Summary
Presenteras här är ett protokoll för hela montera in situ RNA hybridisering analys i zebrafish och rör bildning analys i patient-härledda inducerad pluripotenta stamceller-härledda endotelceller att studera rollen av endoglin i vaskulär bildning.
Abstract
Vaskulär utveckling bestäms av det sekventiella uttrycket av specifika gener, som kan studeras genom att utföra in situ hybridiseringsanalyser i zebrafiskar under olika utvecklingsstadier. För att undersöka rollen av endoglin (eng) i fartygsbildning under utvecklingen av ärftlig hemorragisk telangiectasia (HHT), används morpholino-medierad riktad knockdown av eng i zebrafiskar för att studera dess temporala uttryck och associerade funktioner. Här används helmonterad in situ RNA-hybridisering (WISH) för analys av eng och dess nedströmsgener i zebrafiskembryon. Dessutom utförs rörbildningsanalyser i HHT patient-härledda inducerad pluripotenta stamceller differentierade endotelceller (iPSC-ECs; med eng mutationer). Ett specifikt signalförstärkningssystem med hela beloppet In Situ Hybridization – WISH ger högre upplösning och lägre bakgrundsresultat jämfört med traditionella metoder. För att få en bättre signal justeras efterfixeringstiden till 30 minuter efter sondhybritisering. Eftersom fluorescensfärgning inte är känslig i zebrafiskembryon ersätts den med diaminobezidin (DAB) färgning här. I detta protokoll, HHT patient-härledda iPSC linjer som innehåller en eng mutation differentieras till endotelceller. Efter beläggning av en platta med källarmembranmatris i 30 min vid 37 °C, sådds iPSC-ECs som en monolager i brunnar och hålls vid 37 °C i 3 timmar. Sedan beräknas rörets längd och antal grenar med hjälp av mikroskopiska bilder. Således, med denna förbättrade WISH protokoll, det visas att minskad eng uttryck påverkar endotel stamfader bildning i zebrafisk embryon. Detta bekräftas ytterligare av rörbildningsanalyser med hjälp av iPSC-ECs som härrör från en patient med HHT. Dessa analyser bekräftar rollen för eng i tidig vaskulär utveckling.
Introduction
En enda mutation på eng (CD105) har rapporterats hos patienter med HHT. Mutationen leder till ökad EG-spridning och minskad flödesmedierad EG-förlängning1,,2. Det har också tidigare rapporterats att ENG-brist minskar endotel markörer uttryck (dvs kdrl, cdh5, hey2) i zebrafish3. Endoglin, främst uttryckt i endotelceller, är ett transmembrane glykoprotein och fungerar som en co-receptor för att omvandla tillväxtfaktor β (TGF-β) familjemedlemmar. Det riktar BMP9 bindning på cellytan för att reglera nedströms gen, inklusive Id1 uttryck, att inducera stamceller differentiering mot ECs4. Således spelar eng genen viktiga roller i vaskulogenes och mänskliga kärlsjukdom5,6. Vi har tidigare undersökt effekterna av endoglin knockdown på fartygsbildning i zebrafisk embryon, följt av analys av iPSCs-härledda ECs förvärvats från en HHT patient med en eng mutation7. Detta protokoll visar effekterna av ENG brist på endotel stamfader markör uttryck och rör bildning, som är en kvantifierbar metod för att mäta in vitro angiogenes.
För att studera eng rumsliga och tidsmässiga uttryck, är WISH används för att upptäcka genuttryck in vivo8. In situ hybridisering (ISH) är en metod för att använda märkta sonder med komplementsekvenser av mål nukleinsyror (DNA eller mRNA) för att upptäcka och visualisera mål nukleinsyrhybrider i ett fast exemplar. Processen förstärker genuttryckssignaler in vivo och används för att detektera genernas uttryck genom mikroskopi. WISH har använts i stor utsträckning i olika modelldjur, särskilt i zebrafisk9. Det används också för att förvärva följande data: 1) gen spatial /temporal uttryck mönster, som ger information om genfunktion och klassificering; och 2) specifikt uttryckta genmarkörer som används vid hög genomströmningsläkemedel eller mutantscreening10.
Kromogena sonder bryts lätt ned med traditionell kromosom in situ-hybridisering (CISH), vilket resulterar i högt bakgrundsljud och ospecificerad signaler11,12. WISH-metoden använder två oberoende dubbla Z-sonder, som är utformade för att hybridisera för att rikta RNA-sekvenser. Varje sond innehåller en 18-25 sekvens som kompletterar mål-RNA och en 14-bassvansekvens (konceptualiserad som Z). Målsonderna används i ett par (dubbla Z). De två svanssekvenserna bildar tillsammans en 28-bashybridiseringsplats för förförstärkaren, som innehåller 20 bindningsställen för förstärkaren. Förstärkaren innehåller i sin tur 20 bindningsställen för etikettsonden och kan teoretiskt ge upp till 8 000 etiketter för varje mål-RNA-sekvens.
Denna avancerade teknik underlättar samtidig signalförstärkning och bakgrundsdämpning för att uppnå single-molekyl visualisering samtidigt som vävnad morfologi13. Ytterligare modifiering av WISH-metoderna baseras på tidigare forskning14, inklusive extra fixering och DAB-färgning. Finns här är ett förbättrat WISH-protokoll som kan fungera även om mål-RNA delvis minskas eller försämras. Fördelarna inkluderar att det kan slutföras i 24 h utan RNase-fria förhållanden. Signaler kan också samtidigt upptäckas via flera kanaler från flera mål, och resultaten är konsekventa och kompatibla med resultat från olika automatiseringsplattformar med hög genomströmning.
Resultat från djurmodeller återspeglar inte samma fenomen som förekommer hos människor. ENG innehåller två par bevarade cysteiner, C30-C207 och C53-C182, som bildar disulfid broar i föräldralösa regioner. För att ytterligare studera rollen som eng hos HHT-patienter har rörbildningsanalyser med iPSC-patienter som härrör från HHT-patienter utförts i celler utan/med engmutationer (Cys30Arg, C30R)15. Efter Kubota et al. först rapporterade röret bildandet experiment16, analysen har utvecklats på flera sätt. Det har använts för att identifiera angiogena eller antiangiogenic faktorer, definiera signalering vägar i angiogenes, och identifiera gener som reglerar angiogenes17.
Före tillgången på patientbaserade iPSC-ECs använde forskare främst odlade ECs för att studera angiogens16. Men för endotelceller är det en teknisk utmaning att transducea exogena gener med ett virus, på grund av det begränsade passagenummer som ECs kan genomgå. Detta beror på att det knappast finns tillräckligt med cellmaterial som ska samlas in från mänskliga fartyg antingen från kirurgi eller matchade godkända givare. Med uppfinningen av iPSC generation teknik av Shinya Yamanaka, mänskliga ECs härrör från iPSCs kan användas tillförlitligt i in vitro-experiment, som rapporterats tidigare18.
Använda viralt omdanade ECs med begränsat antal och passager kan vara tillräckligt för signalering studier, men för funktionella studier, är det bättre att generera mutant pluripotenta stamcellslinjer, (antingen iPSCs eller CRISPER/Cas9-riktade hESCs), sedan differentiera dem till ECs för angiogenes studier som använder rörbildning analyser19. Rörbildning kan användas för att utvärdera funktionen hos endotelceller med mutationer. Detta protokoll beskriver också rörbildning på en μ-slide angiogenesplatta, vilket är en enkel, kostnadseffektiv och reproducerbar metod.
Protokollet nedan ger en tillförlitlig och systemisk metod för att studera betydelsen av specifika gener i vaskulär bildning, tillsammans med detaljer för in vivo uttryck mönster och in vitro funktionell kvantifiering för modellering av sjukdomar hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs godkändes av forskningsetiska kommittén för Zhejiang University School of Medicine.
1. Helmonterad in situ-hybridisering
- Zebrafisk linjehållning och reproduktion
- Mata och höj alla vuxna zebrafiskar vid 26-28 °C i ett återcirkulerande vattenbrukssystem med 14 h ljus/10 h mörk cykel för varje dag. Använd AB (vildtyp) zebrafisklinjer för följande procedurer.
- Sätt ett lager av stenar i botten av avel rutan som ett skydd för ägg. Gruppera föräldrafisk i förhållandet 2:1 (dvs. två honor och en hane) i varje låda. Låt den kvinnliga fisken leka i 1 dag. I slutet av leken, ta bort moderfisken omedelbart för att hindra dem från att äta äggen.
- Injicera 2 ng av morpholinos och 500 pg mRNA i encelliga stegembryon med femtojetinsprutningssystemet under ett mikroskop (endoglin-MOs-sekvens: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-felpar kontroll MOs-sekvens: 5'-AAACAGACCACATCCTCTTCTC-3').
- Inkubera zygoterna i surt havsvatten vid 27 °C i ca 48 timmar.
- Insamling och fixering av zebrafiskembryon
- Använd en plastöverföringspisett för att samla in 20-40 zebrafiskembryon från cirkulerande systemvatten (pH = 5.0) i ett 1,5 ml-rör när de dechorioneras och når en viss utvecklingsperiod. Tillsätt 1 ml nyberedd 4% PFA-lösning vid rumstemperatur (RT).
OBS: Den period då det valda embryot baseras på syftet med experimentet. Tabell 1 visar den fixeringstid som krävs för olika embryonala perioder. - Ta bort fixeringslösningen, tvätta embryon med fosfatbuffertad lösning med Tween-20 (PBST, späd 1 ml Tween till 1000 ml PBS-lösning) 3x i 5 min vardera vid RT.
- Torka embryona genom inkubation i en serie av 25%, 50% och 75% metanol (utspädd i PBST) för 5 min vardera. Överför embryon till 100 % metanol i 5 min och ersätt med färsk metanol. Förvara embryona vid -20 °C över natten eller längre.
- Använd en plastöverföringspisett för att samla in 20-40 zebrafiskembryon från cirkulerande systemvatten (pH = 5.0) i ett 1,5 ml-rör när de dechorioneras och når en viss utvecklingsperiod. Tillsätt 1 ml nyberedd 4% PFA-lösning vid rumstemperatur (RT).
- Hydrering och matsmältning
- Hydrat embryon som bevarades i 100% metanol med hjälp av en sikt med nylonnät i botten för att sekventiellt tvätta embryon i brunnarna av 12 brunnsplattor med en serie på 75%, 50% och 25% metanol (utspädd i PBST) för 5 min vardera. Tvätta embryona med PBST 3x i 5 min vardera vid RT.
- Tillsätt 50 μl proteinas K (10 mg/ml) i röret med embryon och följ matsmältningstiden i tabell 2 vid RT.
- Ta bort proteinas K och tvätta embryon med PBST 3x i 5 min vardera vid RT.
- Avsökningshybridisering och efterkorrigering
- Placera de sonder som är konstruerade enligt varje gens mRNA-sekvenser i ett 40 °C hybridizatinsystem tills fällningen är upplöst, som bör ta ~ 10 min. Blanda målsonder av t.ex.(XM_007116.7) och ytterligare två viktiga gener innebär i den tidiga mesoderm endotheial stamfader bildning (här, aplnr [NM_001075105.1] och nrp1a [NM_001040326.1]) i en 1,5 mL röret på en 50:1:1 förhållande. eg
- Tillsätt 50-100 μl blandade målsonder i varje rör med embryon och inkubera sedan över natten vid 40 °C.
OBS: Förblandade sonder måste förvärmas till 40 °C och kylas till RT före användning. - Förbered en 0,2 x salthaltig natriumcitratlösning med Tween-20 (SSCT): Lös upp 175,3 g NaCl och 88 g natriumcitrat i 1 L dH2O för att få en 20x SSC-lösning. Späd sedan lösningen 1:100 i dH2O för att få en 0,2 x SSCT-lösning. Späd Tween-20 1:1000 i 0,2 x SSCT-lösningen.
- Överför de återvunna sonderna till ett nytt rör. Tvätta embryona i 0,2 x SSCT-lösning 3x i 15 min vardera vid RT. De återvunna sonderna kan återanvändas 5x-10x.
- Använd 4% paraformaldehyd (PFA) för att fixera embryona i 30 min vid RT. Tvätta embryona i 0,2 x SSCT-lösning 3x i 15 min vardera vid RT.
OBS: Gross-Thebing et al. föreslår en post-fixeringsperiod på 10 min14, men det faktiska beloppet måste justeras därefter. Här testade vi 10 min post-fixering 3x, och känsligheten hos DAB döende påverkas avsevärt. Efter att ha undersökt, se till att 0,5-1,0 h av fixering är det optimala tillståndet (en kortare fixeringsperiod kan inte ge en tydlig signal från målet RNA, och lämplig förlängning av fixeringstiden hjälper till att stärka signalen och ge mindre bakgrundsljud).
- Sekventiell förstärkare och etikettsondhybridisering
- Ta bort SSCT-lösningen och byt ut den mot 50 μL amp 1. Låt embryona bosätta sig i Amp 1 vid 40 °C i 30 min. Tvätta sedan embryona i 0,2 x SSCT-lösning 3x i 15 min vardera vid RT.
- Ta bort SSCT-lösningen och tillsätt 50 μl Amp 2. Låt embryona bosätta sig vid 40 °C i 15 min. Tvätta sedan embryona i 0,2 x SSCT-lösning 3x i 15 min vardera vid RT.
- Ta bort SSCT-lösningen, tillsätt 50 μL amp 3 och knacka försiktigt på röret. Inkubera sedan embryona vid 40 °C i 30 min. Tvätta embryona i 0,2 x SSCT-lösning 3x i 15 min vardera vid RT.
- Ta bort SSCT-lösningen, tillsätt 50 μL Amp 4 dropwise och knacka försiktigt på röret. Inkubera sedan embryona vid 40 °C i 15 min. Tvätta embryona i 0,2 x SSCT 3x i 15 min vardera vid RT.
- Mottätning och mikroskopi
- Ta bort SSCT-lösningen och tillsätt 50 μl DAPI till varje rör. Inkubera embryona över natten vid 4 °C.
- Tvätta embryona med PBST och förbered dem för bildbehandling med en 1% låg smältpunkt agaros (LMP) lösning (1 g LMP upplöst i 100 ml dH2O) i en petriskål fylld med PBST.
- Använd en DAB peroxidas substrat kit för att färga provet. Tillsätt färgreagenser A, B och C (50 μL vardera) till 1 ml destillerat vatten och blanda väl för att få en komplett DAB arbetsvätska. Tillsätt vätskan i preparatet och täck i 10 min.
- Tvätta preparatet noggrant med PBST efter färgning.
- Använd ett optiskt mikroskop med en fotografisk funktion för att avbilda proverna.
OBS: Om du tar bilder senare, rör bör lindas i aluminiumfolie och lagras vid 4 °C.
2. Analys av rörbildning
OBS: De eng mutanta och wildtype ECs (kontroll) skildes från iPSCs som härrör från en HHT-patient (här en 62-årig kvinnlig patient med återkommande näsblod sedan 22 år gammal, gastrointestinal blödning, pulmonell arteriovenous missformationer, bär en missense eng mutation i position c.88T>C av exon 2) och en frisk givare (utan eng mutation), som tillhandahölls av Peking Union Medical College Hospital med godkännande från college forskning etik kommittéer.
- Kontroll- och HHT-iPSC-cellkulturer
- Tillsätt en viss volym av källarmembranmatris (t.ex. Matrigel) till en 6-brunnscellodlingsplatta för att täcka brunnens botten och ruva plattorna i 1 h vid 37 °C.
OBS: Vid första användning av källarmembranmatrisen som förvaras vid -20 °C, inkubera på is eller i ett frostfritt kylskåp på 4 °C tills den tinat. Späd sedan vid 1:100 i DMEM/F12 och fördela sedan spädningen i 200 μL-rör som innehåller 100 μL vardera. Förvara rören vid -20 °C och undvik upprepad frysning och upptining. När du lägger till den utspädda källaren membran matris, inte skapa bubblor. Efter att ha lagt till den utspädda källarmembranmatrisen skakar du försiktigt 6-brunnsplattan för hand så att den jämnt täcker botten. - Efter beläggning plattan, ta bort den använda källaren membran matrislösning från brunnarna. Tillsätt sedan 2 ml mTeSR1 medium i varje brunn, och platta iPSCs skördas från den sista passagen på ca 1 x 106 per brunn.
- Tillsätt en viss volym av källarmembranmatris (t.ex. Matrigel) till en 6-brunnscellodlingsplatta för att täcka brunnens botten och ruva plattorna i 1 h vid 37 °C.
- Generering och utbyggnad av ECs från iPSC
- Efter ca 4 dagars iPSC-odling, byt odlingsmediet med BEL-medium kompletterat med activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/ml), VEGF165 (50 ng/ml) och CHIR99021 (1,5 μM). Odla cellerna i 3 dagar för att generera mesoderm celler.
- Byt ut det medium som beskrivs i steg 2.2.1 med BEL medium kompletterat med VEGF (50 ng/ml) och SB431542 (10 μM) i 4 dagar för att expandera kärl-EK. Behandla cellerna med samma medium och odling i ytterligare 3-4 dagar.
- Använd CD31-dynabeads för att rena de mogna kärl-EK: se instruktionerna i CD31-dynabeads kit, som länkar mänskliga CD31-antikroppar med magnetiska pärlor för att kombinera CD31-molekyler uttryckta på ECs och samla sedan in CD31-positiva celler med elutionsbuffert. Underhåll och expandera de renade ECs i EC-SFM medium som innehåller VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) och FBS (1%).
- Plätering endotelceller på Matrigel-belagda plattor och mikroskopi
- Tillsätt 10 μl källarmembranmatris per brunn för att belägga angiogenesplattorna (se Materialbord)och inkubera vid 30 min vid 37 °C.
- Harvest endotel celler efter kontroll endotel markörer CD31 och VE-cadherin med immunofluorescens färgning och återsuspend dem i endotel tillväxt medium 2 genom pipettering upprepade gånger. Tillsätt 50 μl cellfjädring (2 x 105 celler/ml) per brunn på den stelnade matrisen och inkubera cellerna i 3-5 timmar vid 37 °C.
OBS: Före försöket att bildas i röret bör endotelmarkörer kontrolleras för att säkerställa att rätt fenotyp av funktionella endotelceller. 1 x 104 cell per brunn är ett idealiskt nummer för rörbildning. För många eller för få celler bidrar inte till rörbildning. Tillsätt celler från sidan av skålen och rör inte källaren membran matris. Använd ljusmikroskop i högt förstoringsfält för att kontrollera cellerna och ta bilder.
- Kvantitativa resultat av rörbildning
- Observera resultaten med ett mikroskop med hög upplösning och ta bilder av minst 10 områden för varje grupp för att få tillförlitlig datastatistik.
- Undersök endotelrörsbildning: uppskatta omfattningen av rörbildningen genom att inspektera den totala rörlängden, rörnummer och grenpunkter. Bedöma och räkna antalet och längden på grenar med imagej programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hel mount in situ hybridisering bygger på en princip som liknar fluorescens resonans energiöverföring. Den är utformad för att förbättra både känslighet och specificitet i zebrafisk ISH samt förstärka målspecifika signaler utan att påverka bakgrundssignalen.
I 24 hpf zebrafisk embryon, endoglin uttrycks starkt i den bakre kardinalvenen (PCV), intersegmentala fartyg (ISVs), och blod öar3. Det är svårt att kontrollera färgningstiden i traditionell kromogen in situ-hybridisering (CISH), med icke-positiva signaler som förekommer i vissa regioner, såsom gulesäck (figur 1A). För att undersöka rollen av eng i tidig vaskulär utveckling, en hemogenic endotel markör användes (aplnra) samt en annan endotel stamfader markör (nrp1a) för att undersöka vilken typ av endotel påverkades av eng tysta20. Uttrycket av aplnra och nrp1a var svag i 24 hpf embryon. Jämfört med CISH visades den svaga signalen från de två generna tydligt i svansregionen efter eng knockdown i WISH (figur 1B). Knockdown av eng RNA orsakade minskat uttryck för två typer av endotelceller markör gener uttryck i en HHT djurmodell.
Innan du utför experiment på differentierade iPSC identifierades och bekräftades cellerna som ECs. Morfologiskt, verkade de som kullersten form. Uttryck för endotel cellytans molekylära markörer CD31, CD146, VE-cadherin och vWF bekräftades med IF-färgning21. Efter magnetisk-baserad isolering med CD31 genomfördes den funktionella analysen enligt beskrivningen nedan.
Här utfördes röret bildandet analysen med hjälp av eng mutant och kontroll iPSC-härledda endotel celler. Statistisk analys utfördes baserat på antalet, grenar och längder av rör. En ny parameter infördes också baserat på tidigare arbete3, punkter av angiogenes, för att återspegla rörbildning av endotelceller. Så småningom konstaterades det att eng mutant endotelceller bildade färre grenar än kontroll endotelceller, och att grenar i eng muterade endotelceller ökade signifikant efter stimulering med vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) (figur 2A, B). Mutationen i eng resulterade i defekta fartyg röret bildas.
Figur 1: Endoglin knockdown minskade uttrycket för endotelmarkörer. (A)CISH och WISH utfördes för att fastställa uttrycket av endoglin i 24 hpf embryon (n > 30). Den röda rutan representerar det utvidgade området. Skalstänger = 200 μm.(B) aplnra och nrp1a uttryck genom WISH i 24 hpf zebrafiskembryon i kontroll-MO och eng-MO-gruppen. eng Den röda pilen anger regioner där uttrycket av dessa gener minskade avsevärt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Rörbildning av eng mutant och kontroll iPSC-ECs. (A)Rörbildningen av de fyra grupperna, inklusive kontrollgruppen, kontroll + VEGF (kontrolletotriska celler + 30 ng/mL VEGF), gruppen eng mutant(eng mutantetitlena celler) och gruppen eng mutant + VEGF(eng mutanta endotelceller + 30 ng/mL VEGF). Rörbildningen bedömdes och fotograferades efter 3 h. Skalstaplar = 100 μm. (B) Kvantitativa resultat av rörbildning visas. I det täckta området beräknades antalet grenar och deras längd på rören av Bild J. Felstaplar representerar SD för medelvärdena från tre oberoende experiment. Ett värde av P ansågs statistiskt signifikant när * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Embryonal period | Fixeringstid |
| 4-celler till 8 hpf | 4 timmar |
| 8 hpf till 24 hpf | 1 timme |
| 24 hpf till 4 dpf | 30 minuter |
Tabell 1: Fixeringstid som krävs för olika embryonala stadier.
| Embryonal period | Rötningstid |
| 4-celler till 8 hpf | 2 minuter |
| 8 hpf till 24 hpf | 5 minuter |
| 24 hpf till 4 dpf | 10 minuter |
Tabell 2: Rötningstid som krävs för olika embryonala stadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll tillämpas en förbättrad hel-mount in situ RNA analysplattform för zebrafish och rör formation analyser på iPSC-ECs härrör från en HHT patient. Den traditionella ISH-metoden kräver en längre experimentell cykel med extra experimentella steg. Protokollet har några viktiga förbättringar, användning av oberoende dubbla Z sonder och iPSCs härrör från en patient med HHT som tillämpades i WISH analyser och rörbildning, respektive. Dessa förbättringar är avgörande för att öka detektionskänsligheten jämfört med vad som observeras med traditionell ISH. De unikt utformade sonderna och målsignalförstärkningen gör det möjligt att upptäcka sällan uttryckta avskrifter (aplnra är en dåligt uttryckt gen i 24 hpf-embryon). En ändring är den extra fixeringen efter sondhybridisering. Den extra fixeringen kan förbättra kombinationen av sonder och avskrifter. DAB färgning tillämpas också snarare än fluorescens färgning, eftersom det konstaterades att det var svårt att utföra fluorescens färgning i vissa lågöverflöd gener. Sedan användes iPSCs för angiogenesanalyser, vilket ökar betydelsen och klinikens relevans av detta arbete. Generering av iPSC kräver strikta kulturvillkor och utgör en begränsning av protokollet.
Vissa kritiska steg måste markeras. I WISH-analys bör rötningstiden för zebrafiskembryon följas i strikt överensstämmelse med texten. En kortare rötningstid kan inte garantera att sonden kombineras med avskrifter. Däremot kommer förlängd matsmältningstid förstöra integriteten hos embryon. I röret formation experiment, bör imaging timing vara väl kontrollerad. Generellt kommer endotelcellerna att bli rör inom 12 h men den rörformiga strukturen tenderar att upplösas efter 24 h. Cellnumret är också viktigt för rörbildning, eftersom en celldensitet som är för hög eller för låg kan leda till misslyckad rörbildning. Om det är svårt att inducera endotelceller för att bilda rör, är det bra att inkludera att lägga till tillväxtfaktorer såsom VEGF till odlingsmediet som en positiv kontroll för att testa ECs förmåga att bilda rörformiga strukturer.
Sammanfattningsvis har den förbättrade WISH-metoden ansetts vara en fördelaktig teknik för laboratoriearbetsflöden. Nyligen har vår forskargrupp börjat testa denna analys i kliniska prover. Med tanke på högre känslighet och effektivare detektering än vad som observerats i traditionella metoder, denna förbättrade WISH-metod har betydande löfte för att utveckla och genomföra RNA-baserade molekylär diagnostik22.
Prestanda av rörbildningsanalys med hjälp av patientens iPSC-ECs gör det möjligt att bekräfta resultat från djurstudier samt identifiering av sjukdomsframkallande mutationer från single nucleotide polymorphism i eng genen. Kombinationen av dessa metoder klargör rollen av eng i vaskulär bildning och hålla potential i genkorrigering av patientens iPSC-ECs för kardiovaskulär cellterapi23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]; CAMS Innovationsfond för medicinska vetenskaper (CIFMS) [bidragsnummer 2016-I2M-4-003 (till Jun Yang)]; pumc-ungdomarna och grundforskningsfonderna för de centrala universiteten [bidragsnummer 2017310013 (till Fang Zhou)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
