Summary
여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.
Abstract
혈관 발달은 특정 유전자의 순차적 발현에 의해 결정되며, 이는 상이한 발달 단계 동안 제브라피시의 실화 혼성 분석실험에서 수행함으로써 연구될 수 있다. 유전 출혈성 모두랑성 말단확장증 (HHT)의 발달 도중 혈관 형성에 있는 endoglin (eng)의 역할을 조사하기 위하여는, zebrafish에 있는 eng의 모르폴리노 중재한 표적 녹다운은 그것의 측두식 및 관련 기능을 공부하기 위하여 이용됩니다. 여기서, 제브라피시 배아에서 의 eng 및 그 하류 유전자의 분석을 위해 위시(WISH)의 전체 마운트가 채용된다. 또한, 튜브 형성 은 HHT 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 에서 수행 -분화 내피 세포 (iPSC-ECs; eng 돌연변이와 함께). 전체 양을 사용하는 특정 신호 증폭 시스템 인 시투 하이브리드화 – WISH는 기존 방법에 비해 더 높은 해상도와 낮은 배경 결과를 제공합니다. 더 나은 신호를 얻기 위해, 포스트 픽스레이션 시간은 프로브 혼성화 후 30분으로 조정된다. 형광 염색은 제브라피시 배아에 민감하지 않기 때문에, 여기에서 염색하는 디아미노베지딘(DAB)으로 대체된다. 이 프로토콜에서, eng 돌연변이를 포함하는 HHT 환자 유래 iPSC 라인은 내피 세포로 분화된다. 37°C에서 30분 동안 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅한 후, iPSC-EC는 웰내로 단층으로 시드되고 3시간 동안 37°C에서 유지된다. 그런 다음, 튜브 길이와 가지의 수는 현미경 이미지를 사용하여 계산된다. 따라서, 이러한 개선된 WISH 프로토콜을 통해, 감소된 eng 발현이 제브라피시 배아에서 내피 전구 형성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이것은 HHT를 가진 환자에게서 파생된 iPSC-EC를 사용하여 관 대형 검역에 의해 추가확인됩니다. 이러한 해약은 초기 혈관 발달에서 eng에 대한 역할을 확인한다.
Introduction
eng (CD105)에 단 하나 돌연변이는 HHT를 가진 환자에서 보고되었습니다. 돌연변이는 증가된 EC 증식 및 감소된 유동 매개 EC 신장1,,2로이어집니다. 또한 이전에 는 ENG 결핍이 제브라피시3에서내피 마커 발현(즉, kdrl, cdh5, hey2)을감소시킨다고 보고되었다. Endoglin,주로 내피 세포에서 발현, 막 막 당단백질 및 성장 인자 β (TGF-β) 가족 구성원을 변형시키기위한 공동 수용체로서의 기능. 그것은 ECs 4를향해 줄기 세포 분화를 유도하기 위하여 Id1 발현을 포함하여 다운스트림 유전자를 통제하기 위하여 세포 표면에 BMP9 결합을 지시합니다. 따라서, eng 유전자는 혈관 발생 및 인간 혈관 질환5,,6에서중요한 역할을 한다. 우리는 이전에 eng 돌연변이를 품고 HHT 환자에게서 취득한 iPSCs 파생된 ECs의 분석에 선행된 zebrafish 태아에 있는 혈관 대형에 endoglin 녹다운의 효력을 검토했습니다7. 이 프로토콜은 내피 전구 마커 발현 및 튜브 형성에 대한 ENG 결핍의 효과를 보여 주며, 이는 시험관 내 혈관신생을 측정하기 위한 정량화 가능한 방법이다.
eng 공간 및 시간발현을 연구하기 위해, WISH는 생체 내 유전자 발현을 검출하기 위해 사용된다8. 상기 소성형화(ISH)는 고정된 시편에서 표적 핵산 하이브리드를 검출하고 시각화하기 위해 표적 핵산(DNA 또는 mRNA)의 보체 서열을 가진 표지된 프로브를 사용하는 방법이다. 이 과정은 생체 내에서 유전자 발현 신호를 증폭시키고 현미경 검사법에 의한 유전자의 발현을 감지하는 데 사용됩니다. WISH는 다양한 모델 동물, 특히 제브라피시9에서널리 사용되어 왔습니다. 그것은 또한 다음 데이터를 취득 하는 데 사용 됩니다.: 1) 유전자 기능 및 분류에 대 한 정보를 제공 하는 유전자 공간/시간 발현 패턴; 및 2) 고처리량 약물 또는 돌연변이 스크리닝에 사용되는 구체적으로 발현된 유전자마커(10).
발색성 프로브는 높은 배경 잡음 및 비특이적 신호11,,12의결과로 SITU 혼성화 (CISH)에서 전통적인 염색체로 쉽게 분해됩니다. WISH 방법은 두 개의 독립적인 이중 Z 프로브를 사용하며, 이는 표적 RNA 서열을 혼성화하도록 설계되었습니다. 각 프로브는 표적 RNA 및 14염기 꼬리 서열에 상보적인 18-25 서열을 함유한다(Z로 개념화). 대상 프로브는 쌍(이중 Z)으로 사용됩니다. 두 개의 테일 서퀀스는 함께 증폭기용 20개의 결합 부위를 포함하는 프리앰프에 대한 28개의 염기 혼성화 사이트를 형성한다. 증폭기는 차례로, 라벨 프로브를 위한 20개의 결합 사이트를 포함하고 이론적으로 각 표적 RNA 순서를 위한 8,000개의 레이블까지 산출할 수 있습니다.
이 첨단 기술은 조직 형태(13)를보존하면서 단일 분자 시각화를 달성하기 위해 동시 신호 증폭 및 배경 억제를 용이하게합니다. WISH 방법의 추가 수정은 추가 고정 및 DAB 염색을 포함하여 이전 연구14를기반으로합니다. 여기서 제공되는 표적 RNA가 부분적으로 감소되거나 저하되더라도 작동할 수 있는 개선된 WISH 프로토콜이 있다. 장점은 RNase없는 조건없이 24 시간에서 완료 할 수 있다는 것을 포함한다. 또한 여러 대상의 여러 채널을 통해 신호를 동시에 감지할 수 있으며, 그 결과는 서로 다른 고처리량 자동화 플랫폼의 결과와 일관되고 호환됩니다.
동물 모델의 결과는 인간에서 발생하는 동일한 현상을 반영할 필요가 없습니다. ENG에는 고아 지역에서 이황화물 다리를 형성하는 보존 된 시스테인, C30-C207 및 C53-C182 쌍이 포함되어 있습니다. HHT 환자에서 eng의 역할을 추가로 연구하기 위해, HHT 환자로부터 유래된 iPSCs를 가진 관 형성 성 세포는 eng 돌연변이가 없는 세포에서 수행되었다(Cys30Arg, C30R)15. Kubota 외. 먼저 튜브 형성 실험16을보고 한 후, 분석실험은 여러 가지 방법으로 개발되었다. 혈관신생 또는 항혈관신생 인자를 식별하고, 혈관신생에서 신호 경로를 정의하고, 혈관신생을 조절하는 유전자를 식별하는 데 사용되어 왔다17.
환자 유래 iPSC-EC의 가용성 이전에, 연구원은 혈관 신생을 연구하기 위하여 주로 배양된 EC를이용했습니다 16. 그러나, 내피 세포의 경우, IC가 겪을 수있는 제한된 통로 수 때문에 바이러스로 외인성 유전자를 변환하는 것은 기술적 인 도전입니다. 이것은 수술 또는 일치하는 승인된 기증자에서 인간 적인 혈관에서 집합될 거의 충분한 세포 물질이 없기 때문입니다. 야마나카 신야에 의한 iPSC 생성 기술의 발명으로, iPSCs로부터 유래된 인간 ECs는 시험관 내 실험에서 안정적으로 사용될 수 있다고18일이전에 보고된 바와 같이.
제한된 수와 통로를 가진 바이러스성 으로 변환된 ECs를 사용하는 것은 신호 연구 결과를 위해 충분할지도 모르지만, 기능적인 연구 결과를 위해, 돌연변이 다능성 줄기 세포주(iPSCs 또는 CRISPER/Cas9 표적 hESCs)를 생성하는 것이 좋습니다, 그 다음 관 형성 분석제19를사용하는 혈관 신생 연구를 위해 ECs로 분화. 관 형성은 돌연변이를 베어링 내피 세포의 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 또한 쉽고 비용 효율적이며 재현 가능한 방법인 μ-slide 혈관신생 플레이트에서 튜브 형성을 설명합니다.
아래 프로토콜은 생체 내 발현 패턴 및 인체 질환 모델링을 위한 생체외 기능적 정량화에 대한 세부 사항과 함께 혈관 형성에서 특정 유전자의 역할을 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 체계적인 방법을 제공합니다.
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Protocol
설명된 모든 동물 실험은 절강 대학 의과 대학의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 전체 마운트 인 시투 하이브리드화
- 제브라피쉬 라인 축산 및 복제품
- 매일 14 시간 빛 / 10 h 다크 사이클로 재순환 양식 시스템에서 모든 성인 얼룩말 물고기를 26-28 °C에서 공급하고 올립니다. 다음 절차에 AB(야생형) 제브라피쉬 라인을 사용하십시오.
- 계란을위한 피난처로 번식 상자의 바닥에 자갈의 층을 넣어. 각 상자에 2:1(즉, 암컷 2마리와 수컷 1마리)의 비율로 어류를 그룹화한다. 암컷 물고기가 1 일 동안 산란하게하십시오. 산란이 끝나면, 알을 먹지 못하도록 즉시 부모 물고기를 제거하십시오.
- 펨토 제트 주입 시스템을 사용하여 1 세포 단계 배아에 모르폴리노 2 ng와 mRNA 500 pg를 주입하십시오 (endoglin-MOS 서열: 5'-GATGAACTACACACACTTGTTGAT-3'; 5-mispair 제어 모스 서열: 5'-AAACAACACATCTCTCTCTCTCtCtCtCtCtCtCt-3').
- 약 48 시간 동안 27 °C에서 산성 해수에서 zygotes를 배양합니다.
- 제브라피쉬 배아의 수집 및 고정
- 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 순환 시스템 물(pH = 5.0)에서 20-40개의 제브라피시 배아를 1.5mL 튜브에 모아 특정 개발 기간에 도달합니다. 실온(RT)에서 갓 준비한 4% PFA 용액 1mL를 추가합니다.
참고: 배아가 선택한 기간은 실험의 목적에 기초한다. 표 1은 상이한 배아 기간에 필요한 고정 시간을 나타낸다. - 고정 용액을 제거하고, Tween-20 (PBST, 1 mL의 트웬을 PBS 용액 1000 mL로 희석)으로 인산완충액으로 배아를 RT에서 각각 5 분 동안 3x로 씻으하십시오.
- 배아를 25%, 50% 및 75% 메탄올(PBST에서 희석)의 시리즈에서 배양을 통해 각각 5분 동안 탈수한다. 배아를 100% 메탄올로 5분 동안 옮기고 신선한 메탄올로 대체합니다. 배아를 -20°C에서 하룻밤 이상 보관하십시오.
- 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 순환 시스템 물(pH = 5.0)에서 20-40개의 제브라피시 배아를 1.5mL 튜브에 모아 특정 개발 기간에 도달합니다. 실온(RT)에서 갓 준비한 4% PFA 용액 1mL를 추가합니다.
- 수분 공급과 소화
- 100% 메탄올로 보존된 배아를 바닥에 나일론 메쉬로 체로 사용하여 12개의 웰 플레이트에서 배아를 순차적으로 세척하여 75%, 50%, 25% 메탄올(PBST에서 희석)을 각각 5분 동안 세척하였다. RT에서 각각 5 분 동안 PBST 3x로 배아를 씻으소서.
- 50 μL의 단백질분해제 K (10 mg/mL)를 배아와 함께 튜브에 넣고 RT의 표 2에서 소화 시간을 따릅니다.
- 단백질성 K를 제거하고 RT에서 각각 5분 동안 PBST 3x로 배아를 세척합니다.
- 프로브 혼성화 및 사후 고정
- 침전물이 용해될 때까지 각 유전자의 mRNA 서열에 따라 설계된 프로브를 40°C 하이브리디자틴 시스템에 넣고, ~10 분이 소요되어야한다. 예를 들어 (XM_007116.7)의 대상 프로브를 혼합하고 추가두 개의 중요한 유전자는 초기 중도내선 선조 형성에 관여 (여기, aplnr [NM_001075105.1] 및 nrp1a [NM_001040326.1]) 50:1:1 비율에서 1.5 mL 튜브.
- 배아가 있는 각 튜브에 50-100 μL의 혼합 표적 프로브를 넣고 40°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 사전 혼합 된 프로브는 40 °C로 미리 따뜻하게하고 사용하기 전에 RT로 냉각해야합니다. - 0.2x 식염수 구연산나트륨 용액을 Tween-20 (SSCT)으로 준비하십시오 : NaCl 175.3 g과 구연산나트륨 88 g을 dH2O의 1 L에 용해하여 20 x SSC 용액을 얻습니다. 이어서, 용액을 dH2O에서1:100 희석하여 0.2 x SSCT 용액을 얻었다. 0.2x SSCT 용액에서 트웬-20 1:1000희석.
- 재활용 프로브를 새 튜브로 옮김. RT에서 각각 15분 동안 배아를 0.2x SSCT 용액 3x로 세척합니다. 재활용 된 프로브는 5x-10x를 재사용할 수 있습니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 RT에서 30분 동안 배아를 고치도록 하십시오.
참고: Gross-Thebing 등의 작업은 10 분14의사후 고정 기간을 제안하지만 실제 금액은 그에 따라 조정해야합니다. 여기서, 우리는 10 분 후 고정 3 배를 테스트하고, DAB 죽음의 감도는 크게 영향을받습니다. 조사 후 0.5-1.0 h의 고정이 최적의 상태인지 확인하십시오(고정 기간이 짧을수록 대상 RNA에서 명확한 신호를 생성할 수 없으며, 적절한 고정 시간 연장은 신호를 강화하고 배경 잡음을 줄이는 데 도움이 됩니다).
- 순차 증폭기 및 라벨 프로브 혼성화
- SSCT 용액을 제거하고 50 μL의 Amp 1로 교체하십시오. 배아가 30 분 동안 40 °C에서 앰프 1에 정착할 수 있게 하십시오. 이어서, 배아를 RT에서 각각 15분 동안 0.2x SSCT 용액 3x로 세척한다.
- SSCT 용액을 제거하고 50 μL의 앰프 2를 추가합니다. 배아가 40°C에서 15분 동안 정착하도록 합니다. 이어서, 배아를 RT에서 각각 15분 동안 0.2x SSCT 용액 3x로 세척한다.
- SSCT 용액을 제거하고 앰프 3 의 50 μL을 추가하고 튜브를 약간 누릅니다. 이어서, 배아를 40°C에서 30분 동안 배양한다.
- SSCT 용액을 제거하고 앰프 4 방울 50 μL을 추가하고 조심스럽게 튜브를 누릅니다. 이어서, 배아를 40°C에서 15분 동안 배양한다.
- 역염색 및 현미경 검사법
- SSCT 용액을 제거하고 각 튜브에 50 μL의 DAPI를 추가합니다. 배아를 4°C에서 밤새 배양한다.
- PBST로 배아를 세척하고 PBST로 채워진 페트리 접시에 1% 낮은 융점 아가로스(LMP) 용액(dH2O의 100 mL에 용해된 LMP 1 g)을 사용하여 이미징을 준비한다.
- DAB 퍼옥시다아제 기판 키트를 사용하여 시편을 염색합니다. 컬러 시약 A, B 및 C(각각 50 μL)를 증류수 1mL에 넣고 잘 섞어 완전한 DAB 작동 유체를 얻습니다. 시편에 액체를 넣고 10분 동안 덮습니다.
- 얼룩이 진 후 PBST로 시편을 철저히 세척하십시오.
- 샘플을 이미징하기 위해 사진 기능이 있는 광학 현미경을 사용합니다.
참고: 나중에 이미지를 촬영하는 경우, 튜브는 알루미늄 호일에 싸서 4 °C에서 보관해야합니다.
2. 튜브 형성 분석
참고: eng 돌연변이체 및 야생형 ECs(대조군)는 HHT 환자로부터 유래된 iPSCs로부터 분화되었다(여기서, 22 세 부터 재발성 epistaxis를 가진 62 세 여성 환자, 위장 출혈, 폐 동맥 기형, 위치에 잘못된 eng 돌연변이를 들고 c.88T>C 의 2) 및 건강한 기증자 (eng 돌연변이없이), 이는 대학 윤리위원회의 승인을 통해 북경 연합 의과 대학 병원에 의해 제공되었다.
- 제어 및 HHT iPSC 세포 배양
- 지하 막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)의 특정 부피를 6개의 웰 세포 배양 플레이트에 첨가하여 웰의 바닥을 덮고 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 배양한다.
참고: 먼저 -20°C에 보관된 지하 멤브레인 매트릭스를 사용했을 때, 얼음 또는 서리가 없는 4°C 냉장고에 해동될 때까지 배양한다. 그런 다음 DMEM/F12에서 1:100에서 희석한 다음 희석제를 각각 100 μL을 함유하는 200 μL 튜브에 분배합니다. 튜브를 -20 °C에 보관하고 반복된 동결 및 해동을 피하십시오. 희석 된 지하 멤브레인 매트릭스를 추가 할 때 거품을 만들지 마십시오. 희석 된 지하 멤브레인 매트릭스를 추가 한 후, 고르게 바닥을 커버되도록 손으로 6 웰 플레이트를 부드럽게 흔들어. - 플레이트를 코팅 한 후, 웰에서 사용되는 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 제거합니다. 이어서, 각 웰에 2 mTeSR1 배지를 추가하고, 마지막 통로로부터 수확된 iPSCs를 웰당 약 1 x106에서 플레이트한다.
- 지하 막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)의 특정 부피를 6개의 웰 세포 배양 플레이트에 첨가하여 웰의 바닥을 덮고 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 배양한다.
- iPSC에서 EC 생성 및 확장
- 약 4일간의 iPSC 배양 후, 액티빈 A(25 ng/mL), BMP4(30 ng/mL), VEGF165(50 ng/mL), 및 CHIR99021(1.5 μM)으로 보충된 BEL 배지와 배양 배지를 교환합니다. 중혈세포를 생성하기 위해 3일 동안 세포를 성장시다.
- 2.2.1단계에서 기재된 배지를 VEGF(50 ng/mL) 및 SB431542(10 μM)로 보충하여 혈관 EC를 팽창시키기 위해 4일 동안 대체하였다. 세포를 동일한 배지와 배양하여 다른 3-4일 동안 치료한다.
- 성숙한 혈관 EC를 정화하기 위해 CD31-dynabeads를 사용하십시오: 인간 CD31 항체와 자기 구슬을 연결하는 CD31-dynabeads 키트의 지침을 참조하여 EC에 표현된 CD31 분자를 결합한 다음 용출 버퍼로 CD31 양성 세포를 수집합니다. VEGF165(30 ng/mL), bFGF(30 ng/mL), FBS(1%)를 함유하는 EC-SFM 배지에서 정제된 EC를 유지 및 확장합니다.
- 마트리겔 코팅 플레이트 및 현미경 검사법에 내피 세포를 도금
- 혈관 신생 판을 코팅하기 위해 잘 당 10 μL의 지하 막 매트릭스를 추가하고 (재료 표참조) 37 °C에서 30 분에서 배양하십시오.
- 내피 마커 CD31 및 VE-카데린을 면역형 광염색으로 확인한 후 내피 세포를 수확하고 반복적으로 파이펫팅하여 내피 성장 배지 2에서 이를 재중단시낸다. 고화 매트릭스에 잘 당 50 μL의 세포 현탁액 (2 x 105 세포 / mL)을 추가하고 37 °C에서 3-5 시간 동안 세포를 배양하십시오.
참고: 관 대형 실험 전에, 내피 마커는 기능성 내피 세포의 적절한 표현형을 확인하기 위해 확인되어야한다. 웰 당 1 x 104 셀은 튜브 형성에 이상적인 숫자입니다. 너무 많거나 너무 적은 세포는 관 대형에 도움이되지 않습니다. 접시의 측면에서 세포를 추가하고 지하 막 매트릭스를 만지지 마십시오. 고배율 필드의 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 확인하고 사진을 찍습니다.
- 튜브 형성의 정량적 결과
- 고해상도현미경으로 결과를 관찰하고 각 그룹에 대해 최소 10개의 영역을 사진으로 찍어 신뢰할 수 있는 데이터 통계를 얻을 수 있습니다.
- 내피 튜브 형성 검사: 전체 튜브 길이, 튜브 수 및 분기 점을 검사하여 튜브 형성 정도를 추정합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분기의 수와 길이를 평가하고 계산합니다.
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Representative Results
전체 마운트 인 시투 혼성화는 형광 공명 에너지 전달과 유사한 원리를 기반으로합니다. 그것은 제브라피쉬 ISH의 감도와 특이성을 모두 향상시키고 배경 신호에 영향을 주지 않고 표적 별 신호를 증폭하도록 설계되었습니다.
24 hpf 제브라피쉬 배아에서, 엔도글린은 후방 추기경 정맥(PCV), 분절간 혈관(ISV) 및 혈액섬3에서고도로 발현된다. 기존 염색체에서 염색 시간을 조절하기는 어렵고, 비양성 신호는 노른자낭(도1A)과같은 일부 지역에서 발생한다. 초기 혈관 발달에서 eng의 역할을 조사하기 위해, 혈강 내피마커(aplnra)뿐만아니라 다른 내피 전구마커(nrp1a)를사용하여 어떤 종류의 내피 내피가 eng 침묵(20)에의해 영향을 받았는지 조사하였다. 아플란및 nrp1a의 발현은 24hpf 배아에서 약했다. CISH에 비해, 두 유전자로부터의 약한 신호는 위시(WISH)에서 eng knockdown 후 꼬리 영역에서 명확하게 입증되었다(도1B). eng RNA의 녹다운은 HHT 동물 모델에서 내피 세포 마커 유전자 발현의 두 가지 유형의 감소된 발현을 일으켰다.
분화 된 iPSCs에 대한 실험을 수행하기 전에 세포를 EC로 식별하고 확인했습니다. 형태학적으로, 그들은 조약돌 모양으로 나타났다. 내피 세포 표면 분자 마커 CD31, CD146, VE-카데린 및 vWF의 발현은 IF 염색21로확인되었다. CD31을 이용한 자기-기반 절연 후, 기능성 분석은 하기 에 기재된 바와 같이 수행되었다.
여기서, 튜브 형성 분석은 eng 돌연변이체 및 대조군 iPSC 유래 내피 세포를 사용하여 수행하였다. 통계 분석은 튜브의 수, 가지 및 길이에 기초하여 수행되었다. 새로운 매개 변수는 또한 내피 세포의 관 형성을 반영하기 위하여, 혈관 신생의 이전 일3,점에 근거를 둔 소개되었습니다. 결국, eng 돌연변이 내피 세포는 대조군 내피 세포보다 더 적은 가지를 형성하고, eng 돌연변이 내피 세포에서 가지가 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 가진 자극 후에 현저하게 증가한다는 것을 것을을 발견하였다(도2A,B). eng에 있는 돌연변이는 불완전한 혈관 관 대형 귀착되었습니다.
그림 1: 내피 마커의 발현을 감소시켰습니다. (A)CISH 및 WISH는 24 hpf 배아(n> 30)에서 엔도글린의 발현을 결정하기 위해 수행되었다. 빨간색 상자는 확대된 영역을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm.(B) aplnra 및 nrp1a 발현을 24 hpf 제브라피쉬 배아에서 대조군-MO 및 eng-MO군에서 위시스로 발현한다. 빨간 화살표는 이 유전자의 발현이 현저하게 감소한 지구를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: eng 돌연변이체의 튜브 형성 및 대조군 iPSC-EC. (a)대조군을 포함하는 4개의 군에 의한 튜브 형성, 대조군+ VEGF(대조군+ VEGF(대조군 내피 세포 + 30 ng/mL VEGF), eng 돌연변이체(eng 돌연변이 내피 세포) 그룹, 및 eng 돌연변이체 +VEGF(eng 돌연변이 내피 세포 + 30 ng/mL VEGF) 군.eng eng 튜브 형성은 3 시간 스케일 바 = 100 μm.(B)튜브 형성의 정량적 결과를 나타내고 나서 평가및 촬영하였다. 적용 된 영역에서 분기의 수와 튜브의 길이는 이미지 J. 오류 막대에 의해 계산 된 세 개의 독립적 인 실험에서 평균 값의 SD를 나타냅니다. P 값은 *p&0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 배아 기간 | 고정 시간 |
| 4-셀 ~ 8 hpf | 4시간 |
| 8 hpf ~ 24 hpf | 1시간 |
| 24 hpf ~ 4 dpf | 약 30분 |
표 1: 다른 배아 단계에 필요한 고정 시간.
| 배아 기간 | 소화 시간 |
| 4-셀 ~ 8 hpf | 2분 |
| 8 hpf ~ 24 hpf | 5분 |
| 24 hpf ~ 4 dpf | 약 10분 |
표 2: 다른 배아 단계에 필요한 소화 시간.
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Discussion
이 프로토콜은 HHT 환자에서 유래된 iPSC-EC에 제브라피시 및 튜브 형성 분석을 위한 situ RNA 분석 플랫폼에서 개선된 전체 마운트를 적용했습니다. 전통적인 ISH 방법은 추가 실험 단계와 더 긴 실험 주기를 필요로한다. 프로토콜은 몇 가지 중요한 개선, 각각 WISH 분석 및 튜브 형성에 적용 된 HHT 환자에서 파생 된 독립적 인 이중 Z 프로브 및 iPSCs의 사용. 이러한 개선은 기존의 ISH에서 관찰되는 것과 비교하여 검출 감도를 향상시키는 데 매우 중요합니다. 유일하게 설계된 프로브 및 표적 신호 증폭은 드물게 발현되는 전사체의 검출을허용한다(aplnra는 24hpf 배아에서 제대로 발현되지 않는 유전자이다). 한 가지 수정은 프로브 혼성화 후의 추가 고정입니다. 추가 고정은 프로브와 전사체의 조합을 향상시킬 수 있습니다. DAB 염색은 또한 형광 염색보다는 적용되며, 특정 저풍부 유전자에서 형광 염색을 수행하기가 어렵다는 것이 밝혀졌기 때문이다. 그 때, iPSCs는 혈관신생 분석술을 위해 사용되었고, 이는 이 연구의 중요성과 클리닉 관련성을 증가시킨다. iPSCs의 생성은 엄격한 배양 조건을 필요로 하며 프로토콜의 한계를 나타낸다.
몇 가지 중요한 단계를 강조 표시해야 합니다. WISH 분석에서, 제브라피시 배아의 소화 시간은 텍스트에 따라 엄격하게 따라야한다. 소화 시간이 짧을수록 프로브가 전사체와 성공적으로 결합될 수 있습니다. 대조적으로, 연장된 소화 시간은 배아의 무결성을 파괴할 것입니다. 관 형성 실험에서, 화상 진찰 타이밍은 잘 통제되어야 합니다. 일반적으로, 내피 세포는 12 시간 안에 관이 될 것입니다 그러나 관 구조는 24 시간 후에 붕괴하는 경향이 있습니다. 세포 수는 너무 높거나 너무 낮은 세포 밀도가 실패한 관 형성으로 이끌어 낼 수 있기 때문에, 관 대형을 위해 또한 중요합니다. 내피 세포가 튜브를 형성하도록 유도하기 어려운 경우, 관형 구조를 형성하는 ECs의 능력을 시험하기 위한 양성 대조군으로서 배양 배지에 VEGF와 같은 성장 인자를 추가하는 것이 도움이 된다.
요약하자면, 개선된 WISH 방법은 실험실 워크플로우에 유리한 기술로 간주되었다. 최근, 우리의 연구 그룹은 임상 샘플에서이 분석 실험을 시작했다. 전통적인 방법에서 관찰된 것보다 더 높은 감도 및 더 효율적인 검출을 고려한, 이 향상된 WISH 방법은 RNA 기지를 둔 분자 진단22를개발하고 실행하기 위한 중요한 약속을 보유합니다.
환자 iPSC-EC를 사용하여 튜브 형성 분석의 성능은 eng 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 다형성에서 질병 일으키는 돌연변이의 확인 뿐만 아니라 동물 연구 결과에서 결과의 확인을 허용합니다. 이러한 방법의 조합은 혈관 형성에서 eng의 역할을 명확히 하고 심혈관 세포 치료를 위한 환자 iPSC-ECs의 유전자 보정에서 잠재력을보유한다 23.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 줄기 세포 및 번역 연구의 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금에 의해 지원되었다 [보조금 번호 2016YFA0102300 (준 양에)];중국의 자연 과학 재단 [보조금 번호 81870051, 81670054 (준 양)]; 의학을 위한 CAMS 혁신 기금 (CIFMS) [보조금 번호 2016-I2M-4-003 (준 양에)]; PUMC 청소년 발견 및 중앙 대학에 대한 기본 연구 기금 [보조금 번호 2017310013 (팡 저우에)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
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