utilizados para obter dados apresentadosFigura 3, as instruções dos fabricantes têm de ser seguidas.- Ao descongelar e antes da análise, a centrífuga CSF e amostras de soro (2.000 x g por 10 minutos) e usam o supernatant para evitar entupimento das placas de filtro e/ou sonda. Siga o procedimento de ensaio fornecido com o kit para diluições de amostra apropriadas. Caso contrário, determinar a diluição adequada para cada anályte e fluido. Diluir amostras em PBS em conformidade.
NOTA: Se não houver orientações ou instruções específicas, as diluições para cada analita e fluido devem ser estabelecidas antes do teste do estudo, determinando as faixas de diluição apropriadas necessárias para obter estimativas de concentração que se enquadram mais alcance confiável de uma curva padrão. Conhecer as características da amostra biológica a ser analisada, por exemplo, concentrações fisiológicas e patológicas no fluido, permite tentar diferentes diluições com amostras de baixo, médio e alto teor de análise. Se a faixa esperada de concentrações nas amostras for conhecida a priori, as diluições podem ser selecionadas após o cálculo de quantas vezes a amostra precisa ser diluída para estar dentro da faixa de curva padrão escolhida.
CUIDADO: Ao calcular os fatores de diluição, lembre-se que a CSF já foi diluída 1:3. - Prepare uma curva padrão para cada proteína de interesse, por exemplo, albumina e IgG como usado para gerar dados na Figura 3, por proteínas padrão de referência de diluição em série. Durante a preparação das curvas padrão, misture completamente cada concentração mais alta antes de fazer a próxima diluição.
NOTA: Independentemente do método escolhido de quantificação, é essencial incluir uma curva padrão cada vez que o ensaio é realizado para estimar a concentração de proteínas em amostras. A melhor escolha para um padrão de referência é uma concentração purificada e conhecida da proteína de interesse. Decidir sobre as diluições específicas, bem como o número de pontos de dados e replicações usadas para definir a curva padrão, depende do grau de não linearidade na curva padrão. - Selecione os conjuntos de contas magnéticas acoplados ao anticorpo apropriados(Mesa de Materiais). Para frascos individuais de contas, sonicate cada frasco para 30 s e vórtice para 1 min. Prepare uma "mistura de contas de trabalho", diluindo os estoques de contas para uma concentração final de 50 contas de cada conjunto / μL em ensaio / tampão de lavagem (PBS, 1% albumina soro bovina [BSA]). Adicione 50 μL das contas mistas a cada poço em uma placa de 96 poços de fundo chato(Mesa de Materiais).
CUIDADO: As contas fluorescentes são sensíveis à luz. Portanto, eles devem ser protegidos da exposição prolongada à luz durante todo o procedimento. - Diagrame a colocação de fundos, padrões e amostras em uma planilha de mapa de poços.
- Adicione 50 μL de ensaio / tampão de lavagem para cada fundo bem, e 50 μL de cada padrão para os poços para a curva padrão. Carregue 50 mL de cada amostra diluída nos poços apropriados por último. Envolva a placa com papel alumínio e incubação com agitação (~ 800 rpm) em uma agitação placa por 30 min em RT.
- Coloque a placa em um ímã portátil(Mesa de Materiais)e descansar a placa sobre o ímã por ~ 60 s para permitir a configuração completa de contas magnéticas. Retire o conteúdo bem, decantando suavemente a placa e a placa de toque em almofadas absorventes para remover o líquido residual.
- Lave a placa removendo-a do ímã, adicionando 200 μL do amortecedor do ensaio/lavagem, agitando para ~30 s, e finalmente recolocando a ao ímã. Repita a lavagem 3x.
- Diluir o anticorpo de detecção biotinylated, ou seja, anticorpo etiquetado biotina levantadas contra a espécie hospedeira de proteína, para 4 μg/mL em ensaio / tampão de lavagem. Adicione 50 μL do anticorpo de detecção diluído a cada poço. Cubra a placa e incubar por 30 min em RT na agitação placa em ~ 800 rpm. Coloque a placa no ímã e repita os passos 2.1.6 e 2.1.7.
- Diluir a ficoerytrina (PE) conjugada streptavidin (SAPE) a 4 μg/mL em ensaio/tampão de lavagem. Adicione 50 μL de SAPE diluído a cada poço. Cubra a placa e incubar por 30 min em RT na agitação placa em ~ 800 rpm. Coloque a placa no ímã e repita os passos 2.1.6 e 2.1.7.
- Retire a placa do ímã e resuspenda as contas em 100 μL de buffer de ensaio/lavagem. Leia poços com um instrumento de detecção baseado em fluxo a laser duplo que permite a detecção da magnitude da intensidade da fluorescência de PE (FI).
NOTA: O sinal, por exemplo, FI, gerado é proporcional à quantidade de antígeno alvo ligado à superfície das contas. - Exportar dados brutos e criar curvas padrão por meio do sinal de detecção de gráficos FI versus concentrações de proteína padrão. Use a curva padrão (s) para calcular a concentração do anályte (s) nas amostras.
NOTA: Albumina é expressa preferencialmente em g / dL, enquanto as proteínas de interesse são expressas preferencialmente em mg / dL.
- Ao descongelar e antes da análise, a centrífuga CSF e amostras de soro (2.000 x g por 10 minutos) e usam o supernatant para evitar entupimento das placas de filtro e/ou sonda. Siga o procedimento de ensaio fornecido com o kit para diluições de amostra apropriadas. Caso contrário, determinar a diluição adequada para cada anályte e fluido. Diluir amostras em PBS em conformidade.
3. Cálculos do índice intrathecal
- Organize valores de concentração de proteínas em uma planilha e analise os resultados aplicando as seguintes fórmulas.
- Calculeo albuminaq:
ondecsf albumina eserum albuminsão concentrações de albumina em combinados soro e csf espécimes, respectivamente. - Calculea proteínaQ :
onde aproteína CSF ea proteína soro são concentrações de proteína-alvo (s) em espécimes de soro e CSF combinados, respectivamente. - Calcule o índice de proteína:
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Representative Results
Este experimento representativo teve como objetivo comparar a síntese intratítica do IgG em dois modelos de roedores clinicamente relevantes de esclerose múltipla (EM): a PLP139-151-induzida pela encefalomielite autoimune experimental (TMEV-IDD) e a doença de desmielinação induzida pelo vírus de Theiler. R-EAE é um modelo útil para a compreensão de EmS remitindo-remitindo-remitindo, visto que o modelo de TMEV-IDD caracteriza oM9progressivo crônico.
Para o presente estudo, foi realizada uma análise quantitativa da síntese intrathecal igg em R-EAE (n = 12) e TMEV-IDD (n = 28). Ambos os grupos foram analisados no pico de sua doença. Um grupo adicional de 10 camundongos foi tratado com farsa e serviu como grupos controle combinados com a idade (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD sham n = 6).
Uma aproximação magnética grânulo-baseada com o jogo comercialmente disponível(tabela dos materiais)foi usada para medir IgG total em espécimes combinados do soro e do CSF. O valor total do IgG foi derivado da soma dos valores igg1, IgG2a, IgG2b e IgG3 da subclasse. Albumina foi medido com um álbum de mouse comercialem kit ELISA(Table of Materials)porque um ensaio Luminex para albumina não estava disponível naquele momento. Todas as medidas foram realizadas cuidadosamente seguindo as instruções dos fabricantes. Albumin quociente(Q albumina)e índice IgG (QIgG/Qalbumina)foram então usados para diferenciar o igg derivado do sangue versus CNS no CSF.
Como mostrado na Figura 3A,os níveis reais de IgG total são significativamente aumentados no CSF de ambos os modelos de roedores de EM quando comparados aos correspondentes controles simulados combinados por idade(p≤ 0,026). No entanto, camundongos R-EAE mostram valores dealbumina Q significativamente aprimorados(p ≤ 0,019), indicando aumento da permeabilidade da barreira nesses camundongos(Figura 3B). Por outro lado, não existem diferenças naalbumina Q entre tmev-idd e sham ratos (p = 0,49), corroborando assim a nossa descoberta anterior de uma barreira intacta em tmev-idd ratos7,8. Para discriminar ainda mais entre o IgG produzido transudate e intrathecally em R-EAE e TMEV-IDD, o Índice IgG foi medido, mostrando valores significativamente mais elevados em camundongos TMEV-IDD(p ≤ 0,0006), e, portanto, a produção intrathecal igg neste modelo (Figura 3C).
Uma barreira intacta em camundongos TMEV-IDD, juntamente com um alto índice IgG sugere que, neste modelo, o anticorpo é produzido dentro do SNC. Por outro lado, no R-EAE, uma quebra de barreira significativa e um baixo índice IgG fornecem evidências de que o CSF IgG é produzido principalmente por células B periféricas e não intratéis, sugerindo também que, neste modelo agudo de EM, o CSF IgG é derivado principalmente do soro.
Figura 1: Sangramento retro-orbital de camundongos. Esquerda: Colocação correta da agulha em relação ao sinuoso retro-orbital, ao globo ocular e à parte de trás da órbita. Direita: A localização da pipeta começa no canto medial do olho e desliza para o aspecto dorsal da órbita. O capilar é inserido em um ângulo de 45°. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Coleção CSF em camundongos. (A)As barras de orelha suportam a cabeça do rato, e o rato é colocado de modo que a cabeça dá forma a um ângulo de 135° com o corpo. A seta aponta para a cisterna magna exposta. (B)Por dissecação contundente com fórceps, os músculos são separados para expor a cisterna magna (apontada pela seta). Micrortratores são usados para segurar os músculos separados. (C)Um pequeno tubo capilar de vidro é usado para coletar CSF da cisterna magna. A CSF flui espontaneamente para o capilar, devido à pressão intracraniana. A seta aponta para o CSF coletado no capilar. (D)O CSF é transferido para um tubo de 0,5 mL através de uma seringa modificada de 3 mL. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Métodos quantitativos para a avaliação do aumento das concentrações de proteínas CSF são ferramentas úteis na caracterização do estado fisiológico e patológico do SNC. No entanto, além da quantificação confiável dos níveis de proteína CSF, a detecção de proteínas CSF requer uma expressão de resultados que discrimina entre frações derivadas do sangue e do SNC no CSF. No entanto, até à data, os ensaios de quantificação de proteínas comumente utilizados não permitem a discriminação entre os dois componentes proteicos, mesmo com o auxílio de ferramentas de alta taxa de taxa de taxa de taxa de trabalho. Assim, correções específicas para medições de proteínas foram propostas para distinguir entre proteínas sintetizadas dentro do compartimento do SNC e proteínas derivadas do sangue. Tais correções compensam a variabilidade individual em concentrações de soro e integridade de barreira. No geral, essas correções são baseadas em cálculos de um quociente CSF/soro(proteínaQ), que reduz a variabilidade devido a diferenças na concentração individual de proteína sérica. A variação daproteína Q relacionada às diferenças individuais na função de barreira pode ser ainda mais reduzida, relacionando aproteína Q a um quociente de albumina CSF/soro(Q albumina). A combinação de ambas as correções é geralmente conhecida como índice de proteína e é calculada comoproteínaQ /Qalbumina relação4,6.
Albumina, sintetizada e secretada pelo fígado, é a principal proteína plasmática que circula na corrente sanguínea. Como a albumina é produzida exclusivamente fora do SNC e seus níveis em CSF são baixos (~0,15 g/dL), o aumento dos níveis de albumina da CSF indicam danos ao BBI ou contaminação do sangue devido à hemorragia intrathecal ou à coleta traumática de CSF. Em qualquer uma dessas condições, a albumina transudates do soro para o CSF em proporção à sua concentração de soro. Portanto, na ausência de contaminação do sangue, aalbumina Q pode ser usada como indicador da função de barreira20. Por outro lado, aalbumina Q permanece constante dentro de faixas normais em seres humanos e animais com um BBI intacto21. Uma suposição fundamental para usar este quociente4,6 no cálculo intrathecal da síntese da proteína é que a quantidade aumentada de proteína de CSF na presença de uma barreira gotejante é proporcional ao aumento na concentração do albumina de CSF. Esta suposição foi confirmada experimentalmente em um estudo de 19774,no qual autores monitoraram em pacientes com EM a passagem sangue-CSF de IgG e albumina de radioetiquetado obtidos de soros humanos saudáveis.
Semelhante à albumina, qualquer proteína no sangue pode atravessar o BBI. Quando a barreira está intacta, aproteína Q é relativamente constante. Ao contrário da albumina, no entanto, muitas proteínas também podem ser sintetizadas dentro do SNC. Como conseqüência, umaproteína Q alterada pode resultar de uma barreira danificada e/ou aumento da produção intrathecal de proteína. No entanto, quando uma concentração elevada de proteína CSF se deve apenas a um BBI comprometido, os valores tanto paraa proteína Q quanto para aalbumina Q são aumentados, em comparação com os valores desses mesmos quocientes em animais com uma barreira intacta. Em contraste, quando a barreira está intacta, o aumento das concentrações de proteína CSF é mais provável devido ao aumento da síntese intrathecal, e apenas aproteína Q é finalmente aumentada.
O uso do índice de proteína pode ser parcialmente limitado por cinco fatores: 1) a grande variabilidade da concentração de albumina csf em animais saudáveis, 2) o raio hidrodinâmico diferente de proteínas, 3) a expressão endógena do SNC de proteínas, 4) diferentes técnicas de amostragem e 5) as diferenças morfológicas do BBI. A grande variabilidade da concentração de albumina csf em animais saudáveis resulta em considerável variabilidade nos valores para o índice de proteína final. Em seres humanos, por exemplo, aalbumina Q é dependente da idade, uma vez que aumenta com a idade22. Um relatório anterior também mencionou uma diferença baseada no sexo emQ albumina em uma população saudável23. Da mesma forma, em camundongos concentrações albumina dependem de idade e rato estirpe24, por exemplo, oalbumina Q para jovens, do sexo masculino, C57Bl / 6 ratos podem ser diferentes doalbumina Q para velhos, femininos, dba/ 1J ratos. Portanto, intervalos de referência padronizados para integridade de barreira não podem ser estabelecidos entre e dentro das espécies, e os limites apropriados devem ser calculados com base nas condições experimentais específicas.
Outro fator que causa variabilidade nos índices normais entre as proteínas é o seu tamanho molecular. A passagem de proteínas sérica através do BBI depende de seu tamanho molecular, e a correlação entre a taxa de afastamento e o peso molecular (MW) é amplamente utilizada para avaliar a permeabilidade do BBI. As estruturas gerais da proteína variam no tamanho de dez a diverso mil ácidos do amino. Algumas proteínas são de tamanho molecular relativamente pequeno, como quimiocinas, com um peso molecular variando entre 8 e 20 kDa. Um MW tão baixo favorece a travessia do BBI, resultando em maiores índices de proteína normal. De forma diferente, outras proteínas, como a IgM, são muito grandes (900-950 kDa), mostrando, portanto, índices muito baixos em condições normais6. No entanto, isso nem sempre é o caso, uma vez que, apesar de um MW semelhante, algumas proteínas permeiam a barreira muito melhor do que outras proteínas, possivelmente por causa de uma forma diferente. Assim, o coeficiente de difusão de uma proteína, e, portanto, os radii hidrodinâmicos calculados a partir dele, depende de tamanho e forma das moléculas25. A diferença fundamental entre o volume geométrico e o volume hidrodinâmico de uma proteína torna-se mais evidente com grandes proteínas acima de 150 kDa. A diminuição das taxas de desminagem de ceruloplasmin (132 kDa), IgG (150 kDa) e IgA (150 kDa) refletem a heterogeneidade hidrodinâmica dessas três proteínas, que possuem MWsemelhantes 25. Também é possível que haja produção intratacal de proteínas em circunstâncias normais. Alguns quimiokines, por exemplo, CXCL10, são tipicamente produzidos intrathecally, enquanto outros, por exemplo, CXCL13, não são26,27. Isso significa que a interpretação dos índices de proteínas na maioria das condições experimentais geralmente requer análise de controles não tratados por idade, sexo e tensão.
Os níveis de proteína nos fluidos também podem ser afetados por diferentes técnicas de amostragem. Embora isso possa não ser um problema para a coleta de CSF, como descrito aqui - não há diferenças na amostragem de CSF entre os procedimentos de sobrevivência descritos e não sobrevivência, diferentes métodos de coleta de sangue podem ter um impacto sobre a quantidade total de proteína sérica. Alguns métodos de coleta de sangue produzem sangue arterial, outros produzem sangue venoso, enquanto outros ainda produzem uma mistura de ambosos 14. A amostra obtida a partir da sobrevivência retro-orbital sangramento é uma mistura de sangue venoso e fluido de tecido, enquanto a coleta de sangue terminal da punção cardíaca pode produzir sangue venoso ou arterial ou uma mistura de ambosos 14. Em animais saudáveis, o teor total de proteína e albumina do soro sanguíneo arterial pode ser ligeiramente maior do que as mesmas frações do soro de sangue venoso28. Isso deve ser levado em consideração quando as amostras de sobrevivência e não sobrevivência são comparadas.
Finalmente, uma característica importante a considerar é a estrutura morfológica heterogênea do BBI, que compreende pelo menos duas barreiras distintas, a barreira hematograto (BBB) localizada no endotelio dos microvasos cerebrais e a barreira sangue-CSF (BCSF) localizada no epitela dos plexo tróimas29. Ambas as barreiras restringem e regulam a passagem de moléculas e células entre os compartimentos periférico e cefalorraquidiano, embora o façam por diferentes mecanismos. Enquanto o BBB é uma barreira física real, caracterizada por uma interação complexa entre as células, o BCSF é mais uma barreira fisiológica, que depende principalmente do fluxo de CSF. Reduções na produção, liberação e vazão da CSF devido a condições neurológicas e/ou trauma sustem a função bcsf, aumentando assim aalbuminaQ em9,30,31,32. Portanto, aalbumina Q serve como um marcador melhor da permeabilidade bcsf ao invés do BBB ou geralmente permeabilidade BBI.
Em resumo, o cálculo de um índice de proteína é um método relativamente simples e bem caracterizado para a discriminação entre proteínas transudate e intrathecally produzidas. A vantagem de aplicar esta fórmula para corrigir a medição geral de proteínas em amostras de CSF é que ela gera uma variável objetiva para quantificar a síntese intrathecal de proteínas e medir o BBI, especificamente bcsf, (dys)função. Dada a robustez dessa abordagem, a correção da proteína CSF atinge através do índice dealbumina e proteína Q fornece uma linha de base contra a qual avaliar (1) a origem fisiopatofica de qualquer proteína CSF e (2) a estabilidade e a importância da integridade da barreira. Aqui é apresentado um protocolo detalhado, desde CSF e coleta de sangue até os cálculos finais que corrigiram a quantidade total de proteína CSF, que se aplica aos modelos de camundongos para doenças neurológicas. No entanto, o mesmo protocolo pode ser facilmente adaptado ao estudo da CSF e síntese intrathecal de proteínas em qualquer animal, incluindo os seres humanos. Qalbumina e índice IgG já são comumente utilizados na prática clínica para o diagnóstico de doenças neurológicas inflamatórias6. Esses mesmos parâmetros também têm sido usados com sucesso para avaliar uma ampla gama de citocinas e quimiocinas em pacientes com doenças inflamatórias desmielinating26,33,34.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina e Pesquisa Comparativa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Fundo de Pesquisa Bornstein financiou esta pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
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