Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor whole-mount in situ RNA hybridisatie analyse in zebravis en buisvorming test in patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen om de rol van endoglin in vasculaire vorming te bestuderen.
Abstract
Vasculaire ontwikkeling wordt bepaald door de sequentiële expressie van specifieke genen, die kan worden bestudeerd door het uitvoeren van in situ hybridisatietesten bij zebravissen tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Om de rol van endoglin(eng) in de vorming van bloedvaten tijdens de ontwikkeling van erfelijke hemorragische telangiectasia (HHT) te onderzoeken, worden morfoino-gemedieerde gerichte knockdown van eng in zebravissen gebruikt om de temporele expressie en bijbehorende functies te bestuderen. Hier wordt whole-mount in situ RNA hybridisatie (WISH) gebruikt voor de analyse van eng en zijn downstream genen in zebravis embryo's. Ook worden buisvormingstesten uitgevoerd in HHT-geïnduceerde pluripotente stamcelgedifferentieerde endotheelcellen eng (iPSC-ECs; met engmutaties). Een specifiek signaalversterkend systeem met behulp van de hele hoeveelheid In Situ Hybridization – WISH biedt een hogere resolutie en lagere achtergrondresultaten in vergelijking met traditionele methoden. Om een beter signaal te verkrijgen, wordt de post-fixatietijd aangepast tot 30 min na de hybridisatie van de sonde. Omdat fluorescentievlekken niet gevoelig zijn in zebravisembryo's, wordt deze hier vervangen door diaminobezidine (DAB) vlekken. In dit protocol worden HHT-door patiënten afgeleide iPSC-lijnen die een engmutatie bevatten, gedifferentieerd in endotheelcellen. Na het coaten van een plaat met keldermembraanmatrix voor 30 min bij 37 °C, worden iPSC-IC's als monolaag in putten gezaaid en 3 uur lang op 37 °C gehouden. Vervolgens worden de buislengte en het aantal takken berekend aan de hand van microscopische afbeeldingen. Met dit verbeterde WISH-protocol wordt dus aangetoond dat verminderde eng-expressie de enotheliale voorlopervorming in zebravisembryo's beïnvloedt. Dit wordt verder bevestigd door buisvormingstesten met behulp van iPSC-ECs afkomstig van een patiënt met HHT. Deze testen bevestigen de rol voor eng in de vroege vasculaire ontwikkeling.
Introduction
Een enkele mutatie op eng (CD105) is gemeld bij patiënten met HHT. De mutatie leidt tot een grotere proliferatie van de EG en tot een verminderde doorstroom gemedieerde EG-verlenging1,2. Het is ook eerder gemeld dat ENG-deficiëntie de expressie van endotheelmarkeringen vermindert (d.w.z. kdrl, cdh5, hey2) bij zebravis3. Endoglin, voornamelijk uitgedrukt in endotheelcellen, is een transmembrane glycoproteïne en functioneert als een co-receptor voor het transformeren van groeifactor β (TGF-β) familieleden. Het stuurt BMP9 binding op het celoppervlak te reguleren downstream gen, met inbegrip van Id1 expressie, om stamcel differentiatie te induceren in de richting van ECs4. Zo speelt het eng-gen een belangrijke rol bij vasculogenese en menselijke vasculaire aandoeningen5,6. We hebben eerder de effecten onderzocht van endoglin knockdown op de vorming van bloedvaten in zebravisembryo's, gevolgd door een analyse van door iPSCs afgeleide ECs die is verkregen van een HHT-patiënt met een eng-mutatie 7. Dit protocol toont de effecten aan van ENG-deficiëntie op endotheelverermarkeringsexpressie en buisvorming, een kwantificeerbare methode voor het meten van in vitro angiogenese.
Om ruimtelijke eng-expressie te bestuderen, wordt WISH gebruikt om genexpressie in vivo8te detecteren. In situ hybridisatie (ISH) is een methode voor het gebruik van gelabelde sondes met complementsequenties van doelkernzuren (DNA of mRNA) om doelkernzuurhybriden in een vast monster te detecteren en te visualiseren. Het proces versterkt genexpressiesignalen in vivo en wordt gebruikt om de expressie van genen door microscopie te detecteren. WISH is op grote schaal gebruikt in verschillende modeldieren, vooral in zebravis9. Het wordt ook gebruikt om de volgende gegevens te verwerven: 1) gen ruimtelijke / temporele expressie patronen, die informatie over genfunctie en classificatie; en 2) specifiek uitgedrukte genmarkers die worden gebruikt bij high-throughput drug of mutant screening10.
Chromogene sondes worden gemakkelijk afgebroken met traditionele chromosoom in situ hybridisatie (CISH), wat resulteert in hoge achtergrondgeluid en niet-specifieke signalen11,12. De WISH-methode maakt gebruik van twee onafhankelijke dubbele Z-sondes, die zijn ontworpen om te hybridiseren om RNA-sequenties te targeten. Elke sonde bevat een 18-25 sequentie complementair aan het doel RNA en een 14 base staart sequentie (geconceptualiseerd als Z). De doelsondes worden gebruikt in een paar (dubbel Z). De twee staartsequenties vormen samen een 28 base hybridisatie site voor de voorversterker, die 20 bindingsplaatsen voor de versterker bevat. De versterker bevat op zijn beurt 20 bindingsplaatsen voor de labelsonde en kan in theorie tot 8.000 labels opleveren voor elke doelRNA-sequentie.
Deze geavanceerde technologie vergemakkelijkt gelijktijdige signaalversterking en achtergrondonderdrukking om visualisatie van één molecuul te bereiken met behoud van weefselmorfologie13. Verdere wijziging van de WISH-methoden is gebaseerd op eerder onderzoek14, inclusief extra fixatie en DAB-kleuring. Hier is een verbeterde WISH protocol dat kan werken, zelfs als het doel RNA is gedeeltelijk verlaagd of gedegradeerd. Voordelen zijn onder meer dat het kan worden voltooid in 24 uur zonder RNase-vrije voorwaarden. Signalen kunnen ook gelijktijdig worden gedetecteerd via meerdere kanalen van meerdere doelen, en de resultaten zijn consistent en compatibel met resultaten van verschillende high-throughput automatiseringsplatforms.
Resultaten van diermodellen zijn niet nodig en weerspiegelen hetzelfde fenomeen dat bij de mens voorkomt. ENG bevat twee paren geconserveerde cysteines, C30-C207 en C53-C182, die disulfide bruggen vormen in weesgebieden. Om de rol van eng bij HHT-patiënten verder te bestuderen, zijn buisvormingstesten uitgevoerd met iPSC's afkomstig van HHT-patiënten in cellen zonder/met engmutaties (Cys30Arg, C30R)15. Nadat Kubota et al. voor het eerst het buisvormingsexperiment16rapporteerde, is de test op verschillende manieren ontwikkeld. Het is gebruikt om angiogene of antiangiogene factoren te identificeren, de signaleringstrajecten in angiogenese te definiëren en genen te identificeren die angiogenese17reguleren.
Voorafgaand aan de beschikbaarheid van door patiënten afgeleide iPSC-IC's gebruikten onderzoekers voornamelijk gekweekte ECs om angiogensis16te bestuderen. Voor endotheelcellen is het echter een technische uitdaging om exogene genen met een virus te transduceren, vanwege het beperkte passageaantal dat EC's kunnen ondergaan. Dit komt omdat er nauwelijks genoeg cellulair materiaal te verzamelen uit menselijke vaten, hetzij uit een operatie of gematched goedgekeurde donoren. Met de uitvinding van de iPSC generatie techniek door Shinya Yamanaka, menselijke ECs afgeleid van iPSCs kan betrouwbaar worden gebruikt in in vitro experimenten, zoals eerder gemeld18.
Het gebruik van viraal getransduceerde ECs's met beperkte aantallen en passages kan voldoende zijn voor signaleringsstudies, maar voor functionele studies is het beter om gemuteerde pluripotente stamcellijnen te genereren (iPSCs of CRISPER/Cas9-gerichte hESCs), en ze vervolgens te differentiëren in ECs voor angiogenesestudies die gebruik maken van buisvormingsanalyses19. Buisvorming kan worden gebruikt om de functie van endotheelcellen met mutaties te evalueren. Dit protocol beschrijft ook buisvorming op een μ-slide angiogeneseplaat, wat een eenvoudige, kosteneffectieve en reproduceerbare methode is.
Het onderstaande protocol biedt een betrouwbare en systemische methode voor het bestuderen van de rol van specifieke genen in vasculaire vorming, samen met details voor in vivo expressiepatroon en in vitro functionele kwantificering voor het modelleren van menselijke ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Research Ethics Committee van de Zhejiang University school of medicine.
1. Whole-mount in situ hybridisatie
- De lijnhouderij en de reproductie van zebravissen
- Voer en verhoog alle volwassen zebravissen bij 26-28 °C in een recirculerend aquacultuursysteem met 14 uur licht/10 uur donkere cyclus voor elke dag. Gebruik AB (wild-type) zebravis lijnen voor de volgende procedures.
- Leg een laag steentjes in de bodem van de kweekdoos als schuilplaats voor eieren. Groep ouderlijke vis in de verhouding van 2:1 (d.w.z. twee vrouwtjes en een mannetje) in elke doos. Laat de vrouwelijke vissen 1 dag paaien. Verwijder aan het einde van het paaien de oudervis onmiddellijk om te voorkomen dat ze de eieren eten.
- Injecteer de 2 ng van morpholinos en 500 pg mRNA in eencellige embryo's met behulp van het Femto Jet injectiesysteem onder een microscoop (endoglin-MOs sequentie: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-mispair control MOs sequentie: 5'-AAACACCCAACCCTCTTCATCTCTC-3').
- Broed de zygoten in zuur zeewater bij 27 °C voor ongeveer 48 uur.
- Inzameling en fixatie van embryo's van zebravis
- Gebruik een plastic transferpipet om 20-40 zebravisembryo's te verzamelen uit het circulerende systeemwater (pH = 5,0) in een buis van 1,5 mL wanneer ze worden gedechorioneerd en een specifieke ontwikkelingsperiode bereiken. Voeg 1 mL vers bereide 4% PFA-oplossing toe bij kamertemperatuur (RT).
LET OP: De periode waarin het gekozen embryo is gebaseerd op het doel van het experiment. Tabel 1 toont de fixatietijd die nodig is voor verschillende embryonale perioden. - Verwijder de fixatieoplossing, was embryo's met fosfaatgebufferde oplossing met Tween-20 (PBST, verdun 1 mL Tween tot 1000 mL PBS-oplossing) 3x voor 5 min per stuk bij RT.
- Dehydrateer de embryo's door incubatie in een reeks van 25%, 50% en 75% methanol (verdund in PBST) gedurende 5 minuten per stuk. Breng embryo's gedurende 5 minuten over naar 100% methanol en vervang ze door verse methanol. Bewaar de embryo's 's nachts of langer op -20 °C.
- Gebruik een plastic transferpipet om 20-40 zebravisembryo's te verzamelen uit het circulerende systeemwater (pH = 5,0) in een buis van 1,5 mL wanneer ze worden gedechorioneerd en een specifieke ontwikkelingsperiode bereiken. Voeg 1 mL vers bereide 4% PFA-oplossing toe bij kamertemperatuur (RT).
- Hydratatie en spijsvertering
- Hydrateer embryo's die in 100% methanol zijn bewaard met behulp van een zeef met nylon gaas aan de onderkant om embryo's in de putten van 12 putplaten sequentieel te wassen met een reeks van 75%, 50% en 25% methanol (verdund in PBST) gedurende 5 min per stuk. Was de embryo's met PBST 3x gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg 50 μL proteinase K (10 mg/mL) toe aan de buis met embryo's en volg de spijsverteringstijd in tabel 2 bij RT.
- Verwijder de proteinase K en was embryo's met PBST 3x gedurende 5 minuten bij RT.
- Probe-hybridisatie en postfixatie
- Zet de sondes ontworpen volgens de mRNA-sequenties van elk gen in een hybridizatinesysteem van 40 °C totdat het neerslag is opgelost; die ~10 min. Meng de doelsondes van bv (XM_007116.7) en nog eens twee belangrijke genen die betrokken zijn bij de vroege mesoderm endotheial voorlopervorming (hier, aplnr [NM_001075105.1] en nrp1a [NM_001040326.1]) in een 1,5 mL-buis bij een verhouding van 50:1:1.
- Voeg 50-100 μL gemengde doelsondes toe aan elke buis met embryo's en broed 's nachts uit bij 40 °C.
LET OP: Voorgemixte sondes moeten voorverwarmd worden tot 40 °C en voor gebruik tot RT worden gekoeld. - Bereid een 0,2x zout natriumcitraatoplossing voor met Tween-20 (SSCT): los 175,3 g NaCl en 88 g natriumcitraat op in 1 L van dH2O om een 20x SSC-oplossing te verkrijgen. Verdun vervolgens de oplossing 1:100 in dH2O om een 0,2 x SSCT-oplossing te verkrijgen. Verdun tween-20 1:1000 in de 0,2x SSCT-oplossing.
- Breng de gerecyclede sondes naar een nieuwe buis. Was de embryo's in 0,2x SSCT oplossing 3x gedurende 15 minuten bij RT. De gerecyclede sondes kunnen 5x-10x hergebruikt worden.
- Gebruik 4% paraformaldehyde (PFA) om de embryo's 30 minuten vast te stellen bij RT. Was de embryo's in 0,2x SSCT-oplossing 3x voor 15 minuten per stuk bij RT.
LET OP: Het werk van Gross-Thebing et al. suggereert een periode na de vastlegging van 10 min14, maar het werkelijke bedrag moet dienovereenkomstig worden aangepast. Hier hebben we 10 min post-fixatie 3x getest, en de gevoeligheid van DAB-sterven is aanzienlijk beïnvloed. Na onderzoek moet u ervoor zorgen dat 0,5-1,0 uur fixatie de optimale voorwaarde is (een kortere fixatieperiode kan geen duidelijk signaal van het doelRNA produceren en de juiste verlenging van de fixatietijd helpt het signaal te versterken en minder achtergrondgeluid te bieden).
- Sequentiële versterker en label sonde hybridisatie
- Verwijder de SSCT-oplossing en vervang deze door 50 μL Amp 1. Laat de embryo's zich 30 minuten in amp 1 bij 40 °C nestelen. Was vervolgens de embryo's in 0,2x SSCT-oplossing 3x voor 15 minuten per stuk bij RT.
- Verwijder de SSCT-oplossing en voeg 50 μL Amp 2 toe. Laat de embryo's zich gedurende 15 minuten op 40 °C nestelen. Was vervolgens de embryo's in 0,2x SSCT-oplossing 3x voor 15 minuten per stuk bij RT.
- Verwijder de SSCT-oplossing, voeg 50 μL Amp 3 toe en tik op de buis mild. Vervolgens, incubeer de embryo's op 40 °C gedurende 30 min. Was de embryo's in 0,2x SSCT oplossing 3x gedurende 15 minuten per stuk op RT.
- Verwijder de SSCT-oplossing, voeg 50 μL Amp 4 dropwise toe en tik voorzichtig op de buis. Vervolgens, incubeer de embryo's op 40 °C gedurende 15 min. Was de embryo's in 0,2x SSCT 3x gedurende 15 minuten elk bij RT.
- Tegenspertaining en microscopie
- Verwijder de SSCT-oplossing en voeg 50 μL DAPI toe aan elke buis. De embryo's 's nachts incubeer maken bij 4 °C.
- Was de embryo's met PBST en bereid ze voor op beeldvorming met behulp van een 1% laag smeltpunt (LMP) oplossing (1 g LMP opgelost in 100 mL van dH2O) in een petrischaal gevuld met PBST.
- Gebruik een DAB peroxidase substraat kit om het monster te bevlekken. Voeg kleurreagentia A, B en C (elk 50 μL) toe aan 1 mL gedestilleerd water en meng goed om een complete DAB-werkvloeistof te verkrijgen. Voeg de vloeistof toe aan het monster en bedek gedurende 10 minuten.
- Was het monster grondig met PBST na het bevlekken.
- Gebruik een optische microscoop met een fotografische functie voor het beeldvorming van de monsters.
LET OP: Als u later foto's maakt, moeten buizen in aluminiumfolie worden verpakt en bij 4 °C worden opgeslagen.
2. Buisvormingstest
LET OP: De eng mutant en wildtype ECs (control) werden onderscheiden van iPSCs afgeleid van een HHT-patiënt (hier, een 62-jarige vrouwelijke patiënt met terugkerende epistaxis sinds 22 jaar oud, maag-darmbloedingen, longarterioveneuze misvormingen, die een missense eng mutatie in positie c.88T>C van exon 2) en een gezonde donor (zonder eng mutatie), die werden verstrekt door Peking Union Medical College Hospital met goedkeuring van de college research ethics committee.
- Controle en HHT iPSC celculturen
- Voeg een bepaald volume van keldermembraanmatrix (b.v., Matrigel) aan een 6 goed celkweekplaat toe om de bodem van de put te behandelen en de platen voor 1 h bij 37 °C uit te broeden.
LET OP: Bij het eerste gebruik van de keldermembraanmatrix opgeslagen bij -20 °C, incubeer op ijs of in een vorstvrije koelkast van 4 °C tot ontdooid. Verdun vervolgens bij 1:100 in DMEM/F12 en verdeel het verdunningsdier vervolgens in 200 μL-buizen met elk 100 μL. Bewaar de buizen op -20 °C en voorkom herhaaldelijk invriezen en ontdooien. Bij het toevoegen van de verdunde kelder membraan matrix, maak geen bubbels. Na het toevoegen van de verdunde kelder membraan matrix, schud de 6 goed plaat zachtjes met de hand, zodat het gelijkmatig betrekking heeft op de bodem. - Verwijder na het coaten van de plaat de gebruikte keldermembraanmatrixoplossing uit de putten. Voeg vervolgens 2 mL mTeSR1-medium toe aan elke put en bord de iPSC's die uit de laatste passage zijn geoogst op ongeveer 1 x 106 per put.
- Voeg een bepaald volume van keldermembraanmatrix (b.v., Matrigel) aan een 6 goed celkweekplaat toe om de bodem van de put te behandelen en de platen voor 1 h bij 37 °C uit te broeden.
- Generatie en uitbreiding van ECs van iPSCs
- Na ongeveer 4 dagen iPSC-cultuur, wissel het cultuurmedium uit met BEL-medium aangevuld met activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL) en CHIR99021 (1,5 μM). Laat de cellen 3 dagen groeien om mesodermcellen te genereren.
- Vervang het in stap 2.2.1 beschreven medium gedurende 4 dagen door BEL-medium aangevuld met VEGF (50 ng/mL) en SB431542 (10 μM) om vasculaire EC's uit te breiden. Behandel de cellen met hetzelfde medium en dezelfde cultuur voor nog eens 3-4 dagen.
- Gebruik CD31-dynabeads om de volwassen vasculaire ECs te zuiveren: raadpleeg de instructies in de CD31-dynabeads kit, die menselijke CD31-antilichaam koppelt aan magnetische kralen om CD31-moleculen uitgedrukt op ECs te combineren en vervolgens de CD31-positieve cellen te verzamelen door elutiebuffer. Onderhoud en breid de gezuiverde EC's in EC-SFM-medium met VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) en FBS (1%).
- Plating endotheelcellen op matrigel-gecoate platen en microscopie
- Voeg 10 μL keldermembraanmatrix per put toe om de angiogeneseplaten (zie Tabel van Materialen)te coaten en incubeer op 30 min bij 37 °C.
- Oogst endotheelcellen na controle van endotheelmarkeerters CD31 en VE-cadherine met immunofluorescentie kleuring en resuspend ze in endothelial growth medium 2 door herhaaldelijk pipetting. Voeg 50 μL celsuspensie (2 x 105 cellen/mL) per put toe aan de gestolde matrix en broed de cellen 3-5 uur bij 37 °C uit.
LET OP: Vóór het buisvormingsexperiment moeten endotheelmarkeringen worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de juiste fenotype van functionele endotheelcellen wordt. 1 x 104 cel per put is een ideaal getal voor buisvorming. Te veel of te weinig cellen zijn niet bevorderlijk voor buisvorming. Voeg cellen van de zijkant van de schotel toe en raak de keldermembraanmatrix niet aan. Gebruik een lichtmicroscoop in het veld met een hoge vergroting om de cellen te controleren en foto's te maken.
- Kwantitatieve resultaten van buisvorming
- Observeer de resultaten met een microscoop met hoge resolutie en maak foto's van ten minste 10 gebieden voor elke groep om betrouwbare gegevensstatistieken te verkrijgen.
- Onderzoek endotheelbuisvorming: schat de omvang van buisvorming door de totale buislengte, buisaantal en takpunten te inspecteren. Beoordeel en tel het aantal en de lengte van branches met behulp van ImageJ-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele mount in situ hybridisatie is gebaseerd op een principe vergelijkbaar met fluorescentie resonantie energieoverdracht. Het is ontworpen om zowel de gevoeligheid en specificiteit in zebravissen ISH te verbeteren als doelspecifieke signalen te versterken zonder het achtergrondsignaal te beïnvloeden.
In 24 hpf zebrafish embryo's, endoglin is sterk uitgedrukt in de achterste kardinaal ader (PCV), intersegmentale bloedvaten (ISV's), en bloed eilanden3. Het is moeilijk om de kleuringstijd in traditionele chromogene in situ hybridisatie (CISH) te controleren, met niet-positieve signalen die in sommige gebieden voorkomen, zoals dooierzak(figuur 1A). Om de rol van eng in de vroege vasculaire ontwikkeling te onderzoeken, werd een hemogene endotheelmarkeringsmarkering gebruikt (aplnra) evenals een andere endotheelverermarker(nrp1a) om te onderzoeken welk type endotheel werd beïnvloed door eng silencing20. De expressie van aplnra en nrp1a was zwak in 24 hpf embryo's. In vergelijking met het CISH werd het zwakke signaal van de twee genen duidelijk aangetoond in het staartgebied na eng knockdown in WISH (figuur 1B). De knockdown van eng RNA veroorzaakte verminderde expressie van twee soorten endotheelcellen marker genen expressie in een HHT diermodel.
Voordat experimenten op gedifferentieerde IPSC's werden uitgevoerd, werden de cellen geïdentificeerd en bevestigd als EC's. Morfologisch verschenen ze als kasseienvorm. Expressie van endotheelceloppervlak moleculaire markers CD31, CD146, VE-cadherin, en vWF werd bevestigd met IF kleuring21. Na magnetische isolatie met cd31, werd de functionele test uitgevoerd zoals hieronder beschreven.
Hier werd de buisvormingstest uitgevoerd met behulp van de eng mutant en controle iPSC-afgeleide endotheelcellen. Statistische analyse werd uitgevoerd op basis van het aantal, takken en lengtes van buizen. Een nieuwe parameter werd ook geïntroduceerd op basis van eerder werk3, punten van angiogenese, om buisvorming van endotheelcellen weerspiegelen. Uiteindelijk bleek dat eng mutant endotheelcellen minder takken vormden dan controle endotheelcellen, en dat takken in eng mutant endothelial cellen aanzienlijk toegenomen na stimulatie met vasculaire endotheel groeifactor (VEGF) (Figuur 2A,B). De mutatie in eng resulteerde in een defecte vaatbuisvorming.
Figuur 1: Endoglin knockdown verminderde de expressie van endotheelmarkeringen. AA) CISH en WISH werden uitgevoerd om de expressie van endoglin in 24 hpf embryo's (n > 30) te bepalen. Het rode vak vertegenwoordigt het vergrote gebied. Schaalstaven = 200 μm. (B) aplnra en nrp1a expressie door WISH in 24 hpf zebrafish embryo's van de control-MO en eng-MO groep. De rode pijl geeft gebieden aan waar de expressie van deze genen aanzienlijk is afgenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Buisvorming van eng mutant en controle iPSC-VC's. (A) De buisvorming door de vier groepen, waaronder de controlegroep, de besturing + VEGF (controle endotheelcellen + 30 ng/mL VEGF), de eng mutant(eng mutant endotheelcellen) groep, en de eng mutant + VEGF(eng mutant endotheelcellen + 30 ng/mL VEGF) groep. Buisvorming werd beoordeeld en gefotografeerd na 3 uur. Schaalstaven = 100 μm. (B) Kwantitatieve resultaten van buisvorming worden weergegeven. Op het overdekte gebied werden het aantal takken en hun lengte van buizen berekend door Afbeelding J. Foutbalken vertegenwoordigen de SD van de gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten. Een waarde van P werd als statistisch significant beschouwd wanneer *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Embryonale periode | Fixatietijd |
| 4-cellen tot 8 pk | 4 uur |
| 8 pkf tot 24 pk | 1 uur |
| 24 pkf tot 4 dpf | 30 minuten |
Tabel 1: Fixatietijd die nodig is voor verschillende embryonale stadia.
| Embryonale periode | Spijsverteringstijd |
| 4-cellen tot 8 pk | 2 minuten |
| 8 pkf tot 24 pk | 5 minuten |
| 24 pkf tot 4 dpf | 10 minuten |
Tabel 2: Spijsverteringstijd die nodig is voor verschillende embryonale stadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol paste een verbeterd whole-mount in situ RNA analyseplatform toe voor zebravissen en buisvormingstesten op iPSC-ECs afkomstig van een HHT-patiënt. De traditionele ISH-methode vereist een langere experimentele cyclus met extra experimentele stappen. Het protocol heeft een aantal belangrijke verbeteringen, het gebruik van onafhankelijke dubbele Z-sondes en iPSC's afkomstig van een patiënt met HHT die respectievelijk werden toegepast in WISH-tests en buisvorming. Deze verfijningen zijn cruciaal voor het verbeteren van de detectiegevoeligheid in vergelijking met wat wordt waargenomen met traditionele ISH. De uniek ontworpen sondes en doelsignaalversterking maken de detectie van zelden uitgedrukte transcripties mogelijk(aplnra is een slecht uitgedrukt gen in 24 hpf embryo's). Een wijziging is de extra fixatie na sonde hybridisatie. De extra fixatie kan de combinatie van sondes en transcripties verbeteren. DAB-vlekken worden ook toegepast in plaats van fluorescentie-vlekken, omdat bleek dat het moeilijk was om fluorescentievlekken uit te voeren in bepaalde genen met een lage overvloed. Vervolgens werden iPSC's gebruikt voor angiogenese tests, wat de betekenis en de relevantie van dit werk in de kliniek verhoogt. Het genereren van iPSC's vereist strikte cultuurvoorwaarden en vormt een beperking van het protocol.
Enkele kritieke stappen moeten worden gemarkeerd. In de WISH-analyse moet de verteringstijd van zebravisembryo's strikt worden gevolgd overeenkomstig de tekst. Een kortere spijsverteringstijd kan niet garanderen dat de sonde met succes combineert met transcripties. In tegenstelling, langere spijsvertering tijd zal de integriteit van embryo's te vernietigen. In de buisvormingsexperimenten moet de beeldtijd goed worden geregeld. Over het algemeen zullen de endotheelcellen buizen worden binnen 12 uur, maar de buisstructuur heeft de neiging om na 24 uur uiteen te vallen. Het celnummer is ook belangrijk voor buisvorming, omdat een te hoge of te lage celdichtheid kan leiden tot mislukte buisvorming. Als het moeilijk is om endotheelcellen te induceren om buizen te vormen, is het nuttig om het toevoegen van groeifactoren zoals VEGF aan het kweekmedium op te nemen als een positieve controle om het vermogen van ECs om buisvormige structuren te vormen te testen.
Samengevat is de verbeterde WISH-methode beschouwd als een voordelige techniek voor laboratoriumworkflows. Onlangs is onze onderzoeksgroep begonnen met het testen van deze test in klinische monsters. Gezien de hogere gevoeligheid en efficiëntere detectie dan waargenomen in traditionele methoden, deze verbeterde WISH methode houdt belangrijke belofte voor de ontwikkeling en uitvoering van RNA-gebaseerde moleculaire diagnostiek22.
Prestaties van buisvormingstest met behulp van patiënt iPSC-ECs maakt bevestiging van de resultaten van dierstudies mogelijk, evenals identificatie van ziekteverwekkende mutaties van enkel nucleotide polymorfisme in het eng-gen. De combinatie van deze methoden verduidelijkt de rol van eng in vasculaire vorming en houd potentieel in gencorrectie van patiënt iPSC-ECs voor cardiovasculaire celtherapie23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China-stamcel- en translationeel onderzoek [subsidienummer 2016YFA0102300 (aan Jun Yang)];de Nature Science Foundation of China [subsidienummer 81870051, 81670054 (aan Jun Yang)]; het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [subsidienummer 2016-I2M-4-003 (aan Jun Yang)]; de PUMC Youth Found en de Fundamental Research Funds voor de Central Universities [subsidienummer 2017310013 (aan Fang Zhou)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
