Summary
Burada sunulan zebra balığı ve tüp oluşumu tahlil de hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinde tam montaj in situ RNA hibridizasyon analizi için bir protokol vasküler oluşumunda endoglin rolünü incelemektir.
Abstract
Vasküler gelişim, zebra balıklarında farklı gelişim evrelerinde yerinde hibridizasyon tahlilleri ile çalışılabilen spesifik genlerin sıralı ekspresyonu ile belirlenir. Kalıtsal hemorajik telanjiektazi (HHT) gelişimi sırasında damar oluşumunda endoglin(eng) rolünü araştırmak için, zebra balığında eng'in morfolino aracılı hedefli nakavtı, temporal ekspresyonunu ve ilişkili işlevleri incelemek için kullanılır. Burada, tüm-montaj in situ RNA hibridizasyon (WISH) zebrabalığı embriyolarında eng ve downstream genlerinin analizi için istihdam edilmektedir. Ayrıca HHT hasta kaynaklı indüklenen pluripotent kök hücre-diferansiye edici endotel hücrelerinde (iPSC-ECs; eng mutasyonları ile) tüp oluşumu tahlilleri yapılmaktadır. Situ Hybridization tüm miktarı kullanarak belirli bir sinyal yükseltici sistemi – WISH geleneksel yöntemlere göre daha yüksek çözünürlük ve daha düşük arka plan sonuçları sağlar. Daha iyi bir sinyal elde etmek için, fiksasyon sonrası zaman prob hibridizasyon sonra 30 dk ayarlanır. Floresan boyama zebra balığı embriyolarında hassas olmadığından, burada diaminobezidin (DAB) boyama ile değiştirilir. Bu protokolde eng mutasyonu içeren HHT hasta kaynaklı iPSC çizgileri endotel hücrelerine ayrılır. Bir tabla37 °C'de 30 dk bodrum membran matrisi ile kaplandıktan sonra, iPSC-EC'ler tek kat olarak kuyulara seriolarak ekilir ve 37 °C'de 3 saat bekletilir. Daha sonra, tüp uzunluğu ve dalları sayısı mikroskobik görüntüler kullanılarak hesaplanır. Böylece, bu geliştirilmiş WISH protokolü ile, azaltılmış eng ekspresyonu zebrabalığı embriyolarında endotel döl oluşumunu etkilediği gösterilmiştir. Bu daha fazla HHT olan bir hastadan elde edilen iPSC-ECs kullanılarak tüp oluşumu tahlilleri ile doğrulanır. Bu tahliller erken vasküler gelişimde eng için rol onaylamak.
Introduction
HHT'li hastalarda eng (CD105) üzerinde tek bir mutasyon bildirilmiştir. Mutasyon artmış EC proliferasyonu ve azaltılmış akış aracılı EC uzaması yol açar1,2. Ayrıca daha önce ENG eksikliği zebrabalığı3endotel belirteçleri ekspresyonu (yani, kdrl, cdh5, hey2) azaltır bildirilmiştir . Endoglin,özellikle endotel hücrelerinde ifade, bir transmembran glikoprotein ve büyüme faktörü β dönüştürmek için bir ko-reseptör olarak işlevleri (TGF-β) aile üyeleri. Döl1 ekspresyonu da dahil olmak üzere, kök hücre farklılaşmasını sağlamak için hücre yüzeyine BMP9 bağlanmasını yönlendirir4. Bu nedenle eng geni vaskülogenez ve insan damar hastalıklarında önemli rol oynar5,6. Daha önce zebra balığı embriyolarında damar oluşumu üzerinde endoglin knockdown etkilerini inceledik, bir eng mutasyonutaşıyan bir HHT hastadan edinilen iPSCs türetilmiş ECs analizi izledi 7 . Bu protokol, ENG eksikliğinin in vitro anjiyogenezi ölçmek için ölçülebilir bir yöntem olan endotel atası belirteç ekspresyonu ve tüp oluşumu üzerine etkilerini göstermektedir.
Eng mekansal ve zamansal ekspresyonu incelemek için WISH in vivo8'degen ekspresyonunu saptamak için kullanılır. In situ hibridizasyon (ISH), hedef nükleik asit melezlerini sabit bir numunede tespit etmek ve görselleştirmek için hedef nükleik asit (DNA veya mRNA) dizilerini tamamlayan etiketli probların kullanılması yöntemidir. Bu süreç in vivo gen ekspresyonu sinyallerini güçlendirir ve genlerin mikroskopi ile ekspresyonunu saptamak için kullanılır. WISH yaygın olarak çeşitli model hayvanlarda, özellikle zebra balığı9kullanılmıştır. Ayrıca aşağıdaki verileri elde etmek için kullanılır: 1) gen fonksiyonu ve sınıflandırma hakkında bilgi sağlayan gen mekansal/zamansal ifade desenleri; ve 2) özellikle yüksek iş yapımı ilaç veya mutant tarama10kullanılan gen belirteçleri ifade .
Kromojenik problar, yüksek arka plan gürültüsü ve nonspesifik sinyallerle sonuçlanan situ hibridizasyonda (CISH) geleneksel kromozom ile kolayca bozulur11,12. WISH yöntemi, RNA dizilerini hedeflemek için hibridize etmek üzere tasarlanmış iki bağımsız çift Z probkullanır. Her sonda hedef RNA tamamlayıcı bir 18-25 dizisi ve 14 baz kuyruk dizisi (Z olarak kavramsallaştırılmış) içerir. Hedef problar bir çift (çift Z) kullanılır. İki kuyruk dizisi, amplifikatör için 20 bağlama alanı içeren preamplifikatör için 28 baz hibridizasyon alanı oluşturur. Amplifikatör, sırayla, etiket sondası için 20 bağlama sitesi içerir ve teorik olarak her hedef RNA dizisi için 8.000'e kadar etiket verebilir.
Bu ileri teknoloji doku morfolojisi korurken tek moleküllü görselleştirme elde etmek için eşzamanlı sinyal amplifikasyon ve arka plan bastırma kolaylaştırır13. WISH yöntemlerinin daha fazla değişiklik önceki araştırma dayanmaktadır14, ekstra fiksasyon ve DAB boyama dahil. Burada sağlanan hedef RNA kısmen azalmış veya bozulmuş olsa bile çalışabilirsiniz geliştirilmiş bir WISH protokolüdür. Avantajları rnase içermeyen koşullar olmadan 24 saat içinde tamamlanabilir içerir. Sinyaller aynı anda birden fazla hedeften birden fazla kanal üzerinden algılanabilir ve sonuçlar tutarlı dır ve farklı yüksek iş hacmi otomasyon platformlarından elde edilen sonuçlarla uyumludur.
Hayvan modellerinden elde edilen sonuçlar, insanlarda meydana gelen aynı fenomeni yansıtmaya gerek yoktur. ENG, yetim bölgelerde disülfür köprüleri oluşturan c30-C207 ve C53-C182 olmak üzere iki çift korunmuş sistein içerir. HHT hastalarında eng'in rolünü daha fazla incelemek için, HHT hastalarından elde edilen iPSC'li tüp oluşumu tahlilleri eng mutasyonu olmayan hücrelerde gerçekleştirilmiştir (Cys30Arg, C30R)15. Kubota ve ark. ilk tüp oluşumu deney16rapor sonra, töz çeşitli şekillerde geliştirilmiştir. Anjiyojenik veya antianjiogenik faktörleri tanımlamak, anjiyogenezde sinyal yollarını tanımlamak ve anjiyogenezi düzenleyen genleri tanımlamak için kullanılmıştır17.
Önce hasta kaynaklı iPSC-ECs durumu, araştırmacılar anjiyojensis16çalışma için öncelikle kültürlü ECs kullanılır. Ancak, endotel hücreleri için, bir virüs ile eksojen genler transduce için teknik bir meydan okumadır, ECs geçirebilir sınırlı geçiş numarası nedeniyle. Bunun nedeni, insan damarlarından ameliyat veya eşleşen onaylı donörlerden toplanacak kadar hücresel malzeme nin olmamasıdır. Shinya Yamanaka tarafından iPSC üretim tekniğinin icadı ile, insan ECs iPSCs türetilen in vitro deneylerde güvenilir bir şekilde kullanılabilir, daha önce bildirildiği gibi18.
Sınırlı sayıda ve pasajlar ile viral transekçleri kullanarak sinyal çalışmaları için yeterli olabilir, ama fonksiyonel çalışmalar için, mutant pluripotent kök hücre hatları oluşturmak için daha iyidir, (ya iPSCs veya CRISPER / Cas9 hedefli hESCs), sonra tüp oluşumu tahlilleri kullanmak anjiyogenez çalışmaları için ECs içine ayırt19. Tüp oluşumu mutasyonları taşıyan endotel hücrelerinin işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda kolay, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir yöntem olan bir μ-slide anjiyogenez plakası üzerinde tüp oluşumunu açıklar.
Aşağıdaki protokol, vasküler formasyonda spesifik genlerin rolünün araştırılması için güvenilir ve sistemik bir yöntem, in vivo ekspresyon deseni ve insan hastalığının modellenmesi için in vitro fonksiyonel nicelleştirme ayrıntıları ile birlikte sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yerinde hibridizasyonda tam montaj
- Zebra balığı soy ve üreme
- Her gün için 14 saat ışık/10 saat karanlık döngüsü ile yeniden dolaşan bir kültür balıkçılığı sisteminde tüm yetişkin zebra balıklarını 26-28 °C'de besleyin ve yetiştirin. Aşağıdaki yordamlar için AB (vahşi tip) zebra balığı hatlarını kullanın.
- Yumurta için bir barınak olarak üreme kutusunun altına çakıl bir tabaka koyun. Her kutuya 2:1 (yani, iki dişi ve bir erkek) oranında grup ebeveyn balık. Dişi balıklar 1 gün yumurtlasun. Yumurtlama sonunda, yumurta yeme onları önlemek için hemen ana balık çıkarın.
- Femto Jet enjeksiyon sistemini mikroskop altında tek hücreli evre embriyolara 2 ng morkolino ve 500 pg mRNA enjekte edin (endoglin-MOs dizisi: 5'-GATGAACTCAACCGTGTCTGAT-3'; 5-mispair kontrol MOs dizisi: 5'-AAACAGACCACATCTTCTCTCTC-3').
- Zigotları 27 °C'de yaklaşık 48 saat boyunca asidik deniz suyuna kuluçkaya yatırın.
- Zebra balığı embriyolarının toplanması ve fiksasyonu
- Dechorionated ve gelişim belirli bir döneme ulaşmak 1,5 mL tüp içinde dolaşan sistem su (pH = 5.0) 20-40 zebrabalığı embriyoları toplamak için plastik bir transfer pipet kullanın. Oda sıcaklığında (RT) taze hazırlanmış %4 PFA çözeltisi 1 mL ekleyin.
NOT: Seçilen embriyonun seçildiği dönem deneyin amacına bağlıdır. Tablo 1, farklı embriyonik dönemler için gerekli fiksasyon süresini göstermektedir. - Fiksasyon çözeltisini çıkarın, embriyoları Tween-20 ile fosfat tamponlu solüsyonla yıkayın (PBST, 1 000 mL PBS çözeltisine 1000 mL'lik tween seyreltme) RT'de 5 dakika için 3x.
- Embriyoları kuluçka yoluyla %25, %50 ve %75 metanol (PBST'de seyreltilmiş) 5'er dakika boyunca dehydrate. Embriyoları 5 dakika boyunca %100 metanol ile değiştirin ve taze metanol ile değiştirin. Embriyoları gece veya daha uzun süre -20 °C'de saklayın.
- Dechorionated ve gelişim belirli bir döneme ulaşmak 1,5 mL tüp içinde dolaşan sistem su (pH = 5.0) 20-40 zebrabalığı embriyoları toplamak için plastik bir transfer pipet kullanın. Oda sıcaklığında (RT) taze hazırlanmış %4 PFA çözeltisi 1 mL ekleyin.
- Hidrasyon ve sindirim
- %100 metanolde korunmuş embriyoları, her biri 5 dakika boyunca %75, %50 ve %25 metanol (PBST'de seyreltilmiş) ile 12 kuyu plakasının kuyularında sırayla yıkamak için alt kısmında naylon örgülü bir elek kullanarak nemlendirin. Embriyoları Rt'de 5 dakika boyunca PBST 3x ile yıkayın.
- Embriyolarla tüpe 50 μL proteinaz K (10 mg/mL) ekleyin ve RT'de Tablo 2'deki sindirim süresini takip edin.
- Proteinaz K'yi çıkarın ve embriyoları RT'de 5 dakika boyunca PBST 3x ile yıkayın.
- Prob hibridizasyonu ve fiksasyon sonrası
- Her genin mRNA dizilerine göre tasarlanan probları, çökelti eriyene kadar 40 °C hibridizatin sistemine koyun, hangi almalısınız ~ 10 dk. Örneğin hedef probları karıştırın (XM_007116.7) ve ek iki önemli generken mezoderm endtheial progenitor oluşumu (burada, aplnr [NM_001075105.1] ve nrp1a [NM_001040326.1]) bir 50:1:1 oranında 1.5 mL tüp içerir.
- Embriyolarla her tüpe 50-100 μL karışık hedef probları ekleyin ve gece boyunca 40 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Önceden karıştırılmış problar kullanılmadan önce önceden 40 °C'ye ısıtılmalı ve RT'ye soğutulmalıdır. - Tween-20 (SSCT) ile 0,2 x tuzlu sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın: 20x SSC çözeltisi elde etmek için 175,3 g NaCl ve 88 g sodyum sitrat 1 L dH2O çözünür. Daha sonra, 0,2 x SSCT çözeltisi elde etmek için çözeltiyi 1:100'de dH2O'da seyreltin. Seyreltik Tween-20 0.2x SSCT çözeltisinde 1:1000.
- Geri dönüştürülmüş probları yeni bir tüpe aktarın. Embriyoları RT'de her biri 15 dakika boyunca 0,2 x SSCT çözeltisi 3x'te yıkayın. Geri dönüştürülmüş problar 5x-10x yeniden kullanılabilir.
- RT'de embriyoları 30 dakika boyunca onarmak için %4 paraformaldehit (PFA) kullanın. Embriyoları 0,2x SSCT çözeltisinde 3x'te 15'er dakika boyunca RT'de yıkayın.
NOT: Brüt-Thebing ve ark.'nın çalışmaları 10 dk14'lükbir fiksasyon sonrası dönemi önerir, ancak gerçek tutar buna göre ayarlanmalıdır. Burada, 10 dk fiksasyon sonrası 3x test ve DAB ölüm hassasiyeti önemli ölçüde etkilenir. Araştırdıktan sonra, 0.5-1.0 h fiksasyon optimal durum (daha kısa bir fiksasyon süresi hedef RNA net bir sinyal üretemez ve fiksasyon süresinin uygun uzantısı sinyal güçlendirmek ve daha az arka plan gürültüsü sağlamaya yardımcı olur) olduğundan emin olun.
- Sıralı amplifikatör ve etiket probu hibridizasyonu
- SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 μL Amp 1 ile değiştirin. Embriyoların Amp 1'e 40 °C'de 30 dakika süreyle yerleşmelerine izin verin. Daha sonra embriyoları RT'de her biri 15 dk için 0,2 x SSCT çözeltisi 3x olarak yıkayın.
- SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 μL Amp 2 ekleyin. Embriyoların 40 °C'de 15 dk yerleşmelerine izin verin. Daha sonra embriyoları RT'de her biri 15 dk için 0,2 x SSCT çözeltisi 3x olarak yıkayın.
- SSCT çözeltisini çıkarın, 50 μL Amp 3 ekleyin ve tüpe hafifçe dokunun. Daha sonra embriyoları 40 °C'de 30 dk. Embriyoları 0,2 x SSCT çözeltisinde 3x 15 dk'lık RT'de yıkayın.
- SSCT çözeltisini çıkarın, 50 μL Amp 4 damla cıkı ekleyin ve tüpe dikkatlice dokunun. Daha sonra embriyoları 40 °C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Embriyoları RT'de her biri 15 dakika boyunca 0,2 x SSCT 3x olarak yıkayın.
- Karşı boyama ve mikroskopi
- SSCT çözeltisini çıkarın ve her tüpe 50°L DAPI ekleyin. Embriyoları bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Embriyoları PBST ile yıkayın ve PBST ile dolu bir Petri kabında %1 düşük erime noktası agarose (LMP) çözeltisi (1 g LMP 100 mL dH2O'da çözünmüş) kullanarak görüntülemeye hazırlayın.
- Numuneyi lekelemek için DAB peroksidaz substrat kiti kullanın. 1 mL distile suya A, B ve C (her biri 50°L) renk reaktifleri ekleyin ve tam bir DAB çalışma sıvısı elde etmek için iyice karıştırın. Sıvıyı numuneye ekleyin ve 10 dk.
- Boyadan sonra numuneyi PBST ile iyice yıkayın.
- Örnekleri görüntülemek için fotoğraf fonksiyonu na sahip optik mikroskop kullanın.
NOT: Daha sonra görüntü alınması durumunda tüpler alüminyum folyoya sarılmalı ve 4 °C'de saklanmalıdır.
2. Tüp oluşumu töz
NOT: Eng mutant ve wildtype ECs (kontrol) bir HHT hastadan elde edilen iPSCs ayırt edildi (burada, 22 yaşından beri tekrarlayan epistaksisi olan 62 yaşında kadın hasta, gastrointestinal kanama, pulmoner arteriovenöz malformasyonlar, c.88T>C pozisyonunda yanlış bir eng mutasyonu taşıyan ekson 2) ve Pekin Union Medical College Hospital tarafından üniversite araştırma etik kurulunun onayı ile sağlanan sağlıklı bir donör (eng mutasyonu olmadan)
- Kontrol ve HHT iPSC hücre kültürleri
- Kuyunun dibini kaplayacak 6 kuyuhücre kültür plakasına belirli bir hacimde bodrum membran matrisi (örneğin, Matrigel) ekleyin ve plakaları 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: -20 °C'de depolanan bodrum membran matrisi ilk kullandığınızda, buzüzerinde veya çözülene kadar donma içermeyen 4 °C'lik bir buzdolabında kuluçkaya yatırın. Daha sonra DMEM/F12'de 1:100'de seyreltin ve seyreltici leri her biri 100 μL içeren 200 μL'lik tüplere dağıtın. Tüpleri -20 °C'de saklayın ve tekrarlanan donma ve erimeden kaçının. Seyreltilmiş bodrum membran matris eklerken, kabarcıklar oluşturmayın. Seyreltilmiş bodrum membran matris ekledikten sonra, eşit alt kapsar, böylece elle 6 iyi plaka sallayın. - Plakayı kapladıktan sonra, kullanılan bodrum membran matris çözeltisini kuyulardan çıkarın. Daha sonra, her kuyuya 2 mL mL mL mTeSR1 ortamı ekleyin ve son geçitten alınan iPSC'leri kuyu başına yaklaşık 1 x 106'da plakalayın.
- Kuyunun dibini kaplayacak 6 kuyuhücre kültür plakasına belirli bir hacimde bodrum membran matrisi (örneğin, Matrigel) ekleyin ve plakaları 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- iPSC'lerden AB'lerin üretimi ve genişletilmesi
- Yaklaşık 4 günlük iPSC kültüründen sonra, kültür ortamını aktivin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL) ve CHIR99021 (1,5 μM) ile desteklenmiş BEL ortamı ile değiştirin. Mezoderm hücreleri oluşturmak için 3 gün boyunca hücreleri büyütün.
- 2.2.1'de tanımlanan ortamı, vasküler EC'leri genişletmek için 4 gün boyunca VEGF (50 ng/mL) ve SB431542 (10 μM) ile takviye edilmiş BEL ortamıile değiştirin. Hücreleri 3-4 gün daha aynı ortam ve kültürle tedavi edin.
- Olgun vasküler EC'leri arındırmak için CD31-dynaboncuklar kullanın: CD31-dynabeads kitindeki talimatlara bakın, insan CD31 antikorlarını manyetik boncuklarla birbirine bağlayarak EC'lerde ifade edilen CD31 moleküllerini birleştirin, ardından elüsasyon tamponu yla CD31-pozitif hücreleri toplayın. VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) ve FBS (%1) içeren EC-SFM ortamlarında saflaştırılmış eK'leri koruyun ve genişletin.
- Matrigel kaplı plakalar ve mikroskopi de endotel hücrelerinin kaplaması
- Anjiyogenez plakalarını kaplamak için kuyu başına 10 μL'lik bodrum membran matrisi ekleyin (Bkz. Malzemeler Tablosu)ve 37 °C'de 30 dk.'da kuluçkaya yatırın.
- Endotel belirteçleri CD31 ve VE-kadherin immünofloresan boyama ile kontrol ettikten sonra endotel hücreleri hasat ve tekrar tekrar pipetleme ile endotel büyüme ortamı 2 onları resuspend. Katılaşmış matrisin üzerine her bir hücre süspansiyonu (2 x 105 hücre/mL) ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 3-5 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Tüp oluşum deneyi öncesinde, fonksiyonel endotel hücrelerinin uygun fenotip emin olmak için endotel belirteçleri kontrol edilmelidir. Kuyu başına 1 x 104 hücre tüp oluşumu için ideal bir sayıdır. Çok fazla veya çok az hücre tüp oluşumuna elverişli değildir. Çanak tarafında hücreleri ekleyin ve bodrum membran matris dokunmayın. Hücreleri kontrol etmek ve fotoğraf çekmek için yüksek büyütme alanında ışık mikroskobu kullanın.
- Tüp oluşumunun nicel sonuçları
- Sonuçları yüksek çözünürlüklü bir mikroskopla gözlemleyin ve güvenilir veri istatistikleri elde etmek için her grup için en az 10 alanın fotoğraflarını çekin.
- Endotel tüpü oluşumunu inceleyin: genel tüp uzunluğu, tüp sayısı ve dal noktalarını inceleyerek tüp oluşumunun kapsamını tahmin edin. ImageJ yazılımını kullanarak şubelerin sayısını ve uzunluğunu değerlendirin ve sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yerinde hibridizasyon tüm montaj floresan rezonans enerji transferi benzer bir ilke dayanmaktadır. Zebrabalığı ISH'in hem hassasiyetini hem de özgüllüğünü artırmak ve arka plan sinyalini etkilemeden hedefe özel sinyalleri yükseltmek için tasarlanmıştır.
24 hpf zebra balığı embriyolarında, endoglin yüksek posterior kardinal ven ifade edilir (PCV), intersegmental damarlar (ISV), ve kan adaları3. Geleneksel kromojenik in situ hibridizasyonda (CISH) boyama süresini kontrol etmek zordur ve sarısı kesesi gibi bazı bölgelerde pozitif olmayan sinyaller meydana gelir (Şekil 1A). Erken vasküler gelişimde eng'in rolünü araştırmak için, endotenin hangi tip endotel silencing20etkilendiğini incelemek için bir hemojenik endotel belirteci(aplnra)yanı sıra başka bir endotel progenitor marker(nrp1a)kullanılmıştır. eng Aplnra ve nrp1a ifadesi 24 hpf embriyoda zayıftı. CISH ile karşılaştırıldığında, iki genden gelen zayıf sinyal, WISH 'de(Şekil 1B) nakavt tan sonra kuyruk bölgesinde açıkça gösterilmiştir . Eng RNA'nın yıkılması, hht hayvan modelinde iki tür endotel hücre belirteç genlerinin ekspresyonunun azalmasına neden oldu.
Farklılaştırılmış iPSC'ler üzerinde deneyler yapmadan önce hücreler tanımlanmış ve EC olarak doğrulanmış. Morfolojik olarak, parke taşı şekli olarak ortaya çıktılar. Endotel hücre yüzeyi moleküler belirteçlerinin ekspresyonu CD31, CD146, VE-kadherin ve vWF IF boyama21ile doğrulandı. CD31 kullanılarak manyetik tabanlı izolasyondan sonra fonksiyonel test aşağıda açıklandığı gibi yapılmıştır.
Burada tüp oluşumu teşbiti eng mutant ve kontrol iPSC kaynaklı endotel hücreleri kullanılarak yapıldı. Tüplerin sayısı, dalları ve uzunluklarına göre istatistiksel analiz yapıldı. Yeni bir parametre de öncekiçalışma3 dayalı tanıtıldı , anjiyogenez noktaları, endotel hücrelerinin tüp oluşumunu yansıtmak için. Sonunda, eng mutant endotel hücrelerinin kontrol endotel hücrelerinden daha az dal oluşturduğu ve eng mutant endotel hücrelerindeki dalların vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ile uyarılmasından sonra önemli ölçüde arttığı saptanmıştır (Şekil 2A,B). Eng mutasyonu kusurlu damar tüpü oluşumuna neden oldu.
Şekil 1: Endoglin nakavt endotel belirteçleri ifade azaldı. (A) CISH ve WISH 24 hpf embriyoda (n > 30) endoglin ekspresyonunu belirlemek için yapıldı. Kırmızı kutu büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) aplnra ve nrp1a ekspresyonu WISH tarafından 24 hpf zebrabalığı embriyolarında kontrol-MO ve eng-MO grubudur. Kırmızı ok, bu genlerin ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığı bölgeleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Eng mutant ve kontrol iPSC-ECs tüp oluşumu. (A)Kontrol grubu, kontrol + VEGF (kontrol endotel hücreleri + 30 ng/mL VEGF), eng mutant(eng mutant endotel hücreleri) grubu ve eng mutant + VEGF (eng mutant endotel hücreleri + 30 ng/mL VEGF) grubu dahil olmak üzere dört grup tarafından tüp oluşumu. Tüp oluşumu 3 saat sonra değerlendirildi ve fotoğraflandı = 100 μm. (B) Tüp oluşumunun nicel sonuçları gösterilmiştir. Kapalı alanda dal sayısı ve tüplerin uzunluğu Image J. Hata çubukları tarafından hesaplanan üç bağımsız deneylerden ortalama değerlerin SD temsil eder. *p < 0.05 olduğunda P değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Embriyonik dönem | Fiksasyon süresi |
| 4-hücreleri 8 hpf | 4 saat |
| 8 hpf - 24 hpf | 1 saat |
| 24 hpf - 4 dpf | 30 dakika |
Tablo 1: Farklı embriyonik evreler için fiksasyon süresi gereklidir.
| Embriyonik dönem | Sindirim süresi |
| 4-hücreleri 8 hpf | 2 dakika |
| 8 hpf - 24 hpf | 5 dakika |
| 24 hpf - 4 dpf | 10 dakika |
Tablo 2: Farklı embriyonik evreler için gerekli sindirim süresi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bir HHT hastasından elde edilen iPSC-EC'lerde zebra balığı ve tüp oluşumu tahlilleri için geliştirilmiş bir yerinde RNA analiz platformu uygulamıştır. Geleneksel ISH yöntemi ekstra deneysel adımlar ile daha uzun bir deneysel döngü gerektirir. Protokolde, sırasıyla WISH tahlillerinde ve tüp oluşumunda uygulanan HHT'li bir hastadan elde edilen bağımsız çift Z probları ve iPSC'lerin kullanımı gibi önemli iyileştirmeler vardır. Bu iyileştirmeler, geleneksel ISH ile gözlenenlerle karşılaştırıldığında algılama hassasiyetini artırmak için çok önemlidir. Benzersiz olarak tasarlanmış problar ve hedef sinyal amplifikasyonu nadiren ifade edilen transkriptlerin algılanmasını sağlar(aplnra 24 hpf embriyoda kötü ifade edilmiş bir gendir). Bir değişiklik prob hibridizasyon sonra ekstra fiksasyon olduğunu. Ekstra fiksasyon problar ve transkript kombinasyonu artırabilir. DAB boyama da floresan boyama yerine uygulanır, bazı düşük bolluk genlerde floresan boyama yapmak zor olduğu bulunmuştur çünkü. Daha sonra, bu çalışmanın önemini ve klinik alaka artar anjiyogenez tahlilleri için iPSCs kullanılmıştır. IPSC'lerin üretimi sıkı kültür koşulları gerektirir ve protokolün bir sınırlamasını temsil eder.
Bazı kritik adımlar vurgulanmalıdır. WISH analizinde zebra balığı embriyolarının sindirim süresi metne uygun olarak takip edilmelidir. Daha kısa bir sindirim süresi probun transkriptlerle başarılı bir şekilde birleşip birleştirdiğini garanti edemez. Buna karşılık, uzun sindirim süresi embriyoların bütünlüğünü yok edecek. Tüp oluşum deneylerinde görüntüleme zamanlaması iyi kontrol edilmelidir. Genellikle, endotel hücreleri içinde tüpler olacak 12 saat ama tübüler yapı 24 saat sonra parçalanma eğilimindedir. Hücre sayısı da tüp oluşumu için önemlidir, çok yüksek veya çok düşük bir hücre yoğunluğu başarısız tüp oluşumuna yol açabilir gibi. Endotel hücrelerini tüpler oluşturmak için ikna etmek zor ise, tüp yapıları oluşturmak için ECs yeteneğini test etmek için olumlu bir kontrol olarak kültür ortamına VEGF gibi büyüme faktörleri ekleyerek dahil etmek yararlıdır.
Özetle, geliştirilmiş WISH yöntemi laboratuvar iş akışları için avantajlı bir teknik olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, araştırma grubumuz klinik örneklerde bu testi yapmaya başlamıştır. Geleneksel yöntemlerde gözlenenden daha yüksek duyarlılık ve daha verimli algılama göz önüne alındığında, bu geliştirilmiş WISH yöntemi RNA tabanlı moleküler tanı geliştirmek ve uygulamak için önemli bir vaat tutar22.
Hasta iPSC-EC'leri kullanılarak tüp oluşumu testinin gerçeklemesi, hayvan çalışmalarından elde edilen sonuçların doğrulanmasına ve eng genindeki tek nükleotit polimorfizminden kaynaklanan hastalığa neden olan mutasyonların belirlenmesine olanak sağlar. Bu yöntemlerin kombinasyonu vasküler oluşumunda eng rolünü açıklar ve kardiyovasküler hücre tedavisi için hasta iPSC-ECs gen düzeltme potansiyelini tutun23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin kök hücre ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı hibe tarafından desteklendi [hibe numarası 2016YFA0102300 (Jun Yang için)];Çin Doğa Bilimleri Vakfı [hibe numarası 81870051, 81670054 (Jun Yang için)]; CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (CIFMS) [hibe numarası 2016-I2M-4-003 (Jun Yang için)]; PUMC Youth Found ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları [hibe numarası 2017310013 (Fang Zhou için)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
