Summary
Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.
Abstract
Die Vaskuläre Entwicklung wird durch die sequentielle Expression spezifischer Gene bestimmt, die durch In-situ-Hybridisierungstests bei Zebrafischen in verschiedenen Entwicklungsstadien untersucht werden können. Um die Rolle von Endoglin(eng) bei der Gefäßbildung während der Entwicklung einer erblichen hämorrhagischen Telangangiektasien (HHT) zu untersuchen, werden Morpholino-vermittelte gezielte Knockdown von eng in Zebrafischen verwendet, um seine zeitliche Expression und die damit verbundenen Funktionen zu untersuchen. Hier wird die Voll-In-situ-RNA-Hybridisierung (WISH) für die Analyse von eng und seinen nachgelagerten Genen in Zebrafischembryonen eingesetzt. Außerdem werden Rohrbildungstests in HHT-Patienten-abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-differenzierten Endothelzellen eng (iPSC-ECs; mit eng-Mutationen) durchgeführt. Ein spezifisches Signalverstärkungssystem mit der gesamten In-Situ-Hybridisierung – WISH bietet eine höhere Auflösung und niedrigere Hintergrundergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Um ein besseres Signal zu erhalten, wird die Nachfixierungszeit nach der Sondenhybridisierung auf 30 min eingestellt. Da Fluoreszenzfärbung bei Zebrafischembryonen nicht empfindlich ist, wird sie hier durch Diaminobelidin (DAB) ersetzt. In diesem Protokoll werden von HHT-Patienten abgeleitete iPSC-Linien, die eine eng-Mutation enthalten, in Endothelzellen differenziert. Nach der Beschichtung einer Platte mit Kellermembranmatrix für 30 min bei 37 °C werden iPSC-ECs als Monolayer in Brunnen ausgesät und 3 h bei 37 °C gehalten. Anschließend werden die Rohrlänge und die Anzahl der Zweige anhand mikroskopischer Bilder berechnet. So wird mit diesem verbesserten WISH-Protokoll gezeigt, dass eine reduzierte Eng-Expression die Endothel-Vorläuferbildung bei Zebrafischembryonen beeinflusst. Dies wird durch Rohrbildungstests mit iPSC-ECs bestätigt, die von einem Patienten mit HHT abgeleitet wurden. Diese Assays bestätigen die Rolle für eng in der frühen Gefäßentwicklung.
Introduction
Eine einzige Mutation auf eng (CD105) wurde bei Patienten mit HHT berichtet. Die Mutation führt zu einer erhöhten PROLIFERATION der EG und einer reduzierten durchflussvermittelten EG-Dehnung1,2. Es wurde auch bereits berichtet, dass ENG-Mangel reduziert endotheliale Marker Expression (d.h. kdrl, cdh5, hey2) in Zebrafisch3. Endoglin, das hauptsächlich in Endothelzellen exprimiert wird, ist ein Transmembran-Glykoprotein und fungiert als Co-Rezeptor zur Transformation des Wachstumsfaktors (TGF-) Familienmitglieder. Es weist die BMP9-Bindung auf die Zelloberfläche an, um das nachgeschaltete Gen, einschließlich der Id1-Expression, zu regulieren, um eine Stammzelldifferenzierung in Richtung ECs4zu induzieren. Somit spielt das eng-Gen eine wichtige Rolle bei der Vaskulogenese und der menschlichen Gefäßerkrankung5,6. Wir haben zuvor die Auswirkungen von Endoglin-Knockdown auf die Gefäßbildung in Zebrafischembryonen untersucht, gefolgt von einer Analyse von iPSCs-abgeleiteten ECs, die von einem HHT-Patienten mit einer eng-Mutation 7erworben wurden. Dieses Protokoll zeigt die Auswirkungen des ENG-Mangels auf die endotheliale Vorläufermarkerexpression und Rohrbildung, eine quantifizierbare Methode zur Messung der In-vitro-Angiogenese.
Um die räumliche und zeitliche Expression zu untersuchen, wird WISH verwendet, um die Genexpression in vivo8zu detektieren. In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Methode zur Verwendung von markierten Sonden mit Komplementsequenzen von Zielnukleinsäuren (DNA oder mRNA), um Zielnukleinsäurehybriden in einer festen Probe zu erkennen und zu visualisieren. Der Prozess verstärkt Genexpressionssignale in vivo und wird verwendet, um die Expression von Genen durch Mikroskopie zu erkennen. WISH wurde häufig in verschiedenen Modelltieren verwendet, vor allem in Zebrafischen9. Es wird auch verwendet, um die folgenden Daten zu erfassen: 1) Gen räumliche /zeitliche Expressionsmuster, die Informationen über Genfunktion und Klassifizierung liefern; und 2) speziell exprimierte Genmarker, die in Hochdurchsatzmedikamenten oder Mutanten-Screening10verwendet werden.
Chromogene Sonden lassen sich mit der traditionellen Chromosomen-In-situ-Hybridisierung (CISH) leicht abbauen, was zu hohem Hintergrundrauschen und unspezifischen Signalen11,12führt. Die WISH-Methode verwendet zwei unabhängige Doppel-Z-Sonden, die entwickelt wurden, um RNA-Sequenzen auf das Ziel auszutosen. Jede Sonde enthält eine 18-25-Sequenz, die die Ziel-RNA ergänzt, und eine 14 Base-Tail-Sequenz (konzeptioniert als Z). Die Zielsonden werden in einem Paar (doppel Z) verwendet. Die beiden Hecksequenzen bilden zusammen eine 28 Basishybridisierungsstelle für den Vorverstärker, die 20 Bindungsstellen für den Verstärker enthält. Der Verstärker wiederum enthält 20 Bindungsstellen für die Etikettensonde und kann theoretisch bis zu 8.000 Etiketten für jede Ziel-RNA-Sequenz ergeben.
Diese fortschrittliche Technologie ermöglicht die gleichzeitige Signalverstärkung und Hintergrundunterdrückung, um eine Einzelmolekül-Visualisierung zu erreichen und gleichzeitig die Gewebemorphologie zu erhalten13. Weitere Modifikationen der WISH-Methoden basieren auf früheren Forschungsarbeiten14, einschließlich zusätzlicher Fixierung und DAB-Färbung. Vorausgesetzt, hier ist ein verbessertes WISH-Protokoll, das auch dann funktionieren kann, wenn die Ziel-RNA teilweise verkleinert oder abgebaut wird. Zu den Vorteilen gehört, dass es in 24 h ohne RNase-freie Bedingungen abgeschlossen werden kann. Signale können auch gleichzeitig über mehrere Kanäle von mehreren Zielen erkannt werden, und die Ergebnisse sind konsistent und kompatibel mit Ergebnissen von verschiedenen Automatisierungsplattformen mit hohem Durchsatz.
Die Ergebnisse von Tiermodellen spiegeln nicht das gleiche Phänomen wider, das beim Menschen auftritt. ENG enthält zwei Paare konservierter Cysteins, C30-C207 und C53-C182, die Disulfidbrücken in verwaisten Regionen bilden. Um die Rolle von eng bei HHT-Patienten weiter zu untersuchen, wurden Tube-Formations-Assays mit iPSCs, die von HHT-Patienten abgeleitet wurden, in Zellen ohne/mit eng-Mutationen (Cys30Arg, C30R)15durchgeführt. Nachdem Kubota et al. zuerst über das Rohrbildungsexperiment16berichtet haben, wurde der Assay auf verschiedene Weise entwickelt. Es wurde verwendet, um angiogene oder antiangiogene Faktoren zu identifizieren, die Signalwege in der Angiogenese zu definieren und Gene zu identifizieren, die die Angiogenese regulieren17.
Vor der Verfügbarkeit von patientenabgeleiteten iPSC-ECs verwendeten die Forscher hauptsächlich kultivierte ECs, um Angiogense16zu untersuchen. Für Endothelzellen ist es jedoch eine technische Herausforderung, exogene Gene mit einem Virus zu transduzieren, da die Durchreisezahl der ECs begrenzt ist. Dies liegt daran, dass es kaum genug zelluläres Material gibt, um von menschlichen Gefäßen entweder aus der Operation oder von den zugelassenen Spendern gesammelt zu werden. Mit der Erfindung der iPSC-Generierungstechnik von Shinya Yamanaka können aus iPSCs abgeleitete humane ECs zuverlässig in In-vitro-Experimenten eingesetzt werden, wie zuvorberichtet 18.
Die Verwendung viral transduzierter ECs mit begrenzten Anzahln und Passagen kann für Signalstudien ausreichen, aber für funktionelle Studien ist es besser, mutierte pluripotente Stammzelllinien (entweder iPSCs oder CRISPER/Cas9-gezielte hESCs) zu erzeugen und sie dann in ECs für Angiogenesestudien zu differenzieren, die Röhrenbildungstestsverwenden 19. Die Rohrbildung kann verwendet werden, um die Funktion von Endothelzellen zu bewerten, die Mutationen tragen. Dieses Protokoll beschreibt auch die Rohrbildung auf einer Angiogeneseplatte, die eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Methode ist.
Das nachstehende Protokoll bietet eine zuverlässige und systemische Methode zur Untersuchung der Rolle bestimmter Gene bei der Gefäßbildung, zusammen mit Details für in vivo-Expressionsmuster und In-vitro-Funktionalquantifizierung zur Modellierung menschlicher Krankheiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden von der Forschungsethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Zhejiang genehmigt.
1. Ganzmontierte In-situ-Hybridisierung
- Zebrafisch Linie Haltung und Fortpflanzung
- Füttern und züchten Sie alle erwachsenen Zebrafische bei 26-28 °C in einem rezirkulierenden Aquakultursystem mit 14 h Licht/10 h dunklem Zyklus für jeden Tag. Verwenden Sie AB (Wild-Typ) Zebrafischlinien für die folgenden Verfahren.
- Legen Sie eine Schicht Kieselsteine in den Boden der Zuchtbox als Unterschlupf für Eier. Gruppieren Sie elternfische im Verhältnis 2:1 (d.h. zwei Weibchen und ein Männchen) in jede Box. Lassen Sie die weiblichen Fische für 1 Tag laichen. Entfernen Sie am Ende des Laichens die Elternfische sofort, um sie daran zu hindern, die Eier zu essen.
- Injizieren Sie die 2 ng Morpholinos und 500 pg mRNA in einzellige Stadium-Embryonen mit dem Femto Jet Injektionssystem unter dem Mikroskop (Endoglin-MOs-Sequenz: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-Fehlpaar-Kontroll-MOs-Sequenz: 5'-AAACACACACACACATCC-3').
- Die Zygoten in saurem Meerwasser bei 27 °C für ca. 48 h inkubieren.
- Sammlung und Fixierung von Zebrafischembryonen
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 20-40 Zebrafischembryonen aus dem zirkulierenden Systemwasser (pH = 5,0) in einem 1,5 ml Rohr zu sammeln, wenn sie dechorioniert werden und eine bestimmte Entwicklungsphase erreichen. 1 ml frisch zubereitete 4% PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.
HINWEIS: Der Zeitraum, in dem der gewählte Embryo ausgewählt wird, basiert auf dem Zweck des Experiments. Tabelle 1 zeigt die Fixierungszeit, die für verschiedene Embryonale Zeiträume erforderlich ist. - Entfernen Sie die Fixierlösung, waschen Sie Embryonen mit phosphatgepufferter Lösung mit Tween-20 (PBST, verdünnt 1 ml Tween in 1000 ml PBS-Lösung) 3x für jeweils 5 min bei RT.
- Dehydrieren Sie die Embryonen durch Inkubation in einer Reihe von 25%, 50% und 75% Methanol (in PBST verdünnt) für jeweils 5 min. Embryonen für 5 min auf 100% Methanol übertragen und durch frisches Methanol ersetzen. Lagern Sie die Embryonen bei -20 °C über Nacht oder länger.
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 20-40 Zebrafischembryonen aus dem zirkulierenden Systemwasser (pH = 5,0) in einem 1,5 ml Rohr zu sammeln, wenn sie dechorioniert werden und eine bestimmte Entwicklungsphase erreichen. 1 ml frisch zubereitete 4% PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.
- Hydration und Verdauung
- Hydrat-Embryonen, die in 100% Methanol mit einem Sieb mit Nylongewebe am Boden konserviert wurden, um Embryonen in den Brunnen von 12 Brunnenplatten mit einer Reihe von 75%, 50% und 25% Methanol (in PBST verdünnt) für jeweils 5 min nacheinander zu waschen. Waschen Sie die Embryonen mit PBST 3x für jeweils 5 min bei RT.
- Fügen Sie mit Embryonen 50 l Proteinase K (10 mg/ml) in die Röhre und folgen Sie der Verdauungszeit in Tabelle 2 bei RT.
- Entfernen Sie die Proteinase K und waschen Sie Embryonen mit PBST 3x für jeweils 5 min bei RT.
- Probehybridisierung und Postfixierung
- Setzen Sie die nach den mRNA-Sequenzen jedes Gens entworfenen Sonden in ein 40 °C-Hybridizatin-System, bis der Niederschlag gelöst ist, Mischen Sie die Zielsonden von z.B. (XM_007116.7) und zwei weitere wichtige Gene in der frühen mesoderm endotheialen Vorläuferbildung (hier aplnr [NM_001075105.1] und nrp1a [NM_001040326.1]) in einem 1,5 ml Rohr mit einem Verhältnis von 50:1:1.
- Fügen Sie in jeder Röhre mit Embryonen 50-100 l gemischte Zielsonden hinzu und inkubieren Sie sie dann über Nacht bei 40 °C.
HINWEIS: Vorgemischte Sonden müssen vor gebrauchsbeheizt auf 40 °C vorgewärmt und vor Gebrauch auf RT gekühlt werden. - 0,2x Saline-Natriumcitratlösung mit Tween-20 (SSCT) vorbereiten: 175,3 g NaCl und 88 g Natriumcitrat in 1 L dH2O auflösen, um eine 20x SSC-Lösung zu erhalten. Verdünnen Sie dann die Lösung 1:100 in dH2O, um eine 0,2 x SSCT-Lösung zu erhalten. Tween-20 1:1000 in der 0.2x SSCT-Lösung verdünnen.
- Übertragen Sie die recycelten Sonden in ein neues Rohr. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für je 15 min bei RT. Die recycelten Sonden können 5x-10x wiederverwendet werden.
- Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd (PFA), um die Embryonen für 30 min bei RT zu fixieren. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
HINWEIS: Die Arbeit von Gross-Thebing et al. schlägt eine Nachfixierungsperiode von 10 min14vor, aber der tatsächliche Betrag muss entsprechend angepasst werden. Hier haben wir 10 min Post-Fixierung 3x getestet, und die Empfindlichkeit des DAB-Sterbens wird maßgeblich beeinflusst. Stellen Sie nach der Untersuchung sicher, dass 0,5-1,0 h Fixierung die optimale Bedingung ist (eine kürzere Fixierungszeit kann kein klares Signal aus der Ziel-RNA erzeugen, und die entsprechende Verlängerung der Fixationszeit hilft, das Signal zu stärken und weniger Hintergrundgeräusche zu erzeugen).
- Sequenzielle Verstärker- und Etikettensondenhybridisierung
- Entfernen Sie die SSCT-Lösung, und ersetzen Sie sie durch 50 L Amp 1. Lassen Sie die Embryonen 30 min bei 40 °C in Amp 1 absetzen. Dann waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
- Entfernen Sie die SSCT-Lösung, und fügen Sie 50 L Amp 2 hinzu. Lassen Sie die Embryonen 15 min bei 40 °C absetzen. Dann waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
- Entfernen Sie die SSCT-Lösung, fügen Sie 50 L Amp 3 hinzu und tippen Sie mild auf das Rohr. Dann inkubieren Sie die Embryonen bei 40 °C für 30 min. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT-Lösung 3x für jeweils 15 min bei RT.
- Entfernen Sie die SSCT-Lösung, fügen Sie 50 L Amp 4 tropfenweise hinzu, und tippen Sie vorsichtig auf das Rohr. Dann inkubieren Sie die Embryonen bei 40 °C für 15 min. Waschen Sie die Embryonen in 0,2x SSCT 3x für jeweils 15 min bei RT.
- Gegenfärbung und Mikroskopie
- Entfernen Sie die SSCT-Lösung, und fügen Sie jedem Rohr 50 L DAPI hinzu. Die Embryonen über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Embryonen mit PBST und bereiten Sie sie mit einer 1% Low Melting Point Agarose (LMP) Lösung (1 g LMP gelöst in 100 ml dH2O) in einer mit PBST gefüllten Petrischale auf die Bildgebung vor.
- Verwenden Sie ein DAB Peroxidase Substrat Kit, um die Probe zu färben. Fügen Sie die Farbreagenzien A, B und C (je 50 l) zu 1 ml destilliertem Wasser hinzu und mischen Sie sie gut, um eine vollständige DAB-Arbeitsflüssigkeit zu erhalten. Fügen Sie die Flüssigkeit in die Probe und decken Sie für 10 min.
- Waschen Sie die Probe nach der Färbung gründlich mit PBST.
- Verwenden Sie ein optisches Mikroskop mit einer fotografischen Funktion für die Abbildung der Proben.
HINWEIS: Wenn Sie später Bilder aufnehmen, sollten die Rohre in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 4 °C gelagert werden.
2. Rohrformationstest
HINWEIS: Die eng mutierten und wildtypisierten ECs (Kontrolle) wurden von iPSCs unterschieden, die von einem HHT-Patienten abgeleitet wurden (hier, eine 62-jährige Patientin mit wiederkehrenden Epistaxis seit 22 Jahren, Magen-Darm-Blutungen, pulmonale arteriovenöse Fehlbildungen, die eine Fehlwahrnehmung in Position c.88T>C von Exon 2 tragen, und ein gesunder Spender (ohne Eng-Mutation), die vom Peking Union Medical College Hospital mit Zustimmung des College-Forschungsethikausschusses zur Verfügung gestellt wurden.
- Kontroll- und HHT-iPSC-Zellkulturen
- Fügen Sie ein bestimmtes Volumen der Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) zu einer 6-Well-Zell-Kulturplatte hinzu, um den Boden des Brunnens zu bedecken und die Platten für 1 h bei 37 °C zu bebrüten.
HINWEIS: Bei verwendung der Kellermembranmatrix bei -20 °C lagern, auf Eis oder in einem frostfreien 4 °C-Kühlschrank bebrüten, bis sie aufgetaut sind. Anschließend bei 1:100 in DMEM/F12 verdünnen und dann das Verdünnungsmittel in 200 L-Rohre verteilen, die jeweils 100 l enthalten. Bewahren Sie die Rohre bei -20 °C auf und vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Beim Hinzufügen der verdünnten Kellermembranmatrix keine Blasen erzeugen. Nach Zugabe der verdünnten Kellermembranmatrix die 6 Wellplatte vorsichtig von Hand schütteln, so dass sie den Boden gleichmäßig bedeckt. - Nach dem Beschichten der Platte, entfernen Sie die verwendete Kellermembran Matrixlösung aus den Brunnen. Dann fügen Sie 2 ml mTeSR1 Medium in jeden Brunnen, und Platte die iPSCs aus dem letzten Durchgang bei etwa 1 x 106 pro Brunnen geerntet.
- Fügen Sie ein bestimmtes Volumen der Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) zu einer 6-Well-Zell-Kulturplatte hinzu, um den Boden des Brunnens zu bedecken und die Platten für 1 h bei 37 °C zu bebrüten.
- Erzeugung und Erweiterung von ECs von iPSCs
- Nach ca. 4 Tagen iPSC-Kultur das Kulturmedium mit BEL-Medium, ergänzt durch Aktivin A (25 ng/ml), BMP4 (30 ng/ml), VEGF165 (50 ng/mL) und CHIR99021 (1,5 m) austauschen. Wachsen Sie die Zellen für 3 Tage, um Mesodermzellen zu erzeugen.
- Ersetzen Sie das in Schritt 2.2.1 beschriebene Medium durch BEL-Medium, das durch VEGF (50 ng/mL) und SB431542 (10 m) ergänzt wird, um die Gefäß-ECs zu erweitern. Behandeln Sie die Zellen mit dem gleichen Medium und der gleichen Kultur für weitere 3-4 Tage.
- Verwenden Sie CD31-Dynabeads, um die reifen Gefäß-ECs zu reinigen: Beziehen Sie sich auf die Anweisungen im CD31-Dynabeads-Kit, das menschliche CD31-Antikörper mit magnetischen Perlen verbindet, um CD31-Moleküle auf ECs zu kombinieren, und dann die CD31-positiven Zellen durch Elutionspuffer sammeln. Pflege und Erweiterung der gereinigten ECs in EC-SFM-Medium, das VEGF165 (30 ng/ml), bFGF (30 ng/ml) und FBS (1%) enthält.
- Beschichtung von Endothelzellen auf Matrigel-beschichteten Platten und Mikroskopie
- Fügen Sie 10 l Kellermembranmatrix pro Brunnen hinzu, um die Angiogeneseplatten zu beschichten (siehe Materialtabelle) und bei 30 min bei 37 °C zu brüten.
- Endothelzellen nach Überprüfung der Endothelmarker CD31 und VE-Cadherin mit Immunfluoreszenzfärbung ernten und im endotheliaalen Wachstumsmedium 2 durch wiederholtes Pipetieren wieder aussetzen. Fügen Sie 50 l Zellsuspension (2 x 105 Zellen/ml) pro Bohrung in die erstarrte Matrix ein und inkubieren Sie die Zellen für 3-5 h bei 37 °C.
HINWEIS: Vor dem Röhrenbildungsexperiment sollten Endothelmarker überprüft werden, um sicherzustellen, dass der richtige Phänotyp der funktionellen Endothelzellen. 1 x 104 Zelle pro Brunnen ist eine ideale Zahl für die Rohrbildung. Zu viele oder zu wenige Zellen sind der Rohrbildung nicht förderlich. Fügen Sie Zellen von der Seite der Schale hinzu und berühren Sie nicht die Kellermembranmatrix. Verwenden Sie Lichtmikroskop im Feld mit hoher Vergrößerung, um die Zellen zu überprüfen und Fotos zu machen.
- Quantitative Ergebnisse der Rohrbildung
- Beobachten Sie die Ergebnisse mit einem Mikroskop mit hoher Auflösung und machen Sie Bilder von mindestens 10 Bereichen für jede Gruppe, um zuverlässige Datenstatistiken zu erhalten.
- Untersuchen Sie die Bildung von Endothelrohren: Schätzen Sie das Ausmaß der Rohrbildung, indem Sie die gesamte Rohrlänge, die Rohrzahl und die Verzweigungspunkte untersuchen. Bewerten und zählen Sie die Anzahl und Länge der Zweige mit der ImageJ-Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung basiert auf einem Prinzip, das der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung ähnelt. Es wurde entwickelt, um sowohl die Empfindlichkeit und Spezifität in Zebrafisch ISH zu verbessern sowie zielspezifische Signale zu verstärken, ohne das Hintergrundsignal zu beeinflussen.
In 24 hpf Zebrafischembryonen exprimiert sich Endoglin stark in der hinteren Kardinalvene (PCV), intersegmentalen Gefäßen (ISVs) und Blutinseln3. Es ist schwierig, die Färbezeit in der traditionellen chromogenen In-situ-Hybridisierung (CISH) zu kontrollieren, wobei in einigen Regionen nicht-positive Signale auftreten, wie z. B. Dottersack (Abbildung 1A). Um die Rolle von eng in der frühen Gefäßentwicklung zu untersuchen, wurde ein hämogener Endothelmarker (aplnra) sowie ein weiterer endotheliale Vorläufermarker (nrp1a) verwendet, um zu untersuchen, welche Art von Endothel durch eng silencing20beeinflusst wurde. Die Expression von Aplnra und Nrp1a war bei 24 hpf-Embryonen schwach. Im Vergleich zu CISH wurde das schwache Signal der beiden Gene im Schwanzbereich nach einem eng Knockdown in WISH deutlich nachgewiesen (Abbildung 1B). Der Knockdown von eng RNA verursachte eine reduzierte Expression von zwei Arten von Endothelzellen Marker Genexpression in einem HHT-Tiermodell.
Vor der Durchführung von Experimenten an differenzierten iPSCs wurden die Zellen identifiziert und als ECs bestätigt. Morphologisch erschienen sie als Kopfsteinpflasterform. Die Expression der endotheliaalen Zelloberflächenmolekularmarker CD31, CD146, VE-Cadherin und vWF wurde mit IF-Färbung21bestätigt. Nach magnetischer Isolation mit CD31 wurde der funktionelle Test wie unten beschrieben durchgeführt.
Hierbei wurde der Rohrbildungstest mit dem eng mutierten und iPSC-abgeleiteten Endothelzellen durchgeführt. Die statistische Analyse wurde auf der Grundlage der Anzahl, der Zweige und der Längen der Rohre durchgeführt. Ein neuartiger Parameter wurde auch auf der Grundlage früherer Arbeiteneingeführt 3, Punkte der Angiogenese, um die Bildung von Endothelzellen zu reflektieren. Schließlich wurde festgestellt, dass eng mutierte Endothelzellen weniger Zweige bildeten als Kontrollen von Endothelzellen, und dass Zweige in eng mutierten Endothelzellen nach der Stimulation mit dem vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) signifikant zunahmen (Abbildung 2A,B). Die Mutation in eng führte zu einer defekten Gefäßrohrbildung.
Abbildung 1: Endoglin Knockdown verringerte die Expression von Endothelmarkern. (A) CISH und WISH wurden durchgeführt, um die Expression von Endoglin in 24 hpf Embryonen (n > 30) zu bestimmen. Das rote Feld stellt den vergrößerten Bereich dar. Skalenstäbe = 200 m . (B) Aplnra und Nrp1a Expression von WISH in 24 hpf Zebrafischembryonen der Kontroll-MO- und eng-MO-Gruppe. eng Der rote Pfeil zeigt Bereiche an, in denen die Expression dieser Gene signifikant abgenommen hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Rohrbildung von eng mutant und kontrolliPs-ECs. (A) Die Rohrbildung durch die vier Gruppen, einschließlich der Kontrollgruppe, der Kontrollgruppe + VEGF (Kontrollenvondothelzellen + 30 ng/mL VEGF), der eng mutant(eng mutant endothelialen Zellen) und der eng mutant + VEGF (eng mutant endotheliale Zellen + 30 ng/mL VEGF) Gruppe. Die Rohrbildung wurde nach 3 h bewertet und fotografiert. Skalenstäbe = 100 m . (B) Quantitative Ergebnisse der Rohrbildung werden gezeigt. Auf der abgedeckten Fläche wurden die Anzahl der Zweige und ihre Länge der Rohre durch Bild J berechnet. Fehlerbalken stellen die SD der Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten dar. Ein Wert von P wurde als statistisch signifikant betrachtet, wenn *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Embryonale Periode | Fixierungszeit |
| 4-Zellen bis 8 hpf | 4 Stunden |
| 8 hpf bis 24 hpf | 1 Stunden |
| 24 hpf bis 4 dpf | 30 Minuten |
Tabelle 1: Fixierungszeit für verschiedene embryonale Stadien.
| Embryonale Periode | Verdauungszeit |
| 4-Zellen bis 8 hpf | 2 Minuten |
| 8 hpf bis 24 hpf | 5 Minuten |
| 24 hpf bis 4 dpf | 10 Minuten |
Tabelle 2: Verdauungszeit, die für verschiedene embryonale Stadien erforderlich ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll wendete eine verbesserte In-situ-RNA-Analyseplattform für Zebrafisch- und Röhrenbildungstests auf iPSC-ECs an, die von einem HHT-Patienten abgeleitet wurden. Die traditionelle ISH-Methode erfordert einen längeren Experimentellen Zyklus mit zusätzlichen experimentellen Schritten. Das Protokoll hat einige wichtige Verbesserungen, die Verwendung von unabhängigen Doppel-Z-Sonden und iPSCs von einem Patienten mit HHT abgeleitet, die in WISH-Assays bzw. Rohrbildung angewendet wurden. Diese Verfeinerungen sind entscheidend für die Verbesserung der Erkennungsempfindlichkeit im Vergleich zu dem, was bei herkömmlichen ISH beobachtet wird. Die einzigartig gestalteten Sonden und die Zielsignalverstärkung ermöglichen den Nachweis selten exprimierter Transkripte(aplnra ist ein schlecht exprimiertes Gen in 24 hpf Embryonen). Eine Änderung ist die zusätzliche Fixierung nach der Sondenhybridisierung. Die zusätzliche Fixierung kann die Kombination von Sonden und Transkripten verbessern. DAB-Färbung wird auch anstelle von Fluoreszenzfärbung angewendet, weil festgestellt wurde, dass es schwierig war, Fluoreszenzfärbung in bestimmten Gene mit geringer Häufigkeit durchzuführen. Dann wurden iPSCs für Angiogenese-Assays verwendet, was die Bedeutung und klinische Relevanz dieser Arbeit erhöht. Die Generierung von iPSCs erfordert strenge Kulturbedingungen und stellt eine Einschränkung des Protokolls dar.
Einige kritische Schritte müssen hervorgehoben werden. In der WISH-Analyse sollte die Verdauungszeit von Zebrafischembryonen in strikter Übereinstimmung mit dem Text eingehalten werden. Eine kürzere Verdauungszeit kann nicht garantieren, dass sich die Sonde erfolgreich mit Transkripten verbindet. Im Gegensatz dazu wird eine verlängerte Verdauungszeit die Integrität von Embryonen zerstören. In den Rohrbildungsexperimenten sollte das bildgebende Timing gut kontrolliert werden. Im Allgemeinen werden die Endothelzellen zu Röhren innerhalb von 12 h, aber die röhrenförmige Struktur neigt dazu, sich nach 24 h aufzulösen. Die Zellzahl ist auch wichtig für die Rohrbildung, da eine zu hohe oder zu niedrige Zelldichte zu einer fehlgeschlagenen Rohrbildung führen kann. Wenn es schwierig ist, Endothelzellen zur Bildung von Röhren zu induzieren, ist es hilfreich, wachstumsfördernde Faktoren wie VEGF dem Kulturmedium als positiv zu kontrollieren, um die Fähigkeit von ECs zur Bildung von röhrenförmigen Strukturen zu testen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die verbesserte WISH-Methode als vorteilhafte Technik für Laborarbeitsabläufe angesehen wurde. Kürzlich hat unsere Forschungsgruppe damit begonnen, diesen Test in klinischen Proben zu testen. Angesichts einer höheren Empfindlichkeit und einer effizienteren Detektion als bei herkömmlichen Methoden ist diese verbesserte WISH-Methode ein wichtiges Versprechen für die Entwicklung und Implementierung von RNA-basierter molekularer Diagnostik22.
Die Durchführung des Röhrenbildungstests mit Patienten-iPSC-ECs ermöglicht die Bestätigung der Ergebnisse aus Tierstudien sowie die Identifizierung von eng krankheitserregenden Mutationen aus einem einzelnen Nukleotid-Polymorphismus im eng-Gen. Die Kombination dieser Methoden verdeutlicht die Rolle von eng in der Gefäßbildung und hält Potenzial bei der Genkorrektur des Patienten iPSC-ECs für die kardiovaskuläre Zelltherapie23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];the Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]] unterstützt; der CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [Fördernummer 2016-I2M-4-003 (an Jun Yang)]; der PUMC Youth Found und die Fundamental Research Funds for the Central Universities [Grant Nummer 2017310013 (to Fang Zhou)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
