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Developmental Biology

पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/60498
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 1, 3, 1,2
1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत संवहनी गठन में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लूरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं में जेब्राफिश और ट्यूब गठन परख में सीटू आरएनए संकरण विश्लेषण में पूरे माउंट के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

संवहनी विकास विशिष्ट जीन की अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है, जिसका विभिन्न विकासात्मक चरणों के दौरान जेब्राफिश में सीटू संकरण परख में प्रदर्शन करके अध्ययन किया जा सकता है। वंशानुगत रक्तस्रावी टेलांगिया (एचएचटी) के विकास के दौरान पोत गठन में एंडोग्लिन (इंग्लैंड) की भूमिका की जांच करने के लिए, जेब्राफिश में एंजी के मॉर्फोलिन-मध्यस्थता लक्षित नॉकडाउन का उपयोग इसकी लौकिक अभिव्यक्ति और संबद्ध कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां, सीटू आरएनए संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट को ज़ेब्राफिश भ्रूण में इंग्लैंड और उसके डाउनस्ट्रीम जीन के विश्लेषण के लिए नियोजित किया जाता है। इसके अलावा, एचएचटी रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लीरिटेंट स्टेम सेल-विभेदित एंडोथेलियल कोशिकाओं (आईपीएससी-ईसी; इंग्लैंड म्यूटेशन के साथ) में ट्यूब गठन परख ें की जाती हैं। सीटू संकरण में पूरी राशि का उपयोग करके एक विशिष्ट सिग्नल एम्पलिंग सिस्टम - इच्छा पारंपरिक तरीकों की तुलना में उच्च संकल्प और कम पृष्ठभूमि परिणाम प्रदान करती है। बेहतर संकेत प्राप्त करने के लिए, निर्धारण के बाद का समय जांच संकरण के बाद 30 min में समायोजित किया जाता है। क्योंकि फ्लोरेसेंस धुंधला ज़ेब्राफिश भ्रूण में संवेदनशील नहीं है, यह diaminobezidine (DAB) यहां धुंधला के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, एचएचटी रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी लाइनें जिनमें एक eng उत्परिवर्तन होते हैं, को एंडोथेलियल कोशिकाओं में अंतर किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एक प्लेट कोटिंग करने के बाद, आईपीएससी-ईसीएस कुओं में मोनोलेयर के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। फिर, ट्यूब की लंबाई और शाखाओं की संख्या सूक्ष्म छवियों का उपयोग करके गणना की जाती है। इस प्रकार, इस बेहतर इच्छा प्रोटोकॉल के साथ, यह दिखाया गया है कि कम eng अभिव्यक्ति जेब्राफिश भ्रूण में एंडोथेलियल प्रोजेनिटर गठन को प्रभावित करती है। एचएचटी के साथ एक मरीज से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस का उपयोग करके ट्यूब गठन परख द्वारा इसकी पुष्टि की जाती है। ये परख जल्दी संवहनी विकास में इंग्लैंड के लिए भूमिका की पुष्टि करते हैं ।

Introduction

एचएचटी वाले मरीजों में इंजी (सीडी105) पर सिंगल म्यूटेशन की जानकारी दी गई है। उत्परिवर्तन से ईसी प्रसार में वृद्धि होती है और प्रवाह-मध्यस्थता ईसी विस्तार1,2कम हो जाता है । यह भी पहले बताया गया है कि ENG की कमी जेब्राफिश3में एंडोथेलियल मार्कर अभिव्यक्ति (यानी, केडीआरएल, सीडीएच5, हे2)को कम करती है। एंडोग्लिन,मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, एक ट्रांसम्मेथग्कोप्रोटीन है और विकास कारक (टीजीएफ-ए) परिवार के सदस्यों को बदलने के लिए एक सह-रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है। यह ICs4की ओर स्टेम सेल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए Id1 अभिव्यक्ति सहित डाउनस्ट्रीम जीन को विनियमित करने के लिए सेल की सतह पर BMP9 बाध्यकारी निर्देश देता है । इस प्रकार, इंग्लैंड जीन वाकुलोजेनेसिस और मानव संवहनी रोग5,6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमने पहले जेब्राफिश भ्रूण में पोत गठन पर एंडोग्लिन नॉकडाउन के प्रभावों की जांच की है, जिसके बाद एक एचएचटी रोगी से प्राप्त आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसी का विश्लेषण किया गया है जो एक eng उत्परिवर्तन7असर करते हैं । यह प्रोटोकॉल एंडोथेलियल प्रोजेनिटर मार्कर अभिव्यक्ति और ट्यूब गठन पर ENG की कमी के प्रभाव को दर्शाता है, जो इन विट्रो एंजियोजेनेसिस को मापने के लिए एक मात्रात्मक विधि है।

इंग्लैंड स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, इच्छा वीवो8में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए नियोजित है । सीटू संकरण (ईश) में एक निश्चित नमूने में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड संकर का पता लगाने और कल्पना करने के लिए लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या एमआरएनए) के पूरक दृश्यों के साथ लेबल जांच का उपयोग करने की एक विधि है। यह प्रक्रिया वीवो में जीन अभिव्यक्ति संकेतों को बढ़ाती है और इसका उपयोग माइक्रोस्कोपी द्वारा जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है। इच्छा व्यापक रूप से विभिन्न मॉडल जानवरों में इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से जेब्राफिश9में । इसका उपयोग निम्नलिखित डेटा प्राप्त करने के लिए भी किया जाता है: 1) जीन स्थानिक/लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न, जो जीन समारोह और वर्गीकरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं; और 2) विशेष रूप से जीन मार्कर है कि उच्च थ्रूपुट दवा या उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग10में उपयोग किया जाता है व्यक्त की ।

गुणसूत्र जांच आसानी से सीटू संकरण (सीआईश) में पारंपरिक गुणसूत्र के साथ अपमानित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि शोर और गैर विशिष्ट संकेत11,12होते हैं । इच्छा विधि दो स्वतंत्र डबल जेड जांच का उपयोग करती है, जो आरएनए दृश्यों को लक्षित करने के लिए संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। प्रत्येक जांच में लक्ष्य आरएनए के पूरक 18-25 अनुक्रम और 14 आधार पूंछ अनुक्रम (जेड के रूप में संकल्पित) शामिल हैं। लक्ष्य जांच एक जोड़ी (डबल जेड) में उपयोग किया जाता है। दो पूंछ दृश्यों एक साथ preamplifier के लिए एक 28 आधार संकरण साइट है, जो एम्पलीफायर के लिए 20 बाध्यकारी साइटों में शामिल है फार्म । एम्पलीफायर, बदले में, लेबल जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें शामिल हैं और सैद्धांतिक रूप से प्रत्येक लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के लिए 8,000 लेबल तक उपज कर सकते हैं।

यह उन्नत तकनीक ऊतक आकृति विज्ञान13को संरक्षित करते हुए एकल अणु दृश्य को प्राप्त करने के लिए एक साथ संकेत प्रवर्धन और पृष्ठभूमि दमन की सुविधा प्रदान करती है। इच्छा विधियों का आगे संशोधन पिछले शोध14पर आधारित है, जिसमें अतिरिक्त निर्धारण और डीएबी धुंधला शामिल है। बशर्ते यहां एक बेहतर इच्छा प्रोटोकॉल है जो काम कर सकता है भले ही लक्ष्य आरएनए आंशिक रूप से कम हो या अपमानित हो। फायदे में शामिल है कि यह RNase मुक्त शर्तों के बिना 24 घंटे में पूरा किया जा सकता है । सिग्नल ों को एक साथ कई लक्ष्यों के कई चैनलों के माध्यम से भी पता लगाया जा सकता है, और परिणाम विभिन्न उच्च-थ्रूपुट स्वचालन प्लेटफार्मों के परिणामों के अनुरूप और संगत हैं।

पशु मॉडल से परिणाम आवश्यक नहीं है कि मनुष्यों में होता है एक ही घटना को प्रतिबिंबित करते हैं । ENG संरक्षित cysteines, C30-C207 और C53-C182, जो अनाथ क्षेत्रों में disulfide पुलों के रूप में दो जोड़े शामिल हैं । एचएचटी रोगियों में इंग्लैंड की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, एचएचटी रोगियों से प्राप्त आईपीएससी के साथ ट्यूब गठन परखों को बिना-इंग्लैंड म्यूटेशन (Cys30Arg, C30R)15के साथ कोशिकाओं में किया गया है । Kubota एट अल के बाद पहली बार ट्यूब गठन प्रयोग16की सूचना दी, परख कई मायनों में विकसित किया गया है । इसका उपयोग एंजियोजेनिक या एंटीएंजियोजेनिक कारकों की पहचान करने, एंजियोजेनेसिस में सिग्नलिंग रास्तों को परिभाषित करने और एंजियोजेनेसिस17को विनियमित करने वाले जीन की पहचान करने के लिए किया गया है।

रोगी से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस की उपलब्धता से पहले, शोधकर्ताओं ने एंजियोजेनसिस16का अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से सुसंस्कृत ईसी का उपयोग किया। हालांकि, एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए, ईसीएस द्वारा गुजरने वाली सीमित मार्ग संख्या के कारण, वायरस के साथ एक्सोजेनस जीन को स्थानांतरित करना एक तकनीकी चुनौती है। इसका कारण यह है कि वहां शायद ही पर्याप्त सेलुलर सामग्री के लिए या तो सर्जरी या मिलान अनुमोदित दाताओं से मानव जहाजों से एकत्र किया जाना है । शिन्या यामानाका द्वारा आईपीएससी उत्पादन तकनीक के आविष्कार के साथ, आईपीएससी से प्राप्त मानव ईसीएस का उपयोग इन विट्रो प्रयोगों में मज़बूती से किया जा सकता है, जैसा कि पहले18की रिपोर्ट दी गई थी।

सीमित संख्या और मार्ग के साथ वायरल ट्रांसड्यूड ईसी का उपयोग संकेत अध्ययनों के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन कार्यात्मक अध्ययनों के लिए, म्यूटेंट प्लूरीपोटस्टेम सेल लाइनें उत्पन्न करना बेहतर है, (या तो आईपीएससी या CRISPER/Cas9-लक्षित hESCs), फिर उन्हें एंजियोजेनेसिस अध्ययन के लिए ईसीएस में अंतर करें जो ट्यूब गठन का उपयोग करते हैं19। ट्यूब गठन का उपयोग उत्परिवर्तन वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक माइक्रो-स्लाइड एंजियोजेनेसिस प्लेट पर ट्यूब गठन का भी वर्णन करता है, जो एक आसान, लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य विधि है।

नीचे प्रोटोकॉल संवहनी गठन में विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रणालीगत विधि प्रदान करता है, साथ ही वीवो अभिव्यक्ति पैटर्न में विवरण और मानव रोग मॉडलिंग के लिए इन विट्रो कार्यात्मक परिमाणीकरण के साथ।

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Protocol

वर्णित सभी पशु प्रयोगों को झेजियांग विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन की रिसर्च एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी ।

1. सीटू संकरण में पूरे माउंट

  1. जेब्राफिश लाइन पशुपालन और प्रजनन
    1. प्रत्येक दिन के लिए 14 घंटे प्रकाश/10 एच डार्क चक्र के साथ एक पुन: प्रसारजल प्रणाली में 26-28 डिग्री सेल्सियस पर सभी वयस्क ज़ेब्राफिश फ़ीड और बढ़ा । निम्नलिखित प्रक्रियाओं के लिए एबी (जंगली प्रकार) जेब्राफिश लाइनों का उपयोग करें।
    2. अंडे के लिए एक आश्रय के रूप में प्रजनन बॉक्स के नीचे में कंकड़ की एक परत रखो। समूह माता पिता की मछली प्रत्येक बॉक्स में 2:1 (यानी, दो महिलाओं और एक पुरुष) के अनुपात में । मादा मछली को 1 दिन के लिए अंडे दें। स्पॉन के अंत में, माता-पिता की मछली को तुरंत हटा दें ताकि उन्हें अंडे खाने से रोका जा सके।
    3. एक माइक्रोस्कोप के तहत Femto जेट इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग कर एक सेल चरण भ्रूण में morpholinos के 2 एनजी और एमआरएनए के ५०० स्नातकोत्तर सुई (endoglin-MOs अनुक्रम: 5'-GATGAACTCAACACCTGTCTGAT-3'; 5-mispair नियंत्रण MOs अनुक्रम: 5'-AAACAGCCCCCCTCTCTTCTCTC-3 ') ।
    4. अम्लीय समुद्री जल में जाइगोट्स को लगभग 48 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. जेब्राफिश भ्रूण का संग्रह और निर्धारण
    1. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें परिसंचारी प्रणाली पानी (पीएच = 5.0) से 20-40 ज़ेब्राफिश भ्रूण इकट्ठा करने के लिए एक 1.5 mL ट्यूब में जब वे dechoriated और विकास की एक विशिष्ट अवधि तक पहुंच रहे हैं। कमरे के तापमान (आरटी) पर हौसले से तैयार 4% पीएफए समाधान के 1 mL जोड़ें।
      नोट: जिस अवधि में भ्रूण चुना गया वह प्रयोग के उद्देश्य पर आधारित है। तालिका 1 विभिन्न भ्रूणीय अवधियों के लिए आवश्यक निर्धारण समय दिखाती है।
    2. निर्धारण समाधान निकालें, ट्वीन-20 (पीएसटी, ट्वीन के 1000 मिलील पीबीएस समाधान में ट्वीन के 1 mL को पतला करने के साथ फास्फेट-बफर समाधान के साथ भ्रूण धोएं) आरटी में प्रत्येक 5 न्यूनतम के लिए 3x।
    3. 25%, 50% और 75% मेथनॉल (PBST में पतला) की एक श्रृंखला में 5 मिन प्रत्येक के लिए इनक्यूबेशन के माध्यम से भ्रूण निर्जलित। भ्रूण को 5 मिन के लिए 100% मेथनॉल में स्थानांतरित करें और ताजा मेथनॉल से बदलें। भ्रूण को रात या उससे अधिक समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. हाइड्रेशन और पाचन
    1. हाइड्रेट भ्रूण है कि 100% मेथनॉल में संरक्षित किया गया नीचे नायलॉन जाल के साथ एक छलनी का उपयोग करने के लिए क्रमिक रूप से 75%, 50% की एक श्रृंखला के साथ 12 अच्छी तरह प्लेटों के कुओं में भ्रूण धोने, और 25% मेथनॉल (PBST में पतला) 5 मिन के लिए प्रत्येक। आरटी में प्रत्येक 5 मिन के लिए PBST 3x के साथ भ्रूण धोएं ।
    2. भ्रूण के साथ ट्यूब में प्रोटीन के 50 माइक्रोन जोड़ें कश्मीर (10 मिलीग्राम/mL) और आरटी में तालिका 2 में पाचन समय का पालन करें।
    3. प्रोटीनएसई के निकालें और आरटी पर प्रत्येक 5 मिन के लिए PBST 3x के साथ भ्रूण धोएं।
  4. जांच संकरण और निर्धारण के बाद
    1. प्रत्येक जीन के mRNA दृश्यों के अनुसार डिजाइन की गई जांच को 40 डिग्री सेल्सियस हाइब्रिडिजिन सिस्टम में तब तक रखें जब तक कि वर्षा भंग न हो जाए, जो ~ 10 min लेना चाहिए । उदाहरण के लक्ष्य जांच (XM_007116.7) और एक अतिरिक्त दो महत्वपूर्ण जीन जल्दी मेसोडर्म एंडोथेल प्रोजेनिटर गठन में शामिल (यहां, एपीएलआर [NM_001075105.1] और nrp1a [NM_001040326.1]) एक 50:1:1 अनुपात में एक 1.5 mL ट्यूब में शामिल है ।
    2. भ्रूण के साथ प्रत्येक ट्यूब में मिश्रित लक्ष्य जांच के 50-100 μL जोड़ें, तो ४० डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।
      नोट: पूर्व मिश्रित जांच को 40 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गर्म किया जाना चाहिए और उपयोग से पहले आरटी को ठंडा किया जाना चाहिए।
    3. ट्वीन-20 (एसएससीटी) के साथ 0.2 x खारा सोडियम साइटरेट समाधान तैयार करें: 20x एसएससी समाधान प्राप्त करने के लिए 175.3 ग्राम नैल और 88 ग्राम सोडियम साइटरेट को डीएच2ओ के 1 एल में भंग करें। फिर, 0.2 x एसएससीटी समाधान प्राप्त करने के लिए डीएच2ओ में समाधान 1:100 को पतला करें। 0.2x एसएससीटी समाधान में पतला ट्वीन-20 1:1000।
    4. पुनर्नवीनीकरण जांच को एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित करें। आरटी में प्रत्येक 15 मिन के लिए 0.2x एसएससीटी समाधान 3x में भ्रूण धोलें। पुनर्नवीनीकरण जांच 5x-10x पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    5. आरटी में 30 मिन के लिए भ्रूण को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करें। 0.2x एसएससीटी समाधान 3x में भ्रूण को आरटी पर 15 min के लिए धोएं।
      नोट: सकल-Thebing एट अल का काम 10 मिन14की एक के बाद निर्धारण अवधि का सुझाव है, लेकिन वास्तविक राशि तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । यहां, हमने 10 मिन पोस्ट-फिक्सेशन 3x का परीक्षण किया, और डीएबी मरने की संवेदनशीलता काफी प्रभावित होती है। जांच के बाद, सुनिश्चित करें कि 0.5-1.0 घंटे का निर्धारण इष्टतम स्थिति है (एक छोटी निर्धारण अवधि लक्ष्य आरएनए से स्पष्ट संकेत का उत्पादन नहीं कर सकती है, और निर्धारण समय का उचित विस्तार संकेत को मजबूत करने और कम पृष्ठभूमि शोर प्रदान करने में मदद करता है)।
  5. अनुक्रमिक एम्पलीफायर और लेबल जांच संकरण
    1. एसएससीटी समाधान निकालें और Amp 1 के 50 μL के साथ बदलें। भ्रूण को 30 मिन के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर Amp 1 में बसने की अनुमति दें। फिर, आरटी में प्रत्येक 15 मिन के लिए 0.2x एसएससीटी समाधान 3x में भ्रूण धोलें।
    2. एसएससीटी समाधान निकालें और एएमपी 2 के 50 माइक्रोन जोड़ें। भ्रूण को 15 मिन के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर बसने की अनुमति दें। फिर, आरटी में प्रत्येक 15 मिन के लिए 0.2x एसएससीटी समाधान 3x में भ्रूण धोलें।
    3. एसएससीटी समाधान निकालें, Amp 3 के 50 μL जोड़ें और ट्यूब हल्का नल। इसके बाद भ्रूण को 30 मिन के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 02x एसएससीटी सॉल्यूशन 3x में भ्रूण को आरटी पर 15 मिन के लिए धोलें।
    4. एसएससीटी समाधान निकालें, Amp 4 ड्रॉपवाइज के 50 माइक्रोन जोड़ें, और ध्यान से ट्यूब पर टैप करें। इसके बाद भ्रूण को 15 मिन के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 02x एसएससीटी 3x में भ्रूण को आरटी पर 15 मिन के लिए धोलें।
  6. काउंटरस्लिंग और माइक्रोस्कोपी
    1. एसएससीटी समाधान निकालें और प्रत्येक ट्यूब में डीएपीआई के 50 माइक्रोन जोड़ें। भ्रूण को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. PBST के साथ भ्रूण धोने और उन्हें एक 1% कम पिघलने बिंदु agarose (LMP) समाधान (DH2O के 100 mL में भंग एलएमपी के 1 ग्राम) का उपयोग कर इमेजिंग के लिए तैयार एक पेट्री PBST से भरा पकवान में।
    3. नमूने को दागने के लिए एक DAB peroxidase सब्सट्रेट किट का उपयोग करें। आसुत पानी के 1 मिलील में रंग अभिकर्मक ए, बी और सी (50 माइक्रोन प्रत्येक) जोड़ें और एक पूर्ण डीएबी काम करने वाले तरल पदार्थ प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। नमूने में तरल पदार्थ जोड़ें और 10 00 के लिए कवर करें।
    4. धुंधला करने के बाद नमूना को पीएसटी के साथ अच्छी तरह धो लें।
    5. नमूनों को इमेजिंग करने के लिए फोटोग्राफिक फ़ंक्शन के साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: यदि बाद में छवियां ले रही हैं, तो ट्यूबों को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

2. ट्यूब गठन परख

नोट: एक एचएचटी रोगी (यहां, से प्राप्त आईपीएससी से इंगित किया गया था, eng उत्परिवर्ती और वाइल्डटाइप ईसी (नियंत्रण) 22 साल की उम्र से आवर्ती एपिस्टैक्सिस के साथ एक ६२ वर्षीय महिला रोगी, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रक्तस्राव, फेफड़े की धमनी विकृतियों, स्थिति c.88T>c एक्सॉन 2 में एक गलत भावना eng उत्परिवर्तन ले जाने) और एक स्वस्थ दाता (बिना eng उत्परिवर्तन के), जो कॉलेज अनुसंधान नैतिकता समिति से अनुमोदन के साथ पीकिंग यूनियन मेडिकल कॉलेज अस्पताल द्वारा प्रदान किए गए थे ।

  1. नियंत्रण और एचएचटी आईपीएससी सेल संस्कृतियां
    1. अच्छी तरह से नीचे को कवर करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करने के लिए एक 6 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स) की एक निश्चित मात्रा जोड़ें।
      नोट: जब पहली बार तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, बर्फ पर इनक्यूबेट या एक ठंढ मुक्त 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में जब तक गल । फिर, DMEM/F12 में 1:100 पर पतला, तो २०० μL प्रत्येक युक्त २०० μL ट्यूबों में diluent वितरित । ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और बार-बार ठंड और विगलन से बचें। पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ते समय, बुलबुले न बनाएं। पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ने के बाद, 6 अच्छी तरह से थाली धीरे हाथ से हिला इतना है कि यह समान रूप से नीचे को कवर किया ।
    2. प्लेट को लेप करने के बाद, उपयोग किए गए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान को कुओं से हटा दें। फिर, प्रत्येक कुएं में mTeSR1 मध्यम के 2 mL जोड़ें, और प्लेट आईपीएससी लगभग 1 x 106 प्रति अच्छी तरह से पिछले मार्ग से काटा ।
  2. आईपीएससी से ईसी का उत्पादन और विस्तार
    1. आईपीएससी संस्कृति के लगभग 4 दिनों के बाद, बीईएल माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान करें, जो एक्टिविन ए (25 एनजी/एमएल), बीएमपी4 (30 एनजी/एमएल), VEGF165 (50 एनजी/mL), और CHIR99021 (1.5 μM) के साथ पूरक है। मेसोडरम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. वीएफ माध्यम के साथ बीईएल माध्यम के साथ वर्णित माध्यम को बदलें जो वैस्कुलर ईसीएस का विस्तार करने के लिए 4 दिनों के लिए VEGF (50 एनजी/mL) और SB431542 (10 μM) के साथ पूरक है। कोशिकाओं को एक ही माध्यम और संस्कृति के साथ एक और 3-4 दिनों के लिए इलाज करें।
    3. परिपक्व संवहनी ईसीएस को शुद्ध करने के लिए CD31-dynabeads का उपयोग करें: CD31-डायनामोड्स किट में निर्देशों को देखें, जो मानव सीडी 31 एंटीबॉडी को चुंबकीय मोतियों के साथ जोड़ता है ताकि ईसीएस पर व्यक्त किए गए सीडी 31 अणुओं को संयोजित किया जा सके, फिर एल्यूशन बफर द्वारा CD31-सकारात्मक कोशिकाओं को एकत्र करें। EC-SFM माध्यम में शुद्ध ईसीएस को बनाए रखें और विस्तारित करें जिसमें VEGF165 (30 एनजी/mL), bFGF (30 एनजी/mL), और FBS (1%)
  3. मैट्रिगेल-कोटेड प्लेटों और माइक्रोस्कोपी पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को चढ़ाना
    1. एंजियोजेनेसिस प्लेटों को कोट करने के लिए प्रति अच्छी तरह से बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 10 μL जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और 30 मिन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एंडोथेलियल मार्कर सीडी 31 और वीई-कैथेरिन की जांच के बाद संवासिन के साथ फसल एंडोथेलियल कोशिकाएं स्टेनिंग और उन्हें एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम 2 में बार-बार पाइपिंग करके फिर से सस्पेंड कर देती हैं। जम मैट्रिक्स पर प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन (2 x 105 कोशिकाओं/mL) के 50 μL जोड़ें और 3-5 घंटे के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: ट्यूब गठन प्रयोग से पहले, एंडोथेलियल मार्कर की जांच की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कार्यात्मक एंडोथेलियल कोशिकाओं का उचित फेनोटाइप। 1 x 104 सेल प्रति अच्छी तरह से ट्यूब गठन के लिए एक आदर्श संख्या है। बहुत सारे या बहुत कम कोशिकाएं ट्यूब गठन के लिए अनुकूल नहीं हैं। डिश के किनारे से कोशिकाओं को जोड़ें और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को छूने नहीं है। कोशिकाओं की जांच करने और तस्वीरें लेने के लिए उच्च आवर्धन क्षेत्र में हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  4. ट्यूब गठन के मात्रात्मक परिणाम
    1. उच्च संकल्प के साथ एक माइक्रोस्कोप के साथ परिणामों का निरीक्षण करें और विश्वसनीय डेटा आंकड़े प्राप्त करने के लिए प्रत्येक समूह के लिए कम से कम 10 क्षेत्रों की तस्वीरें लें।
    2. एंडोथेलियल ट्यूब गठन की जांच करें: समग्र ट्यूब लंबाई, ट्यूब नंबर और शाखा बिंदुओं का निरीक्षण करके ट्यूब गठन की सीमा का अनुमान लगाएं। इमेजजे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके शाखाओं की संख्या और लंबाई का आकलन करें और गिनें।

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Representative Results

सीटू संकरण में पूरे माउंट फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के समान सिद्धांत पर आधारित है। यह पृष्ठभूमि संकेत को प्रभावित किए बिना जेब्राफिश ईश में संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ-साथ लक्ष्य-विशिष्ट संकेतों को बढ़ाना दोनों के लिए डिज़ाइन किया गया है।

24 एचपीएफ जेब्राफिश भ्रूण में, एंडोग्लिन को पीछे कार्डिनल नस (पीसीवी), इंटरसेगमेंटल जहाजों (आईएसवी), और रक्त द्वीप3में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। सीटू संकरण (सीआईएसिश) में पारंपरिक गुणसूत्र में धुंधला समय को नियंत्रित करना मुश्किल है, कुछ क्षेत्रों में होने वाले गैर-सकारात्मक संकेतों के साथ, जैसे जर्दी सैक(चित्रा 1ए)। प्रारंभिक संवहनी विकास में इंग्लैंड की भूमिका की जांच करने के लिए, एक हीमोजेनिक एंडोथेलियल मार्कर का उपयोग किया गया था(एप्लार्ना)के साथ-साथ एक और एंडोथेलियल प्रोजेनिटर मार्कर(nrp1a)यह जांचने के लिए कि20 को इंग साइलेन िंग से किस प्रकार का एंडोथेलियम प्रभावित हुआ था। एचपीएफ के 24 भ्रूणों में एप्लाजरा और एनआरपी1ए की अभिव्यक्ति कमजोर थी। CISH की तुलना में, दो जीन से कमजोर संकेत स्पष्ट रूप से इच्छा में इंग्लैंड नॉकडाउन(चित्रा 1बी)के बाद पूंछ क्षेत्र में प्रदर्शन किया गया था । Eng RNA के नॉकडाउन एक HHT पशु मॉडल में एंडोथेलियल कोशिकाओं मार्कर जीन अभिव्यक्ति के दो प्रकार की अभिव्यक्ति कम हुई ।

विभेदित आईपीएससी पर प्रयोग करने से पहले कोशिकाओं की पहचान की गई और उन्हें ईसी के रूप में पुष्ट किया गया । रूपात्मक रूप से, वे कोबलस्टोन आकार के रूप में दिखाई दिए। एंडोथेलियल सेल सतह आणविक मार्कर सीडी 31, सीडी 146, वीई-कैथेरिन और वीडब्ल्यूएफ की अभिव्यक्ति की पुष्टि अगर धुंधला21के साथ की गई थी। CD31 का उपयोग करचुंबकीय आधारित अलगाव के बाद, कार्यात्मक परख नीचे वर्णित के रूप में आयोजित किया गया था ।

यहां, ट्यूब गठन परख eng उत्परिवर्ती और नियंत्रण iPSC-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग कर किया गया था । ट्यूबों की संख्या, शाखाओं और लंबाई के आधार पर सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। एंडोथेलियल कोशिकाओं के ट्यूब गठन को प्रतिबिंबित करने के लिए पिछले कार्य3,एंजियोजेनेसिस के बिंदुओं के आधार पर एक उपन्यास पैरामीटर भी पेश किया गया था। अंततः, यह पाया गया कि eng उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं ने एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में कम शाखाओं का गठन किया, और एंग उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं में शाखाओं में संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF)(चित्रा 2ए, बी)के साथ उत्तेजना के बाद काफी वृद्धि हुई। इंग्लैंड में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप खराब पोत ट्यूब का गठन हुआ।

Figure 1
चित्रा 1: एंडोग्लिन नॉकडाउन ने एंडोथेलियल मार्कर की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। (A)सीआईश और इच्छा 24 एचपीएफ भ्रूण (एन एंड जीटी; 30) में एंडोग्लिन की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए की गई थी । लाल बॉक्स बढ़े हुए क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन.(बी) एप्लाजरऔर nrp1a अभिव्यक्ति नियंत्रण-एमओ और eng-MOसमूह के 24 एचपीएफ जेब्राफिश भ्रूण में इच्छा द्वारा। लाल तीर उन क्षेत्रों को इंगित करता है जहां इन जीनों की अभिव्यक्ति में काफी कमी आई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इंग उत्परिवर्ती और नियंत्रण iPSC-ECs के ट्यूब गठन । (A)नियंत्रण समूह, नियंत्रण + VEGF (नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं + 30 एनजी/mL VEGF), इंग्लैंड उत्परिवर्ती(इंग्लैंड उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं) समूह, और इंग्लैंड उत्परिवर्ती + VEGF(इंग्लैंड उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं + 30 एनजी/mL VEGF) समूह सहित चार समूहों द्वारा ट्यूब गठन । ट्यूब गठन का आकलन किया गया था और 3 एच स्केल बार = 100 माइक्रोन के बाद फोटो खिंचवाने।(B)ट्यूब गठन के मात्रात्मक परिणाम दिखाए जाते हैं। कवर क्षेत्र में शाखाओं की संख्या और ट्यूबों की उनकी लंबाई छवि जे त्रुटि सलाखों द्वारा गणना की गई तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब मूल्यों के एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं । पी एंड एलटी; 0.05 पर पी का मूल्य सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

भ्रूणकाल निर्धारण का समय
4-कोशिकाओं को 8 एचपीएफ 4 घंटे
8 एचपीएफ से 24 एचपीएफ 1 घंटे
24 एचपीएफ से 4 डीपीएफ 30 मिनट

तालिका 1: विभिन्न भ्रूणीय चरणों के लिए आवश्यक निर्धारण समय।

भ्रूणकाल पाचन समय
4-कोशिकाओं को 8 एचपीएफ 2 मिनट
8 एचपीएफ से 24 एचपीएफ 5 मिनट
24 एचपीएफ से 4 डीपीएफ 10 मिनट

तालिका 2: विभिन्न भ्रूणीय चरणों के लिए पाचन समय आवश्यक है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने एचएचटी रोगी से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस पर जेब्राफिश और ट्यूब गठन परखों के लिए सीटू आरएनए विश्लेषण मंच में एक बेहतर पूरे माउंट लागू किया। पारंपरिक ईश विधि अतिरिक्त प्रयोगात्मक चरणों के साथ एक लंबे समय तक प्रयोगात्मक चक्र की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण सुधार हैं, स्वतंत्र डबल जेड जांच और आईपीएससी का उपयोग एचएचटी के साथ एक रोगी से प्राप्त किया गया है जो क्रमशः इच्छा परखों और ट्यूब गठन में लागू किए गए थे। ये शोधन पारंपरिक ईश के साथ मनाए जाने वाले विचारों की तुलना में पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। विशिष्ट रूप से डिजाइन की गई जांच और लक्ष्य संकेत प्रवर्धन शायद ही कभी व्यक्त किए गए टेप का पता लगाने की अनुमति देता है(एप्लएनआरए 24 एचपीएफ भ्रूण में एक खराब व्यक्त जीन है)। एक संशोधन जांच संकरण के बाद अतिरिक्त निर्धारण है। अतिरिक्त निर्धारण जांच और टेप के संयोजन को बढ़ा सकता है। DAB धुंधला भी फ्लोरेसेंस धुंधला के बजाय लागू किया जाता है, क्योंकि यह पाया गया था कि यह कुछ कम बहुतायत जीन में फ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल था । इसके बाद आईपीएससी का इस्तेमाल एंजियोजेनेसिस परख के लिए किया जाता था, जिससे इस काम की सार्थकता और क्लीनिक की प्रासंगिकता बढ़ जाती है। आईपीएससी के उत्पादन के लिए सख्त संस्कृति की स्थिति की आवश्यकता होती है और प्रोटोकॉल की सीमा का प्रतिनिधित्व करता है ।

कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर प्रकाश डाला जाना चाहिए । इच्छा विश्लेषण में, जेब्राफिश भ्रूण के पाचन समय का पाठ के सख्त अनुसार पालन किया जाना चाहिए। एक छोटा पाचन समय गारंटी नहीं दे सकता कि जांच सफलतापूर्वक टेप के साथ जोड़ती है । इसके विपरीत, विस्तारित पाचन समय भ्रूण की अखंडता को नष्ट कर देगा। ट्यूब निर्माण प्रयोगों में इमेजिंग टाइमिंग को अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाना चाहिए। आम तौर पर, एंडोथेलियल कोशिकाएं 12 घंटे के भीतर ट्यूब बन जाएंगी लेकिन ट्यूबलर संरचना 24 घंटे के बाद विघटित हो जाती है। सेल संख्या ट्यूब गठन के लिए भी महत्वपूर्ण है, एक सेल घनत्व है कि बहुत अधिक या बहुत कम है के रूप में विफल ट्यूब गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यदि ट्यूब बनाने के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रेरित करना मुश्किल है, तो ट्यूबलर संरचनाओं के गठन के लिए ईसीएस की क्षमता का परीक्षण करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में संस्कृति माध्यम में VEGF जैसे विकास कारकों को जोड़ना शामिल करना उपयोगी है।

सारांश में, उन्नत इच्छा विधि को प्रयोगशाला कार्यप्रवाह के लिए एक लाभप्रद तकनीक माना गया है। हाल ही में हमारे रिसर्च ग्रुप ने क्लीनिकल सैंपल में इस परख का परीक्षण करना शुरू कर दिया है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और अधिक कुशल पता लगाने पर विचार करते हुए, यह बेहतर इच्छा विधि आरएनए-आधारित आणविक निदान22के विकास और कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण वादा रखती है।

रोगी आईपीएससी-ईसीएस का उपयोग करके ट्यूब गठन परख का प्रदर्शन पशु अध्ययन से परिणामों की पुष्टि के साथ-साथ इंग्लैंड जीन में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता से रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तनों की पहचान की अनुमति देता है। इन तरीकों का संयोजन वैस्कुलर गठन में इंग्लैंड की भूमिका को स्पष्ट करता है और हृदय कोशिका चिकित्सा23के लिए रोगी आईपीएससी-ईसीएस के जीन सुधार में क्षमता रखता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन-स्टेम सेल और ट्रांसलेशनल रिसर्च [ग्रांट नंबर 2016YFA0102300(जून यांग के लिए) के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था]; चीन का नेचर साइंस फाउंडेशन [अनुदान संख्या ८१८७००५१, ८१६७००५४ (जून यांग के लिए)]; सीएएमएस इनोवेशन फंड फॉर मेडिकल साइंसेज (सीआईएफएमएस) [ग्रांट नंबर 2016-आई2एम-4-003 (जून यांग तक)]; PUMC युवा पाया और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष [अनुदान संख्या २०१७३१००१३ (फेंग झोउ के लिए)] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis ibidi 81506 Cell culture
Amp 1-FL ACD SDS 320852 Signal Amplification
Amp 2-FL ACD SDS 320853 Signal Amplification
Amp 3-FL ACD SDS 320854 Signal Amplification
Amp 4 Alt B-FL ACD SDS 320856 Signal Amplification
Corning Matrigel Matrix Corning 354234 Growth factor-reduced Matrigel
DEPC Sigma D5758 RNAase-free Water
Human Endothelial-SFM Thermofisher 11111044 Cell culture
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Fixed embryos
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Fixed Cells
Protease K ACD SDS 322337 Digest tissue
Sodium Citrate Sigma 6132-04-3 SSCT solution: Wash Buffer
VEGF-165 STEMCELL Technologies 78073 Growth factor

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 159 सीटू संकरण में संपूर्ण माउंट आईपीएससी-ईसी ट्यूब गठन संवहनी विकास एचएचटी हृदय रोग
पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए
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Wang, Y., Zhang, D., Zhou, F., Zhou, M., Li, Q., Chen, J., Yang, J. Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development. J. Vis. Exp. (159), e60498, doi:10.3791/60498 (2020).

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