Summary
Descrevemos um protocolo para a implantação guiada por ultrassom de linhas de células de adenocarcinoma ductal pancreática derivada de urina diretamente no local do tumor nativo. Esta aproximação conduziu aos tumores pancreatic detectáveis pela exploração do ultra-som dentro de 2-4 semanas da injeção, e reduziu significativamente a semeadura da pilha do tumor da proporção na parede peritoneal em comparação à implantação ortotópica cirúrgica.
Abstract
O recente sucesso do bloqueio de pontos de verificação imunológico no melanoma e adenocarcinoma pulmonar tem galvanizado o campo da imuno-oncologia, bem como revelou as limitações dos tratamentos atuais, como a maioria dos pacientes não respondem à imunoterapia. O desenvolvimento de modelos pré-clínicos precisos para identificar rapidamente combinações terapêuticas novas e eficazes é fundamental para atender a essa necessidade clínica não atendida. O adenocarcinoma ductal pancreatic (PDA) é um exemplo canônico de um tumor resistente imune do bloqueio do ponto de verificação com somente 2% dos pacientes que respondem à imunoterapia. O KrasG12D+/-geneticamente modificado; Trp53R172H+/-; Pdx-1 Cre (KPC) modelo de camundongo de PDA recapitula a doença humana e é uma ferramenta valiosa para avaliar terapias para imunoterapia resistente no ambiente pré-clínico, mas o tempo para o início do tumor é altamente variável. Os modelos cirúrgicos de implantação de tumores ortotópicos de PDA mantêm as características imunobiológicas do microambiente tumoral específico do tecido KPC (TME), mas requerem um procedimento com uso intensivo de tempo e introduzem inflamação aberrante. Aqui, usamos um modelo de implante de tumorortópico ortotópico guiado por ultrassom (UG-OTIM) para injetar não invasivamente linhas de células PDA derivadas do KPC diretamente no pâncreas do camundongo. Os tumores UG-OTIM crescem no local do tecido endógeno, recapitulam fielmente as características histológicas do PDA TME e atingem tumores do tamanho de matrícula para estudos pré-clínicos em quatro semanas após a injeção com semeadura mínima na parede peritoneal. O sistema UG-OTIM descrito aqui é um modelo tumoral rápido e reproduzível que pode permitir uma análise de alta produção de novas combinações terapêuticas na Murine PDA TME.
Introduction
O adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) é uma doença notoriamente agressiva que é refratária aos tratamentos atuais, com uma taxa de sobrevivência sombria de 5 anos de 9%1. PDA recentemente superou o câncer de mama para se tornar a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em os EUA e é projetado para se tornar a segunda causa principal (atrás apenas de câncer de pulmão) até o ano de 20302. Uma série de características características do microambiente tumoral pda imunologicamente 'frio' (TME) incluindo alta infiltração de populações imunossupressivas de células mieloides3,4,5,6,7, densa deposição estrol8,9,10,11,e uma escassez de células T5,12,13- contribuem para o fracasso das imunoterapias em PDA14. Para este fim, o uso de um modelo animal clinicamente relevante é uma ferramenta essencial para investigar a eficácia de novas combinações de medicamentos para tumores imunologicamente frios in vivo.
O KrasG12D+/-geneticamente modificado; Trp53R172H+/-; Pdx-1 Cre (KPC) modelo de mouse de PDA recapitula fielmente aspectos clínicos salientes da PDA humana, incluindo os fatores moleculares da doença e características histopatológicas15. Os tumores kpc se desenvolvem espontaneamente em camundongos totalmente imunocompetentes, permitindo o interrogatório de abordagens terapêuticas, incluindo quimioterapia16,17,imunoterapia18,19,20,21,e terapia de segmentação por estroma9,11,22in vivo antes da administração desses medicamentos no cenário do ensaio clínico. Apesar de seus muitos pontos fortes como um modelo pré-clínico de PDA, o uso de camundongos KPC é prejudicado pela progressão altamente variável do desenvolvimento espontâneo do tumor, pois o início do tumor pode variar de 4 a 40 semanas (exigindo assim a manutenção de uma grande colônia de reprodução)15. Além disso, os camundongos KPC têm o potencial para tumores primários policlonais23,e há um rápido declínio na saúde animal e aumento de co-morbidades, incluindo caquexia e ascite à medida que a doença progride15.
Uma alternativa ao modelo espontâneo do rato de KPC é usar um modelo ortotópico da implantação de PDA24. A implantação cirúrgica direta de linhas de células tumorais no local do tecido nativo é um método mais econômico e previsível de recapitular o microambiente tumoral específico do tecido (TME) do PDA. A implantação tumoral permite a injeção de linhas de células tumorais clonais para camundongos geneticamente cruzados5,permitindo ratos hospedeiros com manipulações genéticas adicionais que seriam demorados para se reproduzir no modelo do mouse KPC. No entanto, a implantação do tumor pancreático requer um procedimento cirúrgico trabalhoso intensivo que introduz inflamação aberrante no local da sutura na parede abdominal24,25,26,e muitas vezes inclui uma longa recuperação pós-operatória27,28,29.
Os avanços tecnológicos na imagem latente do ultra-som usando transdutores roedor-específicos fornecem imagens de alta resolução no tempo real. Guiado pela imagem latente do ultra-som do movimento da agulha da injeção na cavidade peritoneal, uma pode especificamente implantar pilhas do tumor no pâncreas, leveraging os benefícios de injeções ortopotópicas do tumor na ausência da implantação cirúrgica e da inflamação associada. Esta abordagem, denominada modelo de implantação de tumorortópico ortotópico guiada por ultrassom (UG-OTIM) foi previamente estabelecida em modelos de xenoenxerto de câncer pancreático30, bem como em vários outros modelos de câncer, incluindo sarcoma de Ewing, neuroblastoma e câncer de bexiga31,32.
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para executar injeções ultra-som-guiadas de linhas da pilha do tumor dentro ao pâncreas do murine. Mostramos que os tumores resultantes recapitulam as características histológicas e imunológicas do KPC TME e, portanto, podemos ser usados para investigar novas combinações terapêuticas, incluindo imunoterapias, para revelar rapidamente os tratamentos mais promissores para se mover avançar para ensaios clínicos.
Protocol
Os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Institutional of Animal Care and Use Committee da Universidade da Pensilvânia. Os ratos C57Bl/6 fêmeas de 5 a 6 semanas de idade foram comprados (ver Tabela de Materiais)e usados após 1-3 semanas de descanso. O Laboratório Universitário de Recursos Animais supervisionou os cuidados com os animais.
1. Preparação de linhas de células tumorais pda para injeção
- Crescer kpc derivado sip célula si em células tumorais (TC) mídia: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementado com 10% fetal Bovine Serum (FBS), 2mM L-glutamina e 83 μg/mL gentamicina.
- Permitir que as células cresçam para 80-85% de confluência em frascos mantidos a 37°C e 5% de CO2.
- Uma vez que as células atingem a confluência ideal, decantar a mídia a partir de frascos e lavar duas vezes com quente (37 °C), soline fosfato estéril tampão (PBS), o suficiente para cobrir a monocamada de células aderentes. Pipeta de PBS restante após a lavagem final.
- Adicione a solução morna (37°C) 0,05% de tripsina-EDTA (0,5% trippsina-EDTA diluída 1:10 no amortecedor de dissociação de células sem enzimas de Hanks) para cobrir a monocamada em cada frasco e incubação a 37°C por 3-5 minutos ou até que as células se separam de bater nas laterais do Frasco.
- Adicione 10-25mL de frio (4°C), mídia tc estéril em cada frasco para parar a reação de tripização. Despeje a suspensão celular em um cônico de 50mL (s), preencha a 50mL com mídia tc frio.
- Centrífuga a 300g por 5 minutos a 4°C. Descarte a pasta supernatant e resuspenda a pelota no DMEM frio e estéril (livre de soro). Se vários tubos cônicos foram usados para coletar células, todas as pelotas podem ser combinadas com um único cônico nesta etapa.
- Centrífuga a 300g por 5 minutos a 4°.
- Repita os passos 1.6-1.7 duas vezes. Na lavagem final, tome um alibr de células para contar. A viabilidade celular de ≥90% é recomendada para in vivo injeções.
- Prepare uma suspensão uniforme das células tumorais pda na concentração desejada de células tumorais. Usamos 10-20 x 106 células/mL (250.000 a 500.000 células/25μL) na quantidade apropriada de DMEM estéril e frio ou PBS, mas cada linha celular deve ser titulado in vivo.
- Mantenha as células frias, no gelo, até que esteja pronta para injetar.
2. Preparação pré-cirúrgica de camundongos
NOTA: Esta etapa é recomendada para ser realizada 24 horas antes do procedimento.
- Coloque gaiolas contendo camundongos experimentais em um conjunto mais quente para 37°C.
- Obter gaiolas novas e limpas e coloque em uma segunda plataforma de aquecimento definida para 37°C.
- Limpe completamente o armário de segurança biológica, a câmara de indução e o estágio de ultra-som (EUA) com esterilizante (ver Tabela de Materiais).
- Transformar a função de aquecimento do estágio dos EUA para 37°C.
- Ligue a máquina de anestesia: ajuste os mostradores no divisor do tubo para que o fluxo de ar seja restrito apenas à câmara de indução. Ligue o tanque de oxigênio e definido para a taxa de fluxo para 1 L /min. Ligue o vaporizador isoflurano para 2-3%.
- Coloque um único rato na câmara de indução. Monitore o mouse até que não seja mais móvel e a respiração tenha abrandado.
- Ajuste os mostradores no divisor para que o fluxo de ar seja permitido tanto para a câmara de indução quanto para o cone do nariz. Mova rapidamente o rato da câmara da indução e coloque-o no recumbency ventral no estágio morno dos E.U. com seu açaime no cone do nariz.
- Test the level of induction by observing any reflexive response to toe pinching. Se não houver nenhum, o rato está pronto para depilação.
- Coloque uma pequena quantidade de lubrificante ocular (ver Tabela de Materiais)em ambos os olhos para evitar a desidratação do tecido. Vire o mouse para que ele coloque em recumbency dorsal no palco. Adere delicadamente as extremidades superiores e mais baixas ao estágio com fita de papel a fim maximizar a exposição do abdômen e fixar o rato ao estágio.
- Use um aplicador estéril da algodão-ponta para aplicar um creme depilatório generoso da camada ao quadrante esquerdo superior do abdômen. O depilatório deve ser aplicado na área geral do baço e estender-se para a linha média. Deixe descansar por cerca de um minuto.
- Teste o grau de depilação usando suavemente a extremidade oposta do aplicador de ponta de algodão para limpar o creme depilatório, uma vez que remove facilmente, limpe o abdômen limpo com uma almofada de gaze seca. Em seguida, molhe uma camada limpa de gaze com uma pequena quantidade de soro para soro quente e limpe a área mais uma vez para remover completamente o agente depilatório. Não exceda 2 minutos completos de contato direto na pele do rato, a fim de reduzir a chance de queimaduras químicas.
- Uma vez que o cabelo foi suficientemente removido do abdômen, retornar mouse para uma gaiola nova e limpa no aquecedor.
- Enquanto o primeiro animal está passando por depilação no palco dos EUA, o próximo animal pode ser adicionado à câmara de indução.
- Antes de anestesiar a próxima gaiola de camundongos, desligue o isoflurano e lave a câmara de indução com oxigênio. Limpe a câmara de indução e o cone de palco/nariz dos EUA com esterilizador. Repita os passos 2.5-2.14 até que todas as gaiolas e camundongos tenham sofrido depilação.
NOTA: Os animais de jejum por retirada temporária de alimentos por um período antes da implantação podem ser considerados para minimizar a obstrução visual dos órgãos abdominais devido a alimentos não digeridos no estômago e intestinos (12-24 horas). A restrição de água não é recomendada. Se os animais são jejuados, recomenda-se que eles são tratados com uma injeção de 1mL quente (37 °C), soro cionlógico estéril após a injeção do tumor, a fim de evitar a desidratação.
3. Implantação guiada por ultrassom de células pda
NOTA: Todos os procedimentos de ultrassom são realizados usando máquina de imagem de ultra-som e software (ver Tabela de Materiais). O transdutor tem uma frequência central de 40 MHz e uma largura de banda de 22-55 MHz.
- Ajuste a plataforma de ultra-som de tal forma que a superfície da plataforma é paralela ao chão e o investigador enfrenta o lado esquerdo do animal, com a cabeça do animal para a direita. Ajuste a posição transducer para que uma imagem abdominal transversal seja obtida(Figura 1A).
- Anestesie o mouse a ser injetado como descrito nos passos 2.1-2.8. Estabilizar o mouse na plataforma dos EUA, como descrito no passo 2.9.
- Aplique uma quantidade generosa de gel de ultra-som quente (37°C) na seção sem pêlos do abdômen.
- Abaixe delicadamente o transdutor para contatar o abdômen do rato. Ajuste o transdutor conforme necessário até que o pâncreas esteja claramente visível. Localizar o rim esquerdo e baço, a fim de fornecer uma orientação precisa da cavidade abdominal.
NOTA: Como a posição transducer foi alterada para permitir o acesso ao lado esquerdo do abdômen, o eixo X e Y nos controles do palco agora está invertido. - Carregue uma seringa de insulina 29G x 1/2 (ver Tabela de Materiais)com 25μL de suspensão celular tumoral. Limpe a ponta da agulha com almofada estéril da preparação do álcool antes da injeção a fim minimizar a semeadura da pilha do tumor na parede abdominal.
- Usando fórceps de ponta contundente, segure a pele e a parede peritoneal para aumentar a tensão no local de injeção desejado. Segurando a seringa em aproximadamente um ângulo de 25°-45° para a superfície da plataforma de ultra-som, avançar lentamente a agulha através da pele e da parede peritoneal. Confirme que a agulha perfurou a parede peritoneal antes de prosseguir para o próximo passo. Um pequeno pop deve ser sentida como a agulha perfura a parede peritoneal.
- visualização de ultrassom, guie a agulha diretamente para o pâncreas(Figura 1B-C). Confirme que a agulha está dentro do tecido do pâncreas movendo suavemente o cano de seringa para cima e para baixo. Se a colocação estiver correta, a ponta da agulha permanecerá dentro do tecido do pâncreas enquanto o barril de seringa estiver se movendo.
- Injetar lentamente as células tumorais e confirmar as células estão sendo implantados no local desejado pela formação de um bolus fluido dentro do pâncreas (visível na tela de ultra-som, Figura 1D).
NOTA: Alguma resistência deve ser sentida ao deprimir o desentupidor. Tenha cuidado para não perfurar pâncreas várias vezes, pois isso aumenta a probabilidade de vazamento na cavidade abdominal. - Uma vez que o volume total de suspensão foi injetado e um bolus fluido pode ser visto no pâncreas, manter a agulha muito imóvel por vários segundos. Lentamente retrair agulha do abdômen do rato, tomando muito cuidado para não perturbar as células injetadas.
- Coloque o mouse em uma gaiola limpa e quente e certifique-se de que o rato se recupere totalmente da anestesia. Repita este processo para todos os animais.
- Antes de anestesiar o próximo mouse, limpe a câmara de indução e o cone de palco/nariz dos EUA com esterilizador.
- Repita os passos 3.2-3.11 até que todos os ratos tenham sido injetados.
Representative Results
O objetivo deste relatório era fornecer um protocolo detalhado para a realização de implantação guiada por ultra-som de linhas de células PDA derivadas do KPC. Nos experimentos representativos mostrados na Figura 2-4,confirmamos que os tumores UG-OTIM crescem a um ritmo consistente e de forma dependente da dose. Além disso, mostramos que os tumores UG-OTIM recapitulam as características imunológicas e histológicas salientes do KPC TME. Assim, o sistema UG-OTIM é um modelo pré-clínico do mouse PDA que pode ser usado de forma de alta de supressão para selecionar rapidamente novas combinações de tratamento in vivo.
Usando o protocolo UG-OTIM descrito aqui, os camundongos foram preparados para implantação, fixados à plataforma de ultrassom aquecida e as posições da plataforma e do transdutor foram ajustadas para este procedimento, como mostrado na Figura 1A. Imagens de ultrassom de alta resolução foram usadas para identificar um local de injeção dentro do pâncreas do camundongo que poderia ser alvo sem a forção do rim ou baço(Figura 1B). visualização ultrasonográfica, a agulha foi cuidadosamente introduzida na cavidade abdominal através da parede peritoneal e guiada para o pâncreas do rato(Figura 1C). Após a colocação correta da agulha foi estabelecida, a suspensão da célula tumoral foi injetada muito lentamente no pâncreas. Uma implantação bem sucedida foi confirmada pela presença de uma bolha dentro do pâncreas (Figura 1D). Nos primeiros experimentos, o camundongo foi sacrificado, e a eficácia do procedimento foi verificada visualizando diretamente um bolus fluido no tecido bruto do pâncreas(Figura 1E).
A implantação tumoral e a taxa de crescimento foram monitoradas por imagens de ultrassom semanal. Implantações bem-sucedidas produziram tumores que foram contidos dentro das fronteiras do pâncreas ao longo do tempo do experimento (Figura 2A). O software de ultrassom (ver Tabela de Materiais)utilizado permitiu que a área do tumor e volume a ser determinado para cada ponto de tempo, bem como para o mapeamento 3D de tumores medidos a serem gerados (Figura 2B), e as imagens 3D foram confirmadas no momento da necropsia do rato (Figura 2C). Uma injeção de células imprópria durante o procedimento UG-OTIM pode resultar no desenvolvimento de um tumor de parede peritoneal (uma imagem representativa do que é mostrado na Figura 2D). Camundongos que apresentam tumores peritoneal podem ser excluídos de estudos posteriores.
Para determinar a concentração de células ideal para uso em estudos pré-clínicos, uma linha de células PDA derivada do C57Bl/6 KPC (4662)9 foi injetada em camundongos C57Bl/6 ingênuos do tipo selvagem em seis experimentos independentes. Esta linha celular (passada in vitro seis vezes) foi derivada de um rato com tumor totalmente cruzado KPC (>10 gerações, confirmado pela análiseSNP 19) para evitar antígenos de rejeição tumoral complexos de histocompatibilidade molecular. As células tumorais foram injetadas em uma dose de baixo díter (1,25 x 106 células/25μL) e em uma dose de alta condição (5 x 106 células/25μL). As injeções de tumor de alto díter resultaram em uma proporção maior de animais portadores de tumor três semanas após injeções em comparação com a coorte de baixo titer(Figura 3A). Apesar do atraso no início do tumor, a taxa de crescimento total do tumor não foi significativamente diferente entre as duas doses (Figura 3B). Da mesma forma, enquanto a taxa de sobrevivência entre as duas coortes não foi significativamente diferente, a tendência de dados para uma sobrevida ligeiramente melhorada na coorte de baixo titer(Figura 3C). A coorte de alto díter também produziu uma proporção maior de camundongos com tumores que foram inscritos em estudos pré-clínicos (designados em ≥20mm3 volume tumoral) por quatro semanas após a injeção do que a coorte de baixo titer(Figura 3D). A maioria dos camundongos de coortes de alto e baixo titer apresentou tumores incontáveis no dia 25 e desenvolveu sintomas de doença em estágio terminal, incluindo ascite (dados não mostrados). Metástases, que não ocorrem usando 4662 nas doses celulares deste protocolo, podem ser modelados com diferentes linhas celulares ou doses33.
O método UG-OTIM exigiu um domínio das habilidades motoras finas para localizar com precisão o local de injeção desejado, o que foi desafiador em nossos primeiros experimentos. Por esta razão, incluímos uma tabela que descreve o número de animais que desenvolveram tumores dentro do pâncreas (implantações bem-sucedidas) em comparação com o número total de animais submetidos à implantação tumoral guiada por ultrassom(Tabela 1). Os animais foram eliminados de análises futuras se os tumores se desenvolveram em um local indesejado (ou seja, rim) ou se não houvesse evidência de tumor por seis semanas após a injeção, como indicado. A progressão semanal da proporção de camundongos com tumores pancreáticos inscritos (≥20mm3 tumoral volume) de cada experimento também é mostrada na Tabela 1.
Para determinar se havia um benefício a usar a aproximação de UG-OTIM um pouco do que o modelo ortotópico cirúrgico tradicional (além do investimento do tempo após ter ganhado a proficiência na técnica), nós comparamos a semeadura de tumores do PDA na parede peritoneal dos ratos após cada procedimento. Descobrimos que apenas 2/31 camundongos (6,5%) desenvolveu tumores de parede peritoneal não intencionais após injeções ug-otim, em comparação 7/15 camundongos que desenvolveram tumores de parede peritoneal após injeção cirúrgica (46,6%, p < 0,0029) (Tabela 1). Assim, a taxa de semeadura de tumores adicionais no peritônio é muito reduzida no método UG-OTIM em comparação com a implantação cirúrgica.
Após o sacrifício de camundongos com tumores UG-OTIM, descobrimos que a anatomia bruta dos tumores foi semelhante aos tumores espontâneos KPC (Figura 4A). A análise histológica demonstrou um padrão de estruturas ductais anormais semelhantes em ambos os modelos e que recapitulava a morfologia da doença humana (Figura 4B). Para investigar os imunes infiltrados dentro dos tumores KPC e UG-OTIM, amostras histológicas representativas foram manchadas para CD3 (expressa por células T) e F4/80 (expressas por macrófagos). Em ambos os modelos, os padrões de coloração revelaram tumores que foram mal infiltrados pelas células T (Figura 4C),mas altamente infiltrados por macrófagos (Figura 4D). Este achado é consistente com o fenótipo imunologicamente frio da maioria das amostras humanas e KPC PDA5,7,12.
Figura 1: Implantação guiada por ultrassom das células pda no pâncreas de urina. (A)Orientação do rato, estágio do ultra-som, e ponta de prova do ultra-som usada para obter uma imagem high-resolution de órgãos abdominais. Observe que o palco e a plataforma foram retirados 90° da orientação padrão para permitir fácil acesso ao quadrante superior esquerdo do abdômen do mouse. (B) Imagem ultrasonográfica que descreve a identificação de rim, baço e pâncreas. Aqui a agulha de injeção está posicionada contra o abdômen do rato. C)Imagem ultrasonográfica que descreve a agulha dentro do pâncreas do rato. (D)Imagem ultrasonográfica que descreve a bolha no local da injeção (delineada em azul) após a injeção controlada de células tumorais no pâncreas. (E)Laparotomia revelando o bolus fluido contendo células PDA no pâncreas após a injeção guiada por ultra-som. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Monitoramento do crescimento tumoral após a injeção de UG-OTIM. (A)Imagem ultrasonográfica representativa do tumor UG-OTIM (delineada em azul) às 2, 3 e 5 semanas após a injeção, conforme indicado. (B) Representante reconstruiu imagem 3D do tumor UG-OTIM 5 semanas após a injeção usando o software de ultra-som. (C)Anatomia bruta representativa do tumor UG-OTIM 5 semanas após a injeção sobre a necropsia do rato. (D)Imagem ultrasonográfica representativa de um tumor de parede peritoneal que cresce na camada subcutânea após a injeção imprópria da pilha em 7 semanas após a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Início dependente da dose de tumores inscritos após a injeção guiada por ultra-som das células pda. (A) Proporção de camundongos portadores de tumor estoirantes em pontos de tempo indicados após a injeção, conforme descrito na Figura 1 com alto díter (500.000 células/25μL) ou baixo titer (125.000 células/25μL) células tumorais, conforme indicado. (B) A cinética do crescimento tumoral de camundongos de (A),cada símbolo representa um grupo de camundongos, barras de erro indicam SEM. (C) Proporção de camundongos de (A)vivo em pontos de tempo indicados após a injeção. Os ratos foram eutanasiados ou censurados se os tumores fossem >1000mm3 ou a condição do corpo era pobre devido às comorbidades do tumor. (D)Tempo para o início do tumor inscritível para ratos de (A). Os tumores inscritos são considerados ≥20mm3 em volume. Dados representativos de 4 experimentos independentes com camundongos/experimentos n=8-20. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Experiência | Pâncreas-tumoredores/injeções totais | Semana 1 (Inscrita) | Semana 2 (Inscrita) | Semana 3 (Inscrita) | Semana 4 (Inscrita) | Tumores peritoneal semeados |
| Alta Titer | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| Baixo titer | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| Injeção cirúrgica | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
Tabela 1: Número de tumores UG-OTIM bem-sucedidos em comparação com a implantação cirúrgica. Dados combinados de 2-4 experimentos independentes por condição de titer alta ou baixa com n=5-10 camundongos por experimento. "Injeção cirúrgica" indica camundongos que receberam injeção cirúrgica laparoscópica abdominal de 125.000 células tumorais. "Tumor-rolamento" indica ratos com um tumor pancreatic. "Enrollable" indica proporção de camundongos com tumor em cada ponto de tempo com um volume de tumor >20mm3. "Tumores Peritoneal semeados" indica a proporção total de camundongos portadores de tumor que tinham semeadura concomitante de tumores na parede peritoneal da injeção de células tumorais. Camundongos com tumores apresentando incorretamente em tecidos diferentes do pâncreas (ou seja, rim) foram excluídos das populações "tumores" (mas incluídos no total de camundongos injetados). ND, não determinado. Frequência de semeadura de parede peritoneal comparando grupos de titer altos e baixos combinados versus implantação cirúrgica, p < 0,0029 via teste T de 2 caudas com Mann-Whitney pós-teste.
Figura 4: Tumores UG-OTIM recapitulam o microambiente tumoral do KPC. Imagens representativas são mostradas. Fila superior, tumores KPC. Fila inferior, tumores UG-OTIM em 5 semanas após a implantação. (A)Anatomia bruta de tumores extirudados sobre necropsia. (B) H&E (10X, bar=100μm) (C) Coloração imunohistoquímica para CD3 (marrom) (10X, bar=100μm). (D)Coloração imunofluorescente de F4/80 (vermelho) e DAPI (azul) (4X, bar=500μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Discussion
Mostramos aqui que o uso de ultrassonografia de alta resolução para direcionar a implantação de linhas celulares pda de urina para o local do tecido autráltico é uma alternativa confiável tanto para o KPC quanto para sistemas de modeloortópico cirúrgico. Ug-OTIM produz tumores biologicamente relevantes que retêm as características imunopatológicas do PDA com um prazo encurtado para o diagnóstico tumoral e cinética confiável crescimento tumoral. A injeção guiada por ultrassom pode, portanto, servir como uma ferramenta útil para a produção rápida de camundongos com tumores de PDA implantados ortotópicamente, permitindo a investigação de combinações terapêuticas em um modelo clinicamente relevante.
A implantação guiada por ultrassom oferece melhorias importantes em relação aos modelos padrão de investigação pré-clínica. Em primeiro lugar, este procedimento elimina o monitoramento intensivo de tempo de camundongos KPC para o desenvolvimento de tumores espontâneos, implantando diretamente células pda totalmente C57BL/6 backcrossed para o pâncreas murine. Em segundo lugar, semelhante às injeções ortotópicas cirúrgicas tradicionais, a abordagem UG-OTIM permite o controle sobre a linha celular injetada, incluindo a seleção de uma linha de células tumorais monoclonais e/ou manipulação ex vivo da linha celular, bem como controle sobre o hospedeiro que recebe a implantação de células tumorais. Em terceiro lugar, esta técnica minimamente invasiva evita o árduo trabalho de cirurgia de sobrevivência e ignora o complicado período de recuperação pós-operatória para os animais, bem como sinais inflamatórios da cicatrização de feridas cirúrgicas. Finalmente, os tumores UG-OTIM - semelhantes à implantação cirúrgica - recapitulam a TME observada nos camundongos KPC, incluindo baixa infiltração de células T e alta infiltração de macrófagos. Assim, o modelo UG-OTIM mantém as principais características dos tumores KPC sem as complicações adicionais que retardam as investigações terapêuticas no modelo KPC espontâneo.
Uma série de etapas críticas no protocolo são fundamentais para dominar para o sucesso da técnica. A perícia na imagem latente do ultra-som do murine é essencial para este procedimento, mas a destreza manual exigida para implantar com sucesso pilhas no pâncreas é um jogo de habilidade que deva ser desenvolvido independentemente. Para camundongos em um ciclo claro/escuro de 12 horas, o jejum dos animais durante a noite garantiu que o estômago e os intestinos fossem limpos de qualquer alimento não digerido que pudesse bloquear a visão do pâncreas, rins e baço por ultrassom. Além disso, cada linha celular usada para injeção ortotópica deve ser titrada antes de novos experimentos para entender a cinética de crescimento e determinar o potencial metastático33. Durante a injeção, o uso de fórceps para beliscar a pele no local da injeção criou a tensão necessária para perfurar suavemente a pele e a parede peritoneal. Um passo fundamental no procedimento foi guiar cuidadosamente a agulha para o pâncreas sem perfurar o tecido ou perfurar um local fora do alvo, como o baço ou o rim. A confirmação de um bolus fluido foi o melhor indicador de injeção bem-sucedida de células tumorais no tecido adequado. Após a injeção, a agulha deve ser retirada lentamente para não perturbar o bóus fluido. Descobrimos que uma série de injeções experimentais usando DMEM ou Trypan Blue ajudou a desenvolver um domínio das habilidades motoras finas necessárias para esta injeção.
Durante a solução de problemas deste procedimento, identificamos uma série de fatores que impactaram o sucesso do protocolo. Em experimentos experimentais, nosso erro mais freqüente foi a perforating o rim durante a implantação, que ocorreu com mais freqüência em nossos primeiros experimentos sugerindo que o exercício regular desta habilidade melhora a proficiência. Além disso, descobrimos que confirmar a presença de um bolus fluido após a injeção de células tumorais através de ultra-som e visualização direta na necropsia durante a fase de solução de problemas melhorou a técnica de injeção bem-sucedida. Se a formação de uma bolha não for confirmada por ultra-som durante a injeção, a localização da agulha pode ser ajustada antes de deprimir totalmente a seringa para liberar o bolus restante das células tumorais. Também observamos que os volumes de suspensão injetados muito rapidamente resultaram no derramamento de células tumorais na cavidade peritoneal ou no colapso do bolus fluido no pâncreas. Geralmente, estes animais passaram a desenvolver tumores pancreáticos, com exceção de n = 7 animais que não mostraram nenhuma evidência de tumor 4 semanas após a injeção. Este resultado foi relatado somente em nossas primeiras tentativas (e 6/7 animais foram injetados com uma baixa titer de pilhas do tumor). Camundongos que têm injeções de células tumorais questionáveis, ou que necessitam de reposicionamento da agulha, devem ser monitorados de perto para o desenvolvimento de tumores fora do pâncreas.
As principais limitações do método guiado por ultra-som são a disponibilidade dos instrumentos necessários e a habilidade técnica associada à implantação tumoral. O procedimento não é completamente estéril, pois o mouse é injetado não esterilizadamente na plataforma de ultra-som, com a ponta da seringa e da agulha passando pelo gel de ultra-som. Embora não tenhamos visto nenhuma evidência de infecção em camundongos n=148 em um total de 8 experimentos independentes desde o início desses estudos, é possível que um agente infeccioso possa entrar no pâncreas através da agulha de injeção durante este processo. Como tal, como muitos aspectos do protocolo quanto possível (incluindo luvas, superfícies de ultra-som, caixas de gelo) devem ser pulverizados com desinfetante ou 70% de etanol para reduzir a exposição potencial a patógenos. Uma limitação adicional do protocolo atual foi a falta de metástase usando a linha celular 4662 nas diluições atuais. Cada linha celular utilizada no sistema UG-OTIM deve ser titulada para as taxas de crescimento desejadas, bem como o potencial metastático33. Finalmente, nosso protocolo atual estabeleceu técnicas para injetar células tumorais em uma suspensão unicelular. No entanto, a adição de um substrato de matriz extracelular poderia ser adicionada para potencialmente melhorar o estabelecimento do tumor e prevenir o vazamento de células tumorais (como é usado em modelos de implantação cirúrgica27,30,31,32). Assim, muitas das limitações do UG-OTIM podem ser superadas com testes adequados das linhas celulares que estão sendo usadas nas injeções ortotópicas.
Em resumo, o modelo UG-OTIM é um método preciso de injeção de células tumorais dirigidas por tecidos no pâncreas de urina. Esta técnica minimamente invasiva da implantação beneficia o investigador e os animais reduzindo o tempo do procedimento, minimizando complicações post-surgical e melhorando a exatidão da injeção. Os tumores decorrentes das injeções ug-otim retêm as características imunobiológicas características de tumores espontâneos kpc, têm tempo confiável para o início do tumor, e reproduzível tumor crescimento cinética. Assim, o modelo UG-OTIM pode ser usado de forma relativamente alta para interrogar combinações terapêuticas em um ambiente pré-clínico para revelar novos tratamentos para pacientes com maior necessidade clínica não atendida.
Disclosures
Os autores não têm divulgações.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer ao Dr. Robert Vonderheide e a todos os membros do laboratório Vonderheide, todos os membros do Pancreatic Cancer Mouse Hospital, Dr. Ben Stanger, do Pancreatic Cancer Research Center da Universidade da Pensilvânia e devora Delman para discussões úteis. Este trabalho é apoiado por financiamento do Parker Institute for Cancer Immunotherapy Fellow Award (KTB) e do Pancreatic Cancer Research Center da Universidade da Pensilvânia (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
