Summary
Presentert her er en protokoll for hel-mount in situ RNA hybridisering analyse i sebrafisk og rør formasjon analyse i pasient-avledet indusert pluripotent stamcelle-avledede endotelceller å studere rollen som endoglin i vaskulær formasjon.
Abstract
Vaskulær utvikling bestemmes av det sekvensielle uttrykket av spesifikke gener, som kan studeres ved å utføre in situ hybridiseringsanalyser i sebrafisk under ulike utviklingsstadier. For å undersøke rollen som endoglin(eng) i skipsdannelse under utviklingen av arvelig hemorragisk telangiectasia (HHT), brukes morpholino-mediert målrettet knockdown av eng i sebrafisk til å studere sitt temporale uttrykk og tilhørende funksjoner. Her er helmontert in situ RNA hybridisering (WISH) ansatt for analyse av eng og dets nedstrøms gener i sebrafiskembryoer. Også rørdannelsesanalyser utføres i HHT pasientavledede indusert pluripotent stamcelledifferensierte endotelceller (iPSC-ECer; med eng mutasjoner). Et spesifikt signalforsterkende system ved hjelp av hele beløpet In Situ Hybridization – WISH gir høyere oppløsning og lavere bakgrunnsresultater sammenlignet med tradisjonelle metoder. For å få et bedre signal, justeres etterløsningstiden til 30 minutter etter sondehybridisering. Fordi fluorescensfarging ikke er følsom i sebrafiskembryoer, erstattes den med diaminobezidin (DAB) farging her. I denne protokollen differensieres HHT pasientavledede iPSC-linjer som inneholder en eng-mutasjon, til endotelceller. Etter å ha dekket en plate med kjellermembranmatrise i 30 min ved 37 °C, seedes iPSC-ECer som monolager i brønner og oppbevares ved 37 °C i 3 timer. Deretter beregnes rørlengden og antall grener ved hjelp av mikroskopiske bilder. Dermed, med denne forbedrede WISH-protokollen, er det vist at redusert eng-uttrykk påvirker endotelstamdannelse i sebrafiskembryoer. Dette bekreftes videre av rørdannelsesanalyser ved hjelp av iPSC-ECer avledet fra en pasient med HHT. Disse analysene bekrefter rollen for eng i tidlig vaskulær utvikling.
Introduction
En enkelt mutasjon på eng (CD105) er rapportert hos pasienter med HHT. Mutasjonen fører til økt EF-spredning og redusert strømningsmediert EC-forlengelse1,,2. Det har også tidligere blitt rapportert at ENG-mangel reduserer endotelmarkører uttrykk (dvs. kdrl, cdh5, hey2) i sebrafisk3. Endoglin, hovedsakelig uttrykt i endotelceller, er en transmembrane glykoprotein og fungerer som en co-reseptor for å transformere vekstfaktor β (TGF-β) familiemedlemmer. Det leder BMP9 binding på celleoverflaten for å regulere nedstrøms genet, inkludert Id1 uttrykk, å indusere stamcelle differensiering mot ECs4. Dermed spiller eng genet viktige roller i vaskuogenese og menneskelig vaskulær sykdom5,6. Vi har tidligere undersøkt effekten av endoglin knockdown på fartøydannelse i sebrafisk embryoer, etterfulgt av analyse av iPSCs-avledet ECs ervervet fra en HHT pasient bærer en eng mutasjon7. Denne protokollen viser effekten av ENG-mangel på endotelstammarkøruttrykk og rørdannelse, som er en kvantifiserbar metode for måling av in vitro angiogenese.
For å studere eng romlig og timelig uttrykk, er WISH ansatt for å oppdage genuttrykk in vivo8. In situ hybridization (ISH) er en metode for å bruke merkede sonder med komplement sekvenser av målkjernesyrer (DNA eller mRNA) for å oppdage og visualisere målkjernesyre hybrider i en fast prøve. Prosessen forsterker genuttrykkssignaler in vivo og brukes til å oppdage uttrykket av gener ved mikroskopi. WISH har vært mye brukt i ulike modell dyr, spesielt i sebrafisk9. Det brukes også til å skaffe følgende data: 1) gen romlige / temporale uttrykksmønstre, som gir informasjon om genfunksjon og klassifisering; og 2) spesielt uttrykte genmarkører som brukes i høygjennomstrømning narkotika eller mutant screening10.
Kromogene sonder er lett degradert med tradisjonelle kromosom in situ hybridization (CISH), noe som resulterer i høy bakgrunnsstøy og uspesifikke signaler11,12. WISH-metoden bruker to uavhengige doble Z-sonder, som er designet for å hybridisere for å målrette RNA-sekvenser. Hver sonde inneholder en 18-25 sekvens komplementær til målet RNA og en 14 base tail sekvens (konseptualisert som Z). Målsondene brukes i et par (dobbel Z). De to halesekvensene danner sammen et 28-base hybridiseringssted for foramplifieren, som inneholder 20 bindingssteder for forsterkeren. Forsterkeren inneholder i sin tur 20 bindingssteder for etikettsonden og kan teoretisk gi opptil 8000 etiketter for hver mål RNA-sekvens.
Denne avanserte teknologien forenkler samtidig signalforsterkning og bakgrunnsundertrykkelse for å oppnå visualisering med ett molekyl samtidig som vevmorfologienbevares 13. Ytterligere endring av WISH-metodene er basert på tidligere forskning14, inkludert ekstra fiksering og DAB-farging. Forutsatt her er en forbedret WISH-protokoll som kan fungere selv om målet RNA er delvis redusert eller degradert. Fordeler inkluderer at det kan fullføres i 24 timer uten RNase-frie forhold. Signaler kan også oppdages samtidig gjennom flere kanaler fra flere mål, og resultatene er konsistente og kompatible med resultater fra forskjellige automatiseringsplattformer med høy gjennomstrømning.
Resultater fra dyremodeller gjenspeiler ikke det samme fenomenet som oppstår hos mennesker. ENG inneholder to par bevarte cysteiner, C30-C207 og C53-C182, som danner disulfidbroer i foreldreløse områder. For ytterligere å studere rollen som eng hos HHT-pasienter, har rørdannelsesanalyser med iPSCer avledet fra HHT-pasienter blitt utført i celler uten/med eng-mutasjoner (Cys30Arg, C30R)15. Etter at Kubota et al. først rapporterte rørdannelseseksperimentet16,er analysen utviklet på flere måter. Det har blitt brukt til å identifisere angiogene eller antiangiogene faktorer, definere signalveiene i angiogenese, og identifisere gener som regulerer angiogenese17.
Før tilgjengeligheten av pasientavledede iPSC-ECer, brukte forskere primært kultiverte ECer til å studere angiogensis16. Men for endotelceller er det en teknisk utfordring å transduce eksogene gener med et virus, på grunn av det begrensede passasjenummeret som ECer kan gjennomgå. Dette er fordi det er knapt nok cellulært materiale til å bli samlet inn fra menneskelige fartøy enten fra kirurgi eller matchet godkjente givere. Med oppfinnelsen av iPSC generasjon teknikk av Shinya Yamanaka, menneskelige ECer avledet fra iPSCs kan brukes pålitelig i in vitro eksperimenter, som rapportert tidligere18.
Ved hjelp av viralt transduserte ECer med begrenset antall og passasjer kan være tilstrekkelig for signalstudier, men for funksjonelle studier er det bedre å generere muterte pluripotente stamcellelinjer (enten iPSCer eller CRISPER / Cas9-målrettede hESCer), og deretter skille dem inn i ECer for angiogenesestudier som bruker rørdannelsesanalyser19. Rørdannelse kan brukes til å evaluere funksjonen til endotelceller som bærer mutasjoner. Denne protokollen beskriver også rørdannelse på en μ-slide angiogenese plate, som er en enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar metode.
Protokollen nedenfor gir en pålitelig og systemisk metode for å studere rollen som spesifikke gener i vaskulær formasjon, sammen med detaljer for in vivo uttrykksmønster og in vitro funksjonell kvantifisering for modellering av menneskelig sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk som ble beskrevet ble godkjent av Forskningsetikkkomiteen ved Zhejiang University school of Medicine.
1. Helmontering in situ hybridisering
- Sebrafisk linje husdyrhold og reproduksjon
- Fôr og hev alle voksne sebrafisk ved 26-28 °C i et resirkulerende akvakultursystem med 14 t lys/10 t mørk syklus for hver dag. Bruk AB (wild-type) sebrafisk linjer for følgende prosedyrer.
- Legg et lag småstein i bunnen av avlsboksen som et ly for egg. Gruppe foreldrefisk i forholdet 2:1 (dvs. to kvinner og en mann) i hver boks. La den kvinnelige fisken gyte i 1 dag. På slutten av gyting, fjern foreldrefisken umiddelbart for å hindre dem i å spise eggene.
- Injiser 2 ng av morfopoer og 500 pg av mRNA i encellede stadium embryoer ved hjelp av Femto Jet injeksjonssystem under et mikroskop (endoglin-MOs sekvens: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-mispair kontroll MOs sekvens: 5'-AAACAGACACCTCTTCATCTCTC-3').
- Inkuber zygotene i surt sjøvann ved 27 °C i ca. 48 timer.
- Innsamling og fiksering av sebrafiskembryoer
- Bruk en plastoverføring pipette for å samle 20-40 sebrafisk embryoer fra det sirkulerende systemet vann (pH = 5,0) i en 1,5 ml rør når de er desimert og nå en bestemt periode med utvikling. Tilsett 1 ml nylaget 4% PFA-løsning ved romtemperatur (RT).
MERK: Perioden der det valgte embryoet er basert på formålet med eksperimentet. Tabell 1 viser fikseringstiden som kreves for ulike embryonale perioder. - Fjern fikseringsløsningen, vask embryoer med fosfatbufret oppløsning med Tween-20 (PBST, fortynn 1 ml Tween til 1000 ml PBS-oppløsning) 3x i 5 min hver ved RT.
- Dehydrere embryoene gjennom inkubasjon i en serie på 25%, 50% og 75% metanol (fortynnet i PBST) i 5 min hver. Overfør embryoer til 100% metanol i 5 min og erstatt med frisk metanol. Oppbevar embryoene ved -20 °C over natten eller lenger.
- Bruk en plastoverføring pipette for å samle 20-40 sebrafisk embryoer fra det sirkulerende systemet vann (pH = 5,0) i en 1,5 ml rør når de er desimert og nå en bestemt periode med utvikling. Tilsett 1 ml nylaget 4% PFA-løsning ved romtemperatur (RT).
- Hydrering og fordøyelse
- Hydrat embryoer som ble bevart i 100% metanol ved hjelp av en sil med nylon mesh nederst for å sekvensielt vaske embryoer i brønnene på 12 brønnplater med en serie på 75%, 50%, og 25% metanol (fortynnet i PBST) i 5 min hver. Vask embryoene med PBST 3x i 5 min hver ved RT.
- Tilsett 50 μL proteinase K (10 mg/ml) i røret med embryoer og følg fordøyelsestiden i tabell 2 ved RT.
- Fjern proteinase K og vask embryoer med PBST 3x i 5 min hver ved RT.
- Probe hybridisering og etterfiksering
- Sett sondene som er utformet i henhold til hvert gens mRNA-sekvenser i et 40 °C hybridizatin-system til bunnfallet er oppløst, som bør ta ~ 10 min. Bland målsonder av f.eks (XM_007116,7) og ytterligere to viktige gener involverer i tidlig mesoderm endotheial stamcelledannelse (her, aplnr [NM_001075105.1] og nrp1a [NM_001040326.1]) i et 1,5 ml rør ved et 50:1:1-forhold.
- Tilsett 50-100 μL blandede målsonder i hvert rør med embryoer, og inkul over natten ved 40 °C.
MERK: Forhåndsblandede prober må forvarmes til 40 °C og avkjøles til RT før bruk. - Forbered en 0,2x saltvannssitratoppløsning med Tween-20 (SSCT): oppløs 175,3 g NaCl og 88 g natriumsitrat i 1 L dH2O for å oppnå en 20x SSC-oppløsning. Deretter fortynner du løsningen 1:100 i dH2O for å få en 0,2 x SSCT-løsning. Fortynn Tween-20 1:1000 i 0,2x SSCT-løsningen.
- Overfør de resirkulerte sondene til et nytt rør. Vask embryoene i 0,2x SSCT-oppløsning 3x i 15 min hver ved RT. De resirkulerte sondene kan brukes på nytt 5x-10x.
- Bruk 4% paraformaldehyd (PFA) for å fikse embryoene i 30 min ved RT. Vask embryoene i 0,2x SSCT-oppløsning 3x i 15 min hver ved RT.
MERK: Arbeidet med Gross-Thebing et al. antyder en post-fikseringsperiode på 10 min14, men det faktiske beløpet må justeres tilsvarende. Her testet vi 10 min post-fiksering 3x, og følsomheten til DAB døende er betydelig påvirket. Etter undersøkelser, sørg for at 0,5-1,0 h fiksering er den optimale tilstanden (en kortere fikseringsperiode kan ikke gi et klart signal fra målet RNA, og riktig forlengelse av fikseringstiden bidrar til å styrke signalet og gi mindre bakgrunnsstøy).
- Sekvensiell forsterker og etikettsonde hybridisering
- Fjern SSCT-oppløsningen og erstatt med 50 μL amp 1. La embryoene bosette seg i Amp 1 ved 40 °C i 30 min. Deretter vasker du embryoene i 0,2x SSCT-oppløsning 3x i 15 min hver ved RT.
- Fjern SSCT-oppløsningen og tilsett 50 μL amp 2. La embryoene bosette seg ved 40 °C i 15 min. Deretter vasker du embryoene i 0,2x SSCT-oppløsning 3x i 15 min hver ved RT.
- Fjern SSCT-oppløsningen, tilsett 50 μL Amp 3 og trykk på røret mildt. Deretter inkuber embryoene ved 40 °C i 30 min. Vask embryoene i 0,2x SSCT-oppløsning 3x i 15 min hver ved RT.
- Fjern SSCT-oppløsningen, tilsett 50 μL amp 4-dråpe, og trykk forsiktig på røret. Deretter inkuberer embryoene ved 40 °C i 15 min. Vask embryoene i 0,2x SSCT 3x i 15 min hver ved RT.
- Motståelse og mikroskopi
- Fjern SSCT-oppløsningen og tilsett 50 μL DAPI i hvert rør. Inkuber embryoene over natten ved 4 °C.
- Vask embryoene med PBST og klargjør dem for avbildning ved hjelp av en 1% lav smeltepunkt agarose (LMP) løsning (1 g LMP oppløst i 100 ml dH2O) i en petriskål fylt med PBST.
- Bruk et DAB peroxidase substratsett til å farge prøven. Tilsett fargereagenser A, B og C (50 μL hver) til 1 ml destillert vann og bland godt for å oppnå en komplett DAB arbeidsvæske. Tilsett væsken til prøven og dekk i 10 min.
- Vask prøven grundig med PBST etter farging.
- Bruk et optisk mikroskop med en fotografisk funksjon for å forestille prøvene.
MERK: Hvis du tar bilder senere, bør rørene pakkes inn i aluminiumsfolie og lagres ved 4 °C.
2. Tube formasjonsanalyse
MERK: Eng muterte og wildtype ECer (kontroll) ble differensiert fra iPSCer avledet fra en HHT-pasient (her, en 62 år gammel kvinnelig pasient med tilbakevendende epistaxis siden 22 år gammel, gastrointestinal blødning, lungearteriovenøse misformasjoner, bærer en missense eng mutasjon i posisjon c.88T> C av exon 2) og en sunn donor (uten eng mutasjon), som ble levert av Peking Union Medical College Hospital med godkjenning fra college forskning etikk komiteen.
- Kontroll og HHT iPSC cellekulturer
- Tilsett et visst volum av kjellermembranmatrise (f.eks. Matrigel) til en 6 brønncellekulturplate for å dekke bunnen av brønnen og inkuber platene i 1 timer ved 37 °C.
MERK: Ved første gangs bruk av kjellermembranmatrisen lagret ved -20 °C, inkuber på is eller i et frostfritt 4 °C kjøleskap til det tines. Deretter fortynnes ved 1:100 i DMEM/ F12, og deretter distribuere fortynningsmiddelet i 200 μL rør som inneholder 100 μL hver. Oppbevar rørene ved -20 °C og unngå gjentatt frysing og tining. Når du legger til den fortynnede kjellermembranmatrisen, ikke lag bobler. Etter å ha lagt til den fortynnede kjellermembranmatrisen, rist 6-brønnplaten forsiktig for hånd slik at den jevnt dekker bunnen. - Etter belegg platen, fjern den brukte kjelleren membran matrise løsning fra brønnene. Deretter legger du til 2 ml ml mTeSR1-medium i hver brønn, og plate iPSC høstet fra den siste passasjen på ca 1 x 106 per brønn.
- Tilsett et visst volum av kjellermembranmatrise (f.eks. Matrigel) til en 6 brønncellekulturplate for å dekke bunnen av brønnen og inkuber platene i 1 timer ved 37 °C.
- Generering og utvidelse av ECer fra iPSCer
- Etter ca. 4 dager med iPSC-kultur utveksler du kulturmediet med BEL-medium supplert med aktivisering A (25 ng/ml), BMP4 (30 ng/ml), VEGF165 (50 ng/ml) og CHIR99021 (1,5 μM). Vokse cellene i 3 dager for å generere mesoderm celler.
- Bytt ut mediet som er beskrevet i trinn 2.2.1 med BEL medium supplert med VEGF (50 ng/ml) og SB431542 (10 μM) i 4 dager for å utvide vaskulære ECer. Behandle cellene med samme medium og kultur i ytterligere 3-4 dager.
- Bruk CD31-dynabeads for å rense de modne vaskulære ECer: se instruksjonene i CD31-dynabeads kit, som forbinder menneskelig CD31 antistoff med magnetiske perler for å kombinere CD31 molekyler uttrykt på ECer, og samle deretter CD31-positive celler ved elution buffer. Vedlikehold og utvid de rensede ECene i EC-SFM-medium som inneholder VEGF165 (30 ng/ml), bFGF (30 ng/ml) og FBS (1 %).
- Plating endotelceller på Matrigel-belagte plater og mikroskopi
- Tilsett 10 μL kjellermembranmatrise per brønn for å belegge angiogeneseplatene (se materialbordet)og inkuber ved 30 min ved 37 °C.
- Høste endotelceller etter kontroll av endotelmarkører CD31 og VE-kadherin med immunofluorescensfarging og resuspend dem i endotelvekst medium 2 ved pipettering gjentatte ganger. Tilsett 50 μL celleoppheng (2 x10 5 celler/ml) per brønn på den størknede matrisen og inkuber cellene i 3-5 timer ved 37 °C.
MERK: Før rørdannelseseksperimentet bør endotelmarkører kontrolleres for å sikre riktig fenotype av funksjonelle endotelceller. 1 x 104 celle per brønn er et ideelt tall for rørdannelse. For mange eller for få celler bidrar ikke til rørdannelse. Legg til celler fra siden av parabolen og ikke rør kjellermembranmatrisen. Bruk lysmikroskop i høyt forstørrelsesfelt for å sjekke cellene og ta bilder.
- Kvantitative resultater av rørdannelse
- Følg resultatene med et mikroskop med høy oppløsning og ta bilder av minst 10 områder for hver gruppe for å få pålitelig datastatistikk.
- Undersøk endotelrørdannelse: estimer omfanget av rørdannelse ved å inspisere den totale rørlengden, rørnummeret og grenspunktene. Vurder og telle antall og lengde på grener ved hjelp av ImageJ-programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele mount in situ hybridization er basert på et prinsipp som ligner på fluorescens resonans energioverføring. Den er designet for å forbedre både følsomhet og spesifisitet i sebrafisk ISH samt forsterke målspesifikke signaler uten å påvirke bakgrunnssignalet.
I 24 hpf sebrafisk embryoer, er endoglin sterkt uttrykt i den bakre kardinal vene (PCV), intersegmentale fartøy (ISVs), og blod øyer3. Det er vanskelig å kontrollere fargingstiden i tradisjonell kromogen in situ hybridisering (CISH), med ikke-positive signaler som forekommer i enkelte regioner, for eksempel eggeplommesekken (figur 1A). For å undersøke rollen som eng i tidlig vaskulær utvikling, ble en hemogen endotelmarkør brukt (aplnra) samt en annen endotelstammarkør (nrp1a) for å undersøke hvilken type endotel som ble påvirket av eng-deaktivering 20. Uttrykket av aplnra og nrp1a var svakt i 24 hpf embryoer. Sammenlignet med CISH ble det svake signalet fra de to genene tydelig demonstrert i haleregionen etter eng knockdown i WISH (figur 1B). Knockdown av eng RNA forårsaket redusert uttrykk for to typer endotelceller markør gener uttrykk i en HHT dyremodell.
Før eksperimenter på differensierte iPSCer ble cellene identifisert og bekreftet som ECer. Morfologisk, de dukket opp som brostein form. Uttrykk for endotelcelleoverflatemolekylære markører CD31, CD146, VE-kadherin og vWF ble bekreftet med IF farging21. Etter magnetisk isolasjon ved hjelp av CD31 ble den funksjonelle analysen utført som beskrevet nedenfor.
Her ble rørdannelsesanalysen utført ved hjelp av eng-muterte og kontroll iPSC-avledede endotelceller. Statistisk analyse ble utført basert på antall, grener og lengder av rør. En ny parameter ble også introdusert basert på tidligere arbeid3, punkter av angiogenese, for å reflektere rørdannelse av endotelceller. Til slutt ble det funnet at eng muterte endotelceller dannet færre grener enn kontroll endotelceller, og at grener i eng muterte endotelceller betydelig økt etter stimulering med vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) (Figur 2A, B). Mutasjonen i eng resulterte i defekt fartøyrørdannelse.
Figur 1: Endoglin knockdown reduserte uttrykket av endotelmarkører. (A) CISH og WISH ble utført for å bestemme uttrykket av endoglin i 24 hpf embryoer (n > 30). Den røde boksen representerer det utvidede området. Skala barer = 200 μm. (B) aplnra og nrp1a uttrykk av WISH i 24 hpf sebrafisk embryoer av kontroll-MO og eng-MO gruppe. Den røde pilen indikerer regioner der uttrykket av disse genene ble betydelig redusert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Rørdannelse av eng mutert og kontroller iPSC-ECer. (A) Rørdannelsen av de fire gruppene, inkludert kontrollgruppen, kontrollen + VEGF (kontroll endotelceller + 30 ng/ml VEGF), eng mutant (eng muterte endotelceller) gruppe, og eng mutant + VEGF (eng mutant endotelceller + 30 ng / ml VEGF) gruppe. Rørdannelse ble vurdert og fotografert etter 3 h. Skalastenger = 100 μm. (B) Kvantitative resultater av rørdannelse er vist. På det dekkede området ble antall grener og deres lengde på rør beregnet av bilde J. Feillinjer representerer SD for gjennomsnittsverdiene fra tre uavhengige eksperimenter. En verdi p ble ansett som statistisk signifikant når *p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Embryonisk periode | Fikseringstid |
| 4-celler til 8 hkf | 4 timer |
| 8 hkf til 24 hkf | 1 timer |
| 24 hkf til 4 dpf | 30 minutter |
Tabell 1: Fikseringstid som kreves for ulike embryonale stadier.
| Embryonisk periode | Fordøyelsestid |
| 4-celler til 8 hkf | 2 minutter |
| 8 hkf til 24 hkf | 5 minutter |
| 24 hkf til 4 dpf | 10 minutter |
Tabell 2: Fordøyelsestid som kreves for ulike embryonale stadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen brukte en forbedret helmontert in situ RNA-analyseplattform for sebrafisk- og rørdannelsesanalyser på iPSC-ECer avledet fra en HHT-pasient. Den tradisjonelle ISH-metoden krever en lengre eksperimentell syklus med ekstra eksperimentelle trinn. Protokollen har noen viktige forbedringer, bruk av uavhengige doble Z-sonder og iPSCer avledet fra en pasient med HHT som ble brukt i WISH-analyser og rørdannelse, henholdsvis. Disse forbedringene er avgjørende for å forbedre deteksjonsfølsomheten sammenlignet med det som observeres med tradisjonell ISH. De unikt utformede sondene og målsignalforsterkningen gjør det mulig å påvise sjelden uttrykte transkripsjoner (aplnra er et dårlig uttrykt gen i 24 hpf embryoer). En modifikasjon er den ekstra fikseringen etter sondehybridisering. Den ekstra fikseringen kan forbedre kombinasjonen av sonder og transkripsjoner. DAB farging er også brukt i stedet for fluorescens farging, fordi det ble funnet at det var vanskelig å utføre fluorescens farging i visse lavoverflodgener. Deretter ble iPSCer brukt til angiogeneseanalyser, noe som øker betydningen og klinikkens relevans for dette arbeidet. Generasjon av iPSCer krever strenge kulturforhold og representerer en begrensning av protokollen.
Noen kritiske trinn må være uthevet. I WISH-analyse bør fordøyelsestiden til sebrafiskembryoer følges i henhold til teksten. En kortere fordøyelsestid kan ikke garantere at sonden kombineres med transkripsjoner med hell. I motsetning vil utvidet fordøyelsestid ødelegge integriteten til embryoer. I rørformasjonseksperimentene bør bildebehandlingstidspunktet være godt kontrollert. Vanligvis vil endotelcellene bli rør innen 12 timer, men den rørformede strukturen har en tendens til å gå i oppløsning etter 24 timer. Cellenummeret er også viktig for rørdannelse, da en celletetthet som er for høy eller for lav, kan føre til mislykket rørdannelse. Hvis det er vanskelig å indusere endotelceller for å danne rør, er det nyttig å inkludere å legge til vekstfaktorer som VEGF til kulturmediet som en positiv kontroll for å teste ECs evne til å danne rør.
Oppsummert har den forbedrede WISH-metoden blitt ansett som en fordelaktig teknikk for laboratoriearbeidsflyter. Nylig har vår forskningsgruppe begynt å teste denne analysen i kliniske prøver. Tatt i betraktning høyere følsomhet og mer effektiv deteksjon enn observert i tradisjonelle metoder, har denne forbedrede WISH-metoden betydelig løfte om utvikling og implementering av RNA-basert molekylær diagnostikk22.
Ytelse av rørdannelsesanalyse ved hjelp av pasient iPSC-ECer tillater bekreftelse av resultater fra dyrestudier samt identifisering av sykdomsfremkallende mutasjoner fra enkelt nukleotidpolymorfisme i eng genet. Kombinasjonen av disse metodene klargjør rollen som eng i vaskulær dannelse og holder potensial i genkorreksjon av pasient iPSC-ECer for kardiovaskulær celleterapi23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key Research and Development Program of China-stem celle og translasjonell forskning [tilskuddsnummer 2016YFA0102300 (til Jun Yang)];Nature Science Foundation of China [tilskuddsnummer 81870051, 81670054 (til Jun Yang)]; CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [tilskuddsnummer 2016-I2M-4-003 (til Jun Yang)]; PUMC Youth Found og Fundamental Research Funds for de sentrale universitetene [tilskuddsnummer 2017310013 (til Fang Zhou)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
