Summary
Vi beskriver en protokol til ultralyd guidet implantation af murine-afledte pancreas duktalt adenocarcinom cellelinjer direkte ind i den indfødte tumor site. Denne fremgangsmåde resulterede i bugspytkirtel tumorer detekterbare ved ultralydsscanning inden for 2-4 ugers injektion, og signifikant reduceret andelen tumor celle såning på peritonealdialyse væggen i forhold til kirurgisk ortotopisk implantation.
Abstract
Den nylige succes med immun check point blokade i melanom og lunge adenokarcinom har galvaniseret feltet af immuno-onkologi samt afsløret begrænsningerne af de nuværende behandlinger, som de fleste patienter ikke reagerer på immunterapi. Udvikling af nøjagtige prækliniske modeller til hurtigt at identificere nye og effektive terapeutiske kombinationer er afgørende for at løse dette uopfyldte kliniske behov. Pancreas duktalt adenocarcinom (PDA) er et kanonisk eksempel på en immun check point blokade resistente tumor med kun 2% af patienterne reagerer på immunterapi. Den genetisk manipulerede KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 CRE (KPC) musemodel af PDA rekapitulerer menneskelig sygdom og er et værdifuldt redskab til vurdering af terapier for immunterapi resistente i prækliniske omgivelser, men tid til tumor debut er meget variabel. Kirurgisk ortotopisk tumor implantation modeller af PDA opretholde immun biologiske kendetegn af KPC vævs specifik tumor mikromiljø (TME) men kræver en tidskrævende procedure og indføre afvigende inflammation. Her bruger vi en ultralyd-guidet ortotopisk tumor implantation model (ug-Otim) til ikke-invasivt injicere KPC-afledte PDA cellelinjer direkte ind i mus bugspytkirtlen. UG-OTIM tumorer vokse i det endogene væv site, trofast rekapitulere histologiske funktioner i PDA TME, og nå indskrivning størrelse tumorer for prækliniske undersøgelser af fire uger efter injektion med minimal såning på peritonealdialyse væggen. UG-OTIM-systemet beskrevet her er en hurtig og reproducerbar tumor model, der kan give mulighed for høj gennemløbs analyse af nye terapeutiske kombinationer i murine PDA TME.
Introduction
Pancreas duktalt adenokarcinom (PDA) er en notorisk aggressiv sygdom, der er refraktær over for aktuelle behandlinger, med en dystre 5-årige overlevelse på 9%1. PDA for nylig overgået brystkræft til at blive den tredje førende årsag til kræft-relaterede dødelighed i USA og forventes at blive den anden-førende årsag (bag kun lungekræft) i år 20302. En række funktioner karakteristisk for immunologisk ' kold ' PDA tumor mikromiljø (TME)-herunder høj infiltration af Immunsuppressive myeloid cellepopulationer3,4,5,6,7, tætte stromale deposition8,9,10,11, og en mangel på T-celler5,12,13-bidrage til svigt af immunoterapi i PDA14. Med henblik herpå er brugen af en klinisk relevant dyremodel et vigtigt redskab til at undersøge effekten af nye lægemiddelkombinationer for immunologisk kolde tumorer in vivo.
Den genetisk manipulerede KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; PDX-1 CRE (KPC) musemodel af PDA overfører trofast de vigtigste kliniske aspekter af human PDA, herunder de molekylære drivkræfter for sygdom og histopatologiske funktioner15. KPC tumorer udvikler sig spontant i fuldt immunkompetente mus, giver mulighed for forhør af terapeutiske tilgange, herunder kemoterapi16,17, immunterapi18,19,20,21, og stroma-målretning terapi9,11,22in vivo før administration af disse lægemidler i den kliniske forsøg indstilling. På trods af sine mange styrker som en præklinisk model af PDA, er brugen af KPC mus dårligt stillet af den meget variable progression af spontan tumor udvikling som tumor debut kan variere fra 4 til 40 uger (hvilket kræver opretholdelse en stor avl koloni)15. Derudover har KPC-mus potentialet for polyklonale primære tumorer23, og der er en hurtig nedgang i dyrs sundhed og stigning i co-morbiditeter, herunder kakeksi og ascites som sygdom skrider15.
Et alternativ til den spontane KPC musemodel er at bruge en ortotopisk implantation model af PDA24. Den direkte kirurgiske implantation af tumorcellelinjer i til den indfødte væv site er en mere omkostningseffektiv og forudsigelig metode til at rekapitulere vævs-specifikke tumor mikromiljø (TME) af PDA. Tumor implantation giver mulighed for injektion af klonale tumorcellelinjer til genetisk backkrydsede mus5, giver mulighed for Host mus med yderligere genetiske manipulationer, der ville være tidskrævende at opdrætte i KPC musemodel. Men, bugspytkirtel tumor implantation kræver en arbejdskraftintensiv kirurgisk procedure, der introducerer afvigende inflammation på sutur stedet i bugvæggen24,25,26, og ofte omfatter en langvarig post-operative opsving27,28,29.
Teknologiske fremskridt inden for ultralydscanning ved hjælp af gnaver specifikke transducere giver billeder i høj opløsning i realtid. Guidet af ultralyd billeddannelse af injektion nål bevægelse i bughulen, kan man specifikt implantat tumorceller i bugspytkirtlen, udnytte fordelene ved ortotopiske tumor injektioner i fravær af kirurgisk implantation og associeret betændelse. Denne tilgang, kaldet ultralyd-guidet ortotopisk tumor implantation model (ug-Otim) er tidligere blevet etableret i en xenograft modeller af kræft i bugspytkirtlen30 samt i flere andre kræft modeller, herunder Ewings sarkom, neuroblastom og blærekræft31,32.
Her, vi giver en detaljeret protokol til udførelse af ultralyd-guidede injektioner af tumorcellelinjer i at murine bugspytkirtlen. Vi viser de resulterende tumorer rekapitulere de histologiske og immunologiske egenskaber af KPC TME og kan derfor anvendes til at undersøge nye terapeutiske kombinationer, herunder immunotherapies, til hurtigt at afsløre de mest lovende behandlinger til at flytte frem til kliniske forsøg.
Protocol
Dyre protokoller blev revideret og godkendt af den institutionelle Komité for dyrepleje og-anvendelse ved University of Pennsylvania. Kvindelige 5-til-6-ugers-gamle C57Bl/6 mus blev købt (Se tabel over materialer) og anvendes efter 1-3 ugers hvile. Universitets laboratoriets dyreressourcer førte tilsyn med dyrenes pleje.
1. forberedelse af PDA tumorcellelinjer til injektion
- Grow KPC-afledte PDA cellelinje i tumor celle (TC) medier: Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum (FBS), 2mM L-glutamin og 83 μg/mL gentamicin.
- Lad cellerne vokse til 80-85% konfluency i kolber, som vedligeholdes ved 37 °C og 5% CO2.
- Når cellerne når optimale konfluency, dekanteres medierne fra kolber og vask to gange med varm (37 °c), steril fosfat-bufferet saltvand (PBS), nok til at dække enkeltlags af vedsiddende celler. Pipette af de resterende PBS efter endelig vask.
- Tilsæt varm (37 °c) 0,05% trypsin-EDTA-opløsning (0,5% Stock trypsin-EDTA fortyndet 1:10 i hanks'-baseret enzym-fri celle dissociations buffer) til at dække enkeltlags i hver kolbe og inkubere ved 37 °c i 3-5 minutter, eller indtil cellerne løsnes ved at tappe på siderne af Kolbe.
- 10-25mL kold (4 °C), steril TC-medier tilsættes til hver kolbe for at standse trypsiniseringsreaktionen. Hæld cellesuspension i en 50mL koniske (s), fyld til 50mL med kold TC-medier.
- Centrifugeres ved 300g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten og resuspension pellet i kold, steril DMEM (serum-fri). Hvis flere koniske rør blev brugt til at indsamle celler, kan alle pellets kombineres til en enkelt konisk på dette trin.
- Centrifugeres ved 300g i 5 minutter ved 4 °.
- Gentag trin 1.6-1.7 to gange. I endelig vask, tage en alikvot celler til optælling. Cellelevedygtighed på ≥ 90% anbefales til in vivo -injektioner.
- Forbered en ensartet suspension af PDA tumorceller på den ønskede koncentration af tumorceller. Vi brugte 10-20 x 106 celler/mL (250.000 til 500.000 celler/25μl) i den passende mængde steril, kold DMEM eller PBS, men hver cellelinje skal titreres in vivo.
- Hold cellerne kolde, på is, indtil de er klar til at injicere.
2. Prækirurgisk klargøring af mus
Bemærk: dette trin anbefales at blive udført 24 timer før proceduren.
- Placer bure, der indeholder eksperimentelle mus, på en varmere indstillet til 37 °C.
- Få nye, rene bure og Placer på en anden opvarmnings platform, der er indstillet til 37 °C.
- Rengør det biologiske sikkerhedskabinet, induktions kammeret og ultralyd (US)-scenen grundigt med steriliserings (Se tabel over materialer).
- Drej opvarmningsfunktionen på den amerikanske scene til 37 °C.
- Tænd for anæstesi maskinen: Justér dialerne på rørfordeleren, så luftstrømmen kun er begrænset til induktions kammeret. Tænd for iltbeholderen, og Indstil strømningshastigheden til 1 L/min. Drej isofluran vaporizer til 2-3%.
- Placer en enkelt mus i induktions kammeret. Monitor musen, indtil ikke længere mobil og vejrtrækning er bremset.
- Juster dialerne på splitter, så luftstrømmen er tilladt til både induktions kammeret og næse keglen. Hurtigt flytte musen fra induktions kammeret og lægge det i ventrale recumbency på den varme amerikanske scene med sin næse i næsen kegle.
- Test niveauet af induktion ved at observere enhver refleksiv respons på tå klemning. Hvis der ikke er nogen, er musen klar til hårfjerning.
- Placer en lille mængde øjen smøremiddel (Se tabel over materialer) på begge øjne for at forhindre væv dehydrering. Drej musen, så det lægger i dorsale recumbency på scenen. Forsigtigt overholde de øvre og nedre ekstremiteter til scenen med papir tape for at maksimere eksponeringen af maven og fastgør musen til scenen.
- Brug en steril bomulds spids applikator til at anvende en generøs lag depilatory creme til den øverste venstre kvadrant af maven. Den depilatory bør anvendes i det generelle område af milten og strækker sig mod midterlinjen. Lad det sidde i ca. et minut.
- Test graden af hårfjerning ved forsigtigt at bruge den modsatte ende af bomulds spidsen applikator at tørre væk depilatory creme, når det fjerner nemt, tørre maven ren med en tør gaze pude. Derefter våd et rent lag af gaze med en lille mængde af varmt saltvand og tørre området igen for helt at fjerne depilatory agent. Må ikke overstige 2 fulde minutter af direkte kontakt på muse huden for at reducere risikoen for kemiske forbrændinger.
- Når håret er blevet tilstrækkeligt fjernet fra maven, returnere musen til en ny, ren bur på varmere.
- Mens det første dyr gennemgår hårfjerning på den amerikanske scene, kan det næste dyr tilsættes til induktions kammeret.
- Før bedøvelse den næste bur af mus, slukke for isofluran og skylle induktions kammeret med ilt. Rengør induktions kammeret og den amerikanske Stage/næse kegle med sterilant. Gentag trin 2.5-2.14, indtil alle bure og mus har gennemgået hårfjerning.
Bemærk: faste dyr ved midlertidig tilbagetrækning af fødevarer i en periode forud for implantation kan anses for at minimere visuel obstruktion af abdominale organer på grund af ufordøjet mad i maven og tarmene (12-24 timer). Vand begrænsning anbefales ikke. Hvis dyrene fastgøres, anbefales det, at de behandles med en injektion af 1mL varm (37 °C), steril saltvand efter tumor injektion for at forhindre dehydrering.
3. ultralyd-guidet implantation af PDA-celler
Bemærk: alle ultralyds procedurer udføres ved hjælp af ultralyd Imaging Machine og software (Se tabel over materialer). Transduceren har en Center frekvens på 40 MHz og en båndbredde på 22-55 MHz.
- Juster ultralyds platformen sådan, at platformens overflade er parallel med gulvet, og investigator står over for dyrets venstre side med dyrets hoved til højre. Juster transducer positionen, så der opnås et tværgående abdominal billede (figur 1a).
- Anæstetize musen til at blive injiceret som beskrevet i trin 2.1-2.8. Stabiliserer musen på den amerikanske platform som beskrevet i trin 2,9.
- Påfør en generøs mængde varm (37 °C) ultralyd gel til den hårløse del af maven.
- Sænk forsigtigt transduceren for at kontakte muse maven. Juster transduceren efter behov, indtil bugspytkirtlen er tydeligt synlig. Find den venstre nyre og milt for at give en nøjagtig orientering af bughulen.
Bemærk: da transducer positionen er blevet ændret for at give adgang til venstre side af maven, er X-og Y-aksen på scene kontrollerne nu inverteret. - Læg en 29G x 1/2 "insulin sprøjte (Se tabel over materialer) med 25μl tumor cellesuspension. Tør kanylespidsen med steril sprit-prep-pad inden injektionen for at minimere tumor celle såning i bugvæggen.
- Brug sløv kant tang, tag fat i huden og peritonealdialyse væggen for at øge spændingen på det ønskede injektionssted. Hold sprøjten ved ca. 25 °-45 ° vinkel til ultralydplatformens overflade, og træk langsomt nålen gennem huden og peritonealvæggen. Bekræft, at nålen er punkteret gennem peritonealdialyse væggen, før du fortsætter til næste trin. En lille pop bør mærkes som nålen gennemborer peritonealdialyse væggen.
- Under ultralyd visualisering, guide nålen direkte ind i bugspytkirtlen (figur 1B-C). Bekræft nålen er inden for bugspytkirtlen væv ved forsigtigt at flytte sprøjten tønde op og ned. Hvis placeringen er korrekt, vil nålens spids forblive i bugspytkirtlen, mens sprøjtecylinderen bevæger sig.
- Injicer langsomt tumorcellerne og Bekræft, at cellerne implanteres på det ønskede sted ved dannelsen af en flydende bolt i bugspytkirtlen (synlig på ultralyds skærmen, figur 1D).
Bemærk: nogle modstand bør mærkes, mens deprimerende stempel. Vær omhyggelig med ikke at gennembore bugspytkirtlen flere gange, da dette øger sandsynligheden for lækage i bughulen. - Når den fulde mængde af suspension er blevet injiceret og en flydende bolt kan ses i bugspytkirtlen, holde nålen meget stadig i flere sekunder. Langsomt trække nålen fra mus maven, tager stor omhu ikke at forstyrre de injicerede celler.
- Placer musen i et rent, varmt bur og sørg for, at musen fuldt ud genopretter fra anæstesi. Gentag denne proces for alle dyr.
- Før bedøvelse den næste mus, rense induktions kammeret og US Stage/næse kegle med sterilant.
- Gentag trin 3.2-3.11, indtil alle mus er injiceret.
Representative Results
Formålet med denne rapport var at tilvejebringe en detaljeret protokol til udførelse af ultralyds styret implantation af KPC-afledte PDA-cellelinjer. I de repræsentative eksperimenter, der er vist i figur 2-4, bekræfter vi, at ug-Otim-tumorer vokser med en konsistent hastighed og på en dosisafhængig måde. Desuden viser vi, at UG-OTIM tumorer rekapitulere de fremtrædende immunologiske og histologiske funktioner i KPC TME. Således er UG-OTIM systemet en præklinisk PDA musemodel, der kan bruges i en høj gennemløb måde til hurtigt at screene nye behandlings kombinationer in vivo.
Ved hjælp af UG-OTIM-protokollen, der er skitseret her, blev musene forberedt til implantation, fastgjort til den opvarmede ultralyds platform, og positionerne for både platformen og transduceren blev justeret for denne procedure som vist i figur 1A. Ultralyd Imaging med høj opløsning blev brugt til at identificere et injektionssted i muse bugspytkirtlen, som kunne målrettes uden perforering af enten nyrerne eller milten (figur 1B). Under ultrasonografisk visualisering blev nålen omhyggeligt introduceret til bughulen gennem peritonealdialyse væggen og guidet ind i musens bugspytkirtel (figur 1C). Efter korrekt placering af nålen blev etableret, tumor cellesuspension blev injiceret meget langsomt ind i bugspytkirtlen. En vellykket implantation blev bekræftet af tilstedeværelsen af en boble i bugspytkirtlen (figur 1D). I tidlige eksperimenter blev musen ofret, og effekten af proceduren blev verificeret ved direkte at visualisere en væske bolt i den grove bugspytkirtel væv (figur 1E).
Tumor implantation og vækstrate blev overvåget af ugentlige ultralyd Imaging. Vellykkede implantationer producerede tumorer, der var indeholdt inden for grænserne af bugspytkirtlen i hele tidspunktet for forsøget (figur 2A). Ultralyd software (Se tabel over materialer) anvendes tilladt for tumor område og volumen, der skal bestemmes for hvert tidspunkt samt for 3D-kortlægning af målte tumorer, der skal genereres (figur 2B), og 3D-billeder blev bekræftet på tidspunktet for mus nekropsy (figur 2C). En forkert celle indsprøjtning under UG-OTIM-proceduren kan resultere i udvikling af en peritonealvægtumor (et repræsentativt billede, som er vist i figur 2D). Mus, der er til stede med peritonealtumorer, kan udelukkes fra yderligere undersøgelser.
For at bestemme koncentrationen af celler, der er optimale til brug i prækliniske studier, blev en C57Bl/6 KPC-afledt PDA-cellelinje (4662)9 sprøjtet ind i naive vildtype C57Bl/6-mus på tværs af seks uafhængige eksperimenter. Denne cellelinje (passaged in vitro seks gange) var afledt af en fuldt backkrydsede KPC tumor-bærende mus (> 10 generationer, bekræftet af SNP-analyse19) for at forhindre molekylære komplekse komplekse mismatch tumor afvisning antigener. Tumor celler blev injiceret ved en lav titer (1,25 x 106 celler/25μl) og ved en høj titer (5 x 106 celler/25μl) dosis. De høje titer tumor injektioner resulterede i en større andel af tumor-bærende dyr tre uger efter injektioner i forhold til den lave titer kohorte (figur 3a). På trods af forsinkelsen i tumor debut, den samlede tumorvækst rate var ikke signifikant forskellige mellem de to doser (figur 3B). På samme måde, mens overlevelsesraten mellem de to kohorter ikke var signifikant anderledes, data tendensen i retning af svagt forbedret overlevelse i lav titer kohorte (figur 3C). Den høje titer kohorte producerede også en større andel af mus med tumorer, der var tilmeldbare i prækliniske studier (udpeget ved ≥ 20mm3 tumorvolumen) med fire uger efter injektion end den lave titer kohorte (figur 3D). De fleste mus fra både høj og lav titer kohorter præsenteret med tilmeldbare tumorer ved dag 25 og udviklet slutstadiet sygdomssymptomer herunder ascites (data ikke vist). Metastaser, som ikke forekommer ved hjælp af 4662 ved celle doser fra denne protokol, kan være modelleret med forskellige cellelinjer eller doser33.
UG-OTIM-metoden krævede en beherskelse af finmotorik for præcist at lokalisere det ønskede injektionssted, hvilket var udfordrende i vores tidligste eksperimenter. Af denne grund, vi omfattede et bord skildrer antallet af dyr, der udviklede tumorer i bugspytkirtlen (vellykkede implantationer) sammenlignet med det samlede antal dyr, der gennemgik ultralyd-guidet tumor implantation (tabel 1). Dyr blev elimineret fra fremtidige analyser, hvis tumorer udviklede sig i en uønsket placering (dvs. nyre), eller hvis der ikke var tegn på tumor ved seks uger efter injektion, som angivet. Den ugentlige progression af andelen af mus, der bærer tilmeldelig pancreastumorer (≥ 20 mm3 tumorvolumen) fra hvert eksperiment, er også vist i tabel 1.
For at afgøre, om der var en fordel ved at bruge ug-Otim tilgang snarere end den traditionelle kirurgiske ortotopisk model (ud over tid investering efter at få færdigheder på teknikken), vi sammenlignede såning af PDA tumorer i peritonealdialyse væggen af mus efter hver procedure. Vi konstaterede, at kun 2/31 mus (6,5%) udviklede utilsigtede peritoneale vægtumorer efter UG-OTIM injektioner, som sammenlignede 7/15 mus, der udviklede peritoneale væg tumorer efter kirurgisk injektion (46,6%, p < 0,0029) (tabel 1). Således, satsen for såning yderligere tumorer i bughinden er stærkt reduceret i ug-Otim metode i forhold til kirurgisk implantation.
Ved ofring af mus, der bærer UG-OTIM tumorer, fandt vi, at den grove anatomi af tumorer var magen til spontane KPC tumorer (figur 4A). Histologisk analyse viste et mønster af unormale duktalt strukturer, der var ens i begge modeller, og at rekapituleret morfologien af den menneskelige sygdom (figur 4B). For at undersøge immun infiltratet inden for både KPC og UG-OTIM tumorer, blev repræsentative histologiske prøver plettet for CD3 (udtrykt ved T-celler) og F4/80 (udtrykt ved makrofager). I begge modeller afslørede farvnings mønstre tumorer, der var dårligt infiltreret af T-celler (figur 4C), men stærkt infiltreret af makrofager (figur 4D). Denne konstatering er i overensstemmelse med immunologisk kold fænotype af de fleste humane og KPC PDA prøver5,7,12.
Figur 1: ultralyd-guidet implantation af PDA-celler i murine bugspytkirtlen. (A) orientering af mus, ultralyd fase, og ultralyd sonde bruges til at opnå en høj opløsning billede af abdominale organer. Bemærk scenen og platformen er blevet vendt 90 ° fra standardorienteringen for at give nem adgang til den øverste venstre kvadrant af mus maven. (B) ultrasonografisk billede, som skildrer identifikationen af nyrer, milt og bugspytkirtel. Her er injektions nålen placeret mod muse maven. (C) ultrasonografisk billede, som skildrer nålen i musens bugspytkirtel. (D) ultrasonographic billede skildrer boblen på injektionsstedet (skitseret i blå) efter kontrolleret injektion af tumorceller i bugspytkirtlen. E) laparotomi, der afslører den flydende bolt indeholdende PDA-celler i bugspytkirtlen efter ultralyd guidet injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: overvågning tumorvækst efter ug-OTIM injektion. (A) repræsentativt ultrasonografisk billede af ug-Otim tumor (skitseret i blåt) ved 2, 3 og 5 uger efter injektion, som angivet. (B) repræsentativ rekonstrueret 3D-billede af ug-Otim tumor 5 uger efter injektion ved hjælp af ultralyd software. (C) repræsentative brutto ANATOMI af ug-Otim tumor 5 uger efter injektion ved mus nekropsy. (D) repræsentativt ultrasonografisk billede af en peritonealvæg tumor vokser i det subkutane lag efter forkert celle injektion ved 7 uger efter injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: dosisafhængig indtræden af tilmeldbare tumorer efter ultralyd guidet injektion af PDA-celler. A) andelen af tumor bærende mus på indikerede tidspunkter efter injektion som beskrevet i figur 1 med høj titer (500.000 celler/25μl) eller lav titer (125.000 celler/25μl) tumorceller som indikeret. (B) tumor vækst kinetik af mus fra (a), hvert symbol repræsenterer en gruppe af mus, fejllinjer indikerer SEM.C) andelen af mus fra (a) levende på indikerede tidspunkter efter injektion. Mus blev aflives eller censureret, hvis tumorer var > 1000mm3 eller krops tilstand var fattige på grund af tumor komorbidities. D) tid til at få tumor debut for mus fra (A). Tilmeldelig tumorer anses for at være ≥ 20mm3 i volumen. Data repræsentant for 4 uafhængige eksperimenter med n = 8-20 mus/eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Eksperiment | Bugspytkirtel-tumor bærende/samlede injektioner | Uge 1 (kan Tilmelderes) | Uge 2 (kan Tilmelderes) | Uge 3 (kan Tilmelderes) | Uge 4 (kan Tilmelderes) | Seeded peritoneal tumorer |
| High titer | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| Lav titer | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| Kirurgisk injektion | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
Tabel 1: antallet af VELLYKKEDE ug-OTIM-tumorer sammenlignet med kirurgisk implantation. Data kombineret fra 2-4 uafhængige eksperimenter pr. høj eller lav titer tilstand med n = 5-10 mus per eksperiment. "Kirurgisk injektion" indikerer mus, der modtog abdominal laparoskopisk kirurgisk injektion af 125.000 tumorceller. "Tumor-bærende" indikerer mus med en pancreatisk tumor. "Tilmeldelig" indikerer andelen af tumor bærende mus på hvert tidspunkt med en tumorvolumen > 20mm3. "Seedede peritoneale tumorer" indikerer den samlede andel af tumor bærende mus, der havde samtidig såning af tumorer på peritonealdialyse væggen fra tumor celle injektion. Mus med tumorer, der præsenterer ukorrekt i andre væv end bugspytkirtlen (dvs. nyre), blev udelukket fra "tumor bærende" populationer (men inkluderet i totale injicerede mus). ND, ikke bestemt. Hyppigheden af peritonealvægsåning sammenligning af høje og lave titer grupper kombineret versus kirurgisk implantation, p < 0,0029 via 2-sidet T-test med Mann-Whitney post-test.
Figur 4: ug-OTIM tumorer rekapitulere KPC tumor mikromiljø. Repræsentative billeder vises. Øverste række, KPC tumorer. Nederste række, UG-OTIM tumorer ved 5 uger efter implantation. (A) grov anatomi af exciserede tumorer ved nekropsy. B) H & E (10x, bar = 100μm)C) immun Histokemisk farvning for CD3 (brun) (10x, bar = 100μm). D) Immunofluorescent farvning af F4/80 (rød) og dapi (blå) (4X, bar = 500μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi viser her, at brugen af høj opløsning ultrasonografi til direkte implantation af murine PDA cellelinjer til autoktont væv site er et pålideligt alternativ til både KPC og kirurgiske ortotopisk modelsystemer. UG-OTIM producerer biologisk relevante tumorer, der bevarer de immunopatologiske funktioner i PDA med en forkortet tidsramme til tumor-diagnose og pålidelig tumorvækst kinetik. Ultralyd guidet injektion kan derfor tjene som et nyttigt værktøj til hurtig produktion af mus, der bærer ortotopisk implanteret PDA-tumorer, hvilket giver mulighed for undersøgelse af terapeutiske kombinationer i en klinisk relevant model.
Ultralyd-guidet implantation giver vigtige forbedringer i forhold til standard modeller for præklinisk undersøgelse. For det første eliminerer denne procedure den tidskrævende overvågning af KPC-mus til udvikling af spontane tumorer ved direkte at implantering fuldt ud C57BL/6 backkrydsede PDA-celler i murine bugspytkirtlen. For det andet, svarende til traditionelle kirurgiske ortotopisk injektioner, ug-Otim tilgang giver mulighed for kontrol over celle linjen injiceres, herunder udvælgelse af en monoklonale tumor cellelinje og/eller ex vivo manipulation af celle linjen, samt kontrol over værten modtager tumor celle implantation. For det tredje undgår denne minimalt invasive teknik det besværlige arbejde med overlevelses kirurgi og omgår den komplicerede postoperative restitutionsperiode for dyrene samt inflammatoriske signaler fra kirurgisk sårheling. Endelig, UG-OTIM tumorer-svarende til kirurgisk implantation-rekapitulere TME observeret i KPC mus, herunder lav T celleinfiltration og høj makrofag infiltration. Således, UG-OTIM model bevarer nøglefunktioner i KPC tumorer uden de yderligere komplikationer, der retard terapeutiske undersøgelser i den spontane KPC model.
En række kritiske trin i protokollen er nøglen til at mestre for succesen af teknikken. Ekspertise i murine ultralyd Imaging er afgørende for denne procedure, men den manuelle fingerfærdighed kræves for at kunne implantat celler i bugspytkirtlen er en færdighed sæt, der skal udvikles uafhængigt. For mus på en 12-timers lys/mørk cyklus, fastende dyrene natten sikrede maven og tarmene blev ryddet af enhver uforfordøjet mad, der kunne blokere visning af bugspytkirtlen, nyrer og milt ved ultralyd. Desuden skal hver cellelinje, der anvendes til ortotopisk injektion, titreres før yderligere eksperimenter for at forstå vækst kinetikken og bestemme det metastatiske potentiale33. Under injektionen skabte brugen af pincet til at knibe huden på injektionsstedet den spænding, der var nødvendig for forsigtigt at punktere gennem både huden og peritonealdialyse væggen. Et vigtigt skridt i proceduren var at omhyggeligt guide nålen ind i bugspytkirtlen uden perforering af vævet eller punktering en off-Target site såsom milt eller nyrer. Bekræftelse af en flydende bolt var den bedste indikator for vellykket tumor celle injektion i det rette væv. Efter injektion, nålen skal trækkes langsomt for ikke at forstyrre væsken bolt. Vi konstaterede, at en række prøve injektioner med enten DMEM eller Trypan Blue hjalp med at udvikle en beherskelse af de finmotoriske færdigheder, der var nødvendige for denne injektion.
Under fejlfindingen af denne procedure identificerede vi en række faktorer, der påvirkede protokollens succes. I forsøg eksperimenter, vores hyppigste fejl var perforere nyrerne under implantation, som forekom oftere i vores tidlige eksperimenter tyder på, at regelmæssig udøvelse af denne færdighed forbedrer færdighed. Derudover fandt vi, at bekræfte tilstedeværelsen af en flydende bolt efter tumor celle injektion via både ultralyd og direkte visualisering på nekropsy under fejlfindings fasen forbedret vellykket injektion teknik. Hvis dannelsen af en boble ikke er bekræftet ved ultralyd under injektionen, kan placeringen af nålen justeres før helt deprimerende sprøjten for at frigive den resterende bolt af tumorceller. Vi bemærkede også, at suspension mængder injiceret for hurtigt resulterede i spild af tumorceller i bughulen eller sammenbrud af væsken bolt i bugspytkirtlen. Generelt, disse dyr gik på at udvikle bugspytkirtel tumorer med undtagelse af n = 7 dyr, der viste ingen tegn på tumor 4 uger efter injektion. Dette resultat blev kun rapporteret i vores første forsøg (og 6/7 dyr blev injiceret med en lav titer af tumorceller). Mus, der har tvivlsomme tumor celle injektioner, eller kræver Repositionering af nålen, bør overvåges nøje for udviklingen af tumorer uden for bugspytkirtlen.
De forreste begrænsninger af ultralyd-guidet metode er tilgængeligheden af de nødvendige instrumenter og de tekniske færdigheder i forbindelse med tumor implantation. Proceduren er ikke helt steril, da musen injiceres ikke-sterilely på ultralyd platform, med sprøjten og nål spids passerer gennem ultralyd gel. Selvom vi ikke har set nogen tegn på infektion i n = 148 mus på tværs af i alt 8 uafhængige eksperimenter siden initiering af disse undersøgelser, er det muligt, at en smitsom agens kan trænge ind i bugspytkirtlen gennem kanylen under denne proces. Som sådan bør så mange aspekter af protokollen som muligt (herunder handsker, ultralydflader, iskasser) sprøjtes med desinfektionsmiddel eller 70% ethanol for at reducere den potentielle udsættelse for patogener. En yderligere begrænsning af den nuværende protokol var manglen på metastase ved hjælp af 4662-celle linjen ved de aktuelle fortyndinger. Hver cellelinje, der anvendes i UG-OTIM-systemet, bør titreres til de ønskede vækstrater samt metastatisk potentiel33. Endelig etablerede vores nuværende protokol teknikker til injektion af tumorceller i en enkelt cellesuspension. Men, tilsætning af en ekstracellulær matrix substrat kunne tilsættes til potentielt forbedre tumor etablering og forhindre tumor celle lækage (som det anvendes i kirurgiske implantation modeller27,30,31,32). Således kan mange af begrænsningerne af UG-OTIM overvindes med passende testning af de cellelinjer, der anvendes i ortotopiske injektioner.
Sammenfattende, UG-OTIM model er en præcis metode til vævs-instrueret injektion af tumorceller i at murine bugspytkirtlen. Denne minimalt invasive implantationsteknik gavner både investigator og dyr ved at reducere procedure tiden, minimere post kirurgiske komplikationer og forbedre nøjagtigheden af injektionen. Tumorer som følge af UG-OTIM injektioner bevarer de karakteristiske immun biologiske egenskaber af spontane KPC tumorer, har pålidelig tid til tumor debut, og reproducerbare tumorvækst kinetik. Derfor kan UG-OTIM-modellen anvendes i en relativt høj gennemløb til at afhøre terapeutiske kombinationer i prækliniske omgivelser for at afsløre nye behandlinger for patienter med det største uopfyldte kliniske behov.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Dr. Robert Vonderheide og alle medlemmer af Vonderheide laboratorium, alle medlemmer af pancreas cancer Mouse Hospital, Dr. ben Stanger, bugspytkirtlen Cancer Research Center ved University of Pennsylvania, og Devora Delman for nyttige diskussioner. Dette arbejde er understøttet af finansiering fra Parker Institute for cancer immunterapi stipendiat (KTB) og bugspytkirtlen Cancer Research Center på University of Pennsylvania (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
