Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.
Abstract
התפתחות כלי הדם נקבעת על ידי הביטוי הרציף של גנים ספציפיים, אשר ניתן ללמוד על ידי ביצוע היברידיזציה באתרו הכלאה במהלך שלבים התפתחותיים שונים. כדי לחקור את התפקיד של אנדוגלין (eng) במערך הספינה במהלך ההתפתחות של telangiectasia מדמם תורשתי (hht), המוזולסטינו בתיווך ממוקדת ממוקד של eng ב-דג זברה משמשים לחקר הביטוי הזמני שלה פונקציות משויכות. כאן, כל הר של היברידיזציה באתרו (מאחל) הוא מועסק לניתוח של eng ואת הגנים שלה במורד הזרם של עוברי דג דג זברה. כמו כן, היווצרות צינור הרכבת מבוצעים החולה HHT-נגזר המושרה הנגרמת לתאי גזע מובחנים תאים אנדותל (iPSC-ECs; עם מוטציות eng ). אות ספציפית מערכת הגברה באמצעות הסכום כולו היברידיזציה באתרו – משאלה מספקת ברזולוציה גבוהה יותר ותוצאות הרקע התחתון בהשוואה לשיטות המסורתיות. כדי להשיג אות טוב יותר, הזמן לאחר הקיבעון מותאם ל 30 דקות לאחר הכלאה בדיקה. מכיוון שצביעת הקרינה הפלואורסצנטית אינה רגישה בעוברי הדגים, הוא מוחלף בכתמים משובצת יהלומים. בפרוטוקול זה, HHT המטופל נגזר הקווים iPSC המכיל מוטציה eng מובחנים לתאי האנדותל. לאחר ציפוי צלחת עם מטריקס קרום המרתף עבור 30 דקות ב 37 ° c, ipsc-ecs הם שנזרע כמו דופלקס לתוך בארות ושמרו על 37 ° c עבור 3 h. לאחר מכן, אורך הצינור ומספר הענפים מחושבים באמצעות תמונות מיקרוסקופיים. כך, עם הפרוטוקול המשופר הזה משאלה, זה מראה כי מופחתת ביטוי eng משפיע על היווצרות מחולל שורש בתוך העוברים בדגים. זה מאומת נוספת על ידי היווצרות צינור שפופרת באמצעות iPSC-ECs נגזר מטופל עם HHT. האלה מאשרים לאשר את התפקיד עבור eng בפיתוח כלי דם מוקדם.
Introduction
מוטציה אחת ב eng (CD105) דווחה בחולים עם hht. המוטציה מובילה התפשטות EC מוגברת ומופחתת זרימה-1תיווך ECהתארכות 1,2. כמו כן דווח בעבר כי מחסור ב-ENG מפחית את הביטוי של סמנים אנדותל (כלומר, kdrl, cdh5, hey2) ב דג זברה3. אנדוגלין, המתבטא בעיקר בתאי האנדותל, היא גליקופרוטאין טרנסרפינת ופונקציות כקולטן לשינוי גורם הגדילה β (tgf-β) בני משפחה. הוא מכוון BMP9 קשירה על משטח התא כדי לווסת את הגן במורד הזרם, כולל Id1 ביטוי, כדי לגרום לבידול תא גזע לכיוון ecs4. כך, הגן eng משחק תפקידים חשוביםבתוךvasculogenesis ומחלות כלי דם אנושיים 5,6. בדקנו בעבר את ההשפעות של אנדוגלין מלמטה על היווצרות הספינה בעוברי דגים דג זברה, ואחריו ניתוח של ecs iPSCs-נגזר שנרכשו מחולה hht נושאת מוטציה eng 7. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של המחסור ב-ENG על ביטוי סמן של מחולל קדמון והיווצרות שפופרת, שהיא שיטה הניתנות לכימות למדידת האנגיוגנזה של מבחנה.
כדי ללמוד eng מרחבית הביטוי הזמני, המשאלה מועסק כדי לזהות ביטוי גנים ב vivo8. באתרו היברידיזציה (ISH) היא שיטה של שימוש בבדיקות עם תוויות עם רצפים משלימים של חומצות גרעין היעד (DNA או mRNA) כדי לזהות ולהמחיש את היעד חומצות גרעין כלאיים בדגימה קבועה. התהליך מגביר אותות ביטוי גנים ב vivo והוא משמש כדי לזהות את הביטוי של גנים על ידי מיקרוסקופ. המשאלה היתה בשימוש נרחב בחיות מודל שונות, במיוחד ב דג זברה9. הוא משמש גם כדי לרכוש את הנתונים הבאים: 1) ביטויים מרחביים/זמני גנים, אשר מספקים מידע על פונקציה גנטית וסיווג; ו-2) הביע במפורש סמנים גנים המשמשים בשימוש בתפוקה גבוהה או בסינון מוטציה10.
בדיקות כרומוגניים מושפל בקלות עם כרומוזום מסורתי היברידיזציה באתרו (cish), אשר מביא רעש רקע גבוהואותות לאספציפיים,12. שיטת המשאלה משתמשת בשני בדיקה עצמאית כפולה Z, אשר נועדו לhybridize היעד רצפי RNA. כל בדיקה מכילה רצף 18-25 המשלים ל-RNA היעד ו 14 בסיס הזנב רצף (המשדר כ Z). בבדיקות היעד נעשה שימוש בזוג (כפול Z). שני רצפי הזנב יחד טופס 28 הכלאה בסיס האתר עבור מגבר הקדם, אשר מכיל 20 אתרי מחייב עבור המגבר. המגבר, בתורו, מכיל 20 אתרי קשירה עבור בדיקה התווית והוא יכול תיאורטית להניב עד 8,000 תוויות עבור כל מטרה RNA רצף.
טכנולוגיה מתקדמת זו מאפשרת הגברה זמנית של אותות ודיכוי רקע כדי להשיג הדמיה חד-מולקולות תוך שמירה על מורפולוגיה של רקמות13. שינוי נוסף של שיטות המשאלה מבוסס על מחקר הקודם14, כולל קיבעון נוסף וכתמים מכתים. בתנאי כאן הוא פרוטוקול משאלה משופרת שיכול לעבוד גם אם RNA היעד הוא ירד או מושפל חלקית. היתרונות כוללים כי ניתן להשלימה 24 שעות ללא RNase-ללא תנאים. ניתן גם לזהות אותות בו באמצעות ערוצים מרובים מיעדים מרובים, והתוצאות עקביות ותואמות לתוצאות של פלטפורמות אוטומציה שונות בתפוקה גבוהה.
תוצאות מדגמי בעלי חיים אינם נחוצים לשיקוף התופעה המתרחשת אצל בני האדם. ב-ENG מצויים שני זוגות של ציסטרינס, C30-C207 ו-C53-C182, היוצרים גשרים דיגוניים באזורים היתומים. כדי ללמוד עוד יותר את התפקיד של eng ב-hht חולים, היווצרות tube בחני עם iPSCs נגזר מהחולים hht בוצעו בתאים ללא/עם מוטציות eng (Cys30Arg, C30R)15. לאחר שקוביטה ואח ' דיווח תחילה על היווצרות הצינור בניסוי16, המבנה פותח במספר דרכים. הוא משמש כדי לזהות גורמים אנגיוגנטיים או אנטי-אנגיוגנטיים, להגדיר את מסלולים איתות באנגיוגנזה, ולזהות גנים המסדירים אנגיוגנזה17.
לפני הזמינות של iPSC-ECs המטופל, החוקרים השתמשו ECs תרבותי בעיקר כדי ללמוד angiogensis16. עם זאת, עבור תאי האנדותל, זהו אתגר טכני כדי לשנות גנים אקסוגני עם וירוס, בגלל מספר מעבר מוגבל ECs יכול לעבור. הסיבה לכך היא בקושי מספיק חומר הסלולר כדי לאסוף מכלי הדם או מהניתוח או תורמים שאושרו בהתאמה. עם ההמצאה של טכניקת הדור iPSC ידי שינא יאמאנאקה, ECs האדם נגזר iPSCs יכול לשמש באופן אמין בניסויים מבחנה, כפי שדווח בעבר18.
שימוש ב-ecs התמרה ויראלי עם מספרים מוגבלים ומעברים עשוי להיות מספיק עבור מחקרים איתות, אבל עבור מחקרים פונקציונליים, עדיף ליצור שורות של תא גזע המוטציות pluripotent (או iPSCs או כריסי/Cas9-ממוקד hESCs), ואז להבדיל אותם ל-ecs למחקרים אנגיוגנזה להשתמשבחניהיווצרות שפופרת היווצרות צינור ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה של תאים אנדותל הנושאת מוטציות. פרוטוקול זה מתאר גם את היווצרות הצינורית על צלחת האנגיוגנזה של μ-שקופית, המהווה שיטה קלה, חסכונית ומתוכבת.
הפרוטוקול המופיע להלן מספק שיטה אמינה ומערכתית ללימוד התפקיד של גנים ספציפיים במערך כלי הדם, יחד עם פרטים על תבנית ביטוי vivo ובכמת מחוץ לגוף לצורך דוגמנות מחלות אנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת האתיקה המחקר של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג.
1. כל הר היברידיזציה באתרו
- גידול ורבייה של קו הדגים
- להאכיל ולהעלות את כל מבוגרים דג זברה ב 26-28 ° c בתוך מערכת מידגה מחזורי עם 14 h אור/10 h מחזור כהה עבור כל יום. השתמש ב-AB (פראי-סוג) דג זברה שורות עבור ההליכים הבאים.
- שים שכבה של חלוקי אבן בתחתית תיבת הרבייה כמקלט לביצים. קבוצת דגים הורים ביחס של 2:1 (כלומר, שתי נקבות וזכר אחד) לכל תיבה. תני לדגים הנשיים. להשריץ ליום אחד בסופו של השאיפה, להסיר את הדג ההורה מיידית כדי למנוע מהם לאכול את הביצים.
- להזריק 2 ng של ממורגווראונוס ו 500 pg של mRNA לתוך העוברים בשלב תא אחד באמצעות מערכת הזרקת הסילון באמצעות להשתמש ב מיקרוסקופ (ברצף של אנדוגלין-MOs: 5 '-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3 '; 5-מניעת בקרת האוויר רצף MOs: 5 '-AAACAGACCACATCCTCTTCATCTC-3 ').
- מודזת את הזיטים במי ים חומציים ב -27 ° c עבור כ 48 h.
- איסוף וקיבוע עוברי-דג
- השתמש בצנרת העברת פלסטיק כדי לאסוף 20-40 דג זברה עוברי המים מערכת מחזורי (pH = 5.0) בצינור החמצן של 1.5 mL כאשר הם מעבירים ולהגיע תקופה מסוימת של פיתוח. להוסיף 1 מ ל של הפתרון הראשון המוכן 4% בכיתה בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: התקופה בה נבחר העובר מבוססת על מטרת הניסוי. טבלה 1 מציגה את זמן הקיבוע הנדרש לתקופות עובריים שונות. - הסר את פתרון הקיבעון, לשטוף את העוברים עם תמיסת פוספט באגירה עם רצף-20 (PBST, לדלל 1 מ ל של יצירת רצף לתוך 1000 mL של פתרון PBS) 3x עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- מייבשים את העוברים באמצעות דגירה בסדרה של 25%, 50% ו 75% מתנול (מדולל ב PBST) עבור 5 דקות כל אחד. העברת עוברים אל 100% מתנול עבור 5 דקות ולהחליף עם מתנול טרי. אחסן את העוברים ב-20 ° c עבור לילה או יותר.
- השתמש בצנרת העברת פלסטיק כדי לאסוף 20-40 דג זברה עוברי המים מערכת מחזורי (pH = 5.0) בצינור החמצן של 1.5 mL כאשר הם מעבירים ולהגיע תקופה מסוימת של פיתוח. להוסיף 1 מ ל של הפתרון הראשון המוכן 4% בכיתה בטמפרטורת החדר (RT).
- שחות ועיכול
- עוברים מימה שהשתמרו ב 100% מתנול באמצעות מסננת עם רשת ניילון בתחתית כדי לשטוף את העוברים באופן רציף בבארות של 12 צלחות היטב עם סדרה של 75%, 50%, ו 25% מתנול (מדולל ב PBST) עבור 5 דקות כל אחד. לשטוף את העוברים עם PBST 3 x עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- הוסף 50 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/mL) לתוך הצינור עם העוברים ובצע את זמן העיכול בטבלה 2 ב RT.
- הסרת מפרוטאינאז K ולשטוף עוברים עם PBST 3x עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- הכלאה בדיקה ושלאחר קיבוע
- שים את הבדיקות תוכנן על פי רצפי mRNA של כל הגן במערכת 40 ° c hybridizatin עד הזרז הוא הומס, אשר צריך לקחת ~ 10 דקות. לערבב את הגששים היעד של למשל (XM_007116 .7) ו שני גנים חשובים נוספים לערב את היווצרות הקדומה מזוטאלית באנדובית (כאן, aplnr [NM_001075105 0.1] ו nrp1a [NM_001040326 0.1]) בצינור 1.5 mL ביחס 50:1:1.
- הוסף 50-100 μL של בדיקה מעורבת היעד לתוך הצינור כל עם העוברים, ולאחר מכן דגירה לילה ב 40 ° c.
הערה: הבדיקות המעורבות מראש חייב להיות מחומם מראש עד 40 ° צ' ו מקורר כדי RT לפני השימוש. - הכינו תמיסת מלח ציטראט מלוחים של 0.2 x עם רצף-20 (SSCT): התמוססות 175.3 g של הנרוג ו-88 g של נתרן ציטראט ל-1 L של dH2O כדי לקבל פתרון לפני 20 x. לאחר מכן, דלל את הפתרון 1:100 ב-dH2O כדי לקבל פתרון 0.2 x SSCT. לדלל את רצף-20 1:1000 בתמיסה 0.2 x SSCT.
- העבר את הבדיקות הממוחזרים. לצינור חדש לשטוף את העוברים ב 0.2 x SSCT פתרון 3x עבור 15 דקות כל אחד ב RT. בבדיקות ממוחזר ניתן להשתמש מחוזר 5x-10x.
- השתמש 4% פאראפורמלדהיד (בחצי השני) כדי לתקן את העוברים עבור 30 דקות ב RT. לשטוף את העוברים ב 0.2 x SSCT פתרון 3x עבור 15 דקות כל אחד ב RT.
הערה: העבודה של גרוס-Thebing ואח ' מציעה תקופה שלאחר קיבוע של 10 דקות14, אך הסכום בפועל חייב להיות מותאם בהתאם. כאן, בדקנו 10 דקות לאחר קיבוע 3x, ואת הרגישות של מוות לאחר המוות מושפע באופן משמעותי. לאחר חקירת, להבטיח כי 0.5-1.0 h של קיבעון הוא המצב האופטימלי (זמן קיבעון קצר יותר לא יכול לייצר אות ברור מן RNA היעד, ואת השלוחה המתאימה של זמן הקיבעון מסייע לחזק את האות ולספק פחות רעש הרקע).
- הכלאה בדיקה רציפה של מגבר ותווית
- הסר את הפתרון SSCT והחלף עם 50 μL של Amp 1. לאפשר לעוברים להתיישב Amp 1 ב 40 ° c עבור 30 דקות. אז, לשטוף את העוברים ב 0.2 x SSCT פתרון 3x עבור 15 דקות כל אחד ב RT.
- הסר את הפתרון SSCT ולהוסיף 50 μL של Amp 2. אפשר לעוברים להתיישב ב-40 ° c במשך 15 דקות. אז, לשטוף את העוברים ב 0.2 x SSCT פתרון 3x עבור 15 דקות כל אחד ב RT.
- הסר את הפתרון SSCT, להוסיף 50 μL של Amp 3 ולהקיש על צינור במתינות. ואז, הדגירה של העוברים ב 40 ° c עבור 30 דקות. לשטוף את העוברים ב 0.2 x SSCT פתרון 3x עבור 15 דקות כל אחד ב RT.
- הסר את הפתרון SSCT, להוסיף 50 μL של Amp 4 dropwise, ובזהירות להקיש על השפופרת. לאחר מכן, הדגירה של העוברים ב 40 ° c עבור 15 דקות. לשטוף את העוברים ב 0.2 x SSCT 3x עבור 15 דקות כל אחד ב RT.
- כתמים ומיקרוסקופיה
- הסר את הפתרון SSCT והוסף 50 μL של DAPI לכל צינור. מודיית את העוברים לילה ב 4 ° c.
- לשטוף את העוברים עם PBST ולהכין אותם הדמיה באמצעות 1% נמוך נקודת התכה (LMP) פתרון (1 גרם LMP מומס 100 mL של dH2O) בצלחת פטרי מלא pbst.
- השתמש ערכת המצע peroxidase להכתים את הדגימה. הוספת ריאגנטים צבע A, B, ו-C (50 μL כל אחד) ל 1 מ ל של מים מזוקקים ומערבבים היטב כדי להשיג נוזל מלאה לעבוד הנוזלים. מוסיפים את הנוזל לדגימה ומכסים במשך 10 דקות.
- לשטוף את הדגימה ביסודיות עם PBST לאחר הצביעת.
- השתמש במיקרוסקופ אופטי עם פונקציה מצולמות לדימות הדגימות.
הערה: אם לקיחת תמונות מאוחר יותר, הצינורות צריכים להיות עטוף רדיד אלומיניום ומאוחסן ב 4 ° c.
2. שיטת היווצרות הצינור
הערה: המוטציה eng סוג ecs (שליטה) הובלו מ iPSCs נגזר מחולה hht (כאן, a 62 בן החולה הנשי עם אפיסטסיס חוזרות מאז 22 שנים, דימום במערכת העיכול, מומים העורקים הריאתי, נושאת מוטציה מוטעית eng במיקום c. 88t > c של אקסון 2) ותורם בריא (ללא מוטציה eng ), אשר סופקו על ידי אוניברסיטת פקין המכללה לרפואה באוניברסיטת באמצעות אישור ועדת האתיקה של
- שליטה ותרביות תאים של HHT iPSC
- להוסיף נפח מסוים של מטריצת קרום המרתף (למשל, מטריצות) עד 6 היטב התרבות תא לוחית לכסות את החלק התחתון של הבאר ומודקת את הצלחות 1 h ב 37 ° c.
הערה: כאשר הראשון באמצעות מטריקס קרום המרתף מאוחסן ב-20 ° c, מודדת על הקרח או ב-כפור חינם 4 ° c מקרר עד להפשיר. לאחר מכן, לדלל ב 1:100 Dמאמ/F12, לאחר מכן להפיץ את דילול לתוך 200 μL צינורות המכילים 100 μL כל אחד. לאחסן את הצינורות ב-20 ° c ולהימנע הקפאה חוזרת והפשרה. כאשר מוסיפים את מטריצת קרום המרתף מדולל, לא ליצור בועות. לאחר הוספת את מטריצה מדולל ממברנה קרום, לנענע את 6 צלחת טוב בעדינות ביד כך שהוא מכסה באופן שווה את החלק התחתון. - לאחר ציפוי הצלחת, להסיר את השימוש במרתף ממברנה פתרון מטריקס מבארות. לאחר מכן, להוסיף 2 מ ל של mTeSR1 בינוני לתוך כל הבאר, ואת הצלחת iPSCs קצרו מן המעבר האחרון בערך 1 x 106 לכל טוב.
- להוסיף נפח מסוים של מטריצת קרום המרתף (למשל, מטריצות) עד 6 היטב התרבות תא לוחית לכסות את החלק התחתון של הבאר ומודקת את הצלחות 1 h ב 37 ° c.
- דור והתרחבות של ECs מ-iPSCs
- לאחר כ 4 ימים של התרבות iPSC, להחליף את מדיום התרבות עם BEL בינונית בתוספת הפעילות A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL), ו CHIR99021 (1.5 μM). לגדל את התאים 3 ימים כדי לייצר תאים מזועור.
- החלף את המדיום המתואר בשלב 2.2.1 עם בל בינונית שיושלם עם ה50 והכל (10 μM) במשך 4 ימים כדי להרחיב את ECs נימי הדם. לטפל בתאים עם בינוני ותרבות זהה לעוד 3-4 ימים.
- השתמש CD31-dynabeads כדי לטהר את ECs בוגרת כלי דם: להפנות את ההוראות בערכה CD31-dynabeads, אשר מקשרת את הנוגדן האנושי CD31 עם חרוזים מגנטיים לשלב CD31 מולקולות מבוטא ECs, לאחר מכן לאסוף את התאים CD31-חיוביים על ידי מאגר הימנעות. לשמור ולהרחיב את ECs מטוהרים במדיום EC-SFM המכיל VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL), ו FBS (1%).
- תאי ציפוי מצופי מטריצות ומיקרוסקופיה
- הוסף 10 μL של מטריצת קרום המרתף לציפוי לוחות האנגיוגנזה (ראה טבלת חומרים) ו-דגירה ב 30 דקות ב 37 ° c.
- המסיק תאים אנדותל לאחר בדיקת סמנים אנדותל CD31 ו-VE-קדהרין עם immunofluorescence מכתים ולהשעות אותם במדיום צמיחה אנדותל 2 על ידי ליטוף שוב ושוב. הוסף 50 μL של השעיית תא (2x 10 תאים /mL) לכל טוב על המטריצה מתחזק ו הדגירה התאים עבור 3-5 h ב 37 ° c.
הערה: לפני ניסוי היווצרות הצינור, סמנים אנדותל צריך להיבדק כדי לוודא את הפנוטיפ הנכון של תאים אנדותל פונקציונלי. 1 x 104 תא לבאר הוא מספר אידיאלי עבור היווצרות הצינור. רבים מדי או יותר מדי תאים אינם מסייעות היווצרות צינור. להוסיף תאים מהצד של המנה ולא לגעת מטריקס קרום המרתף. השתמש במיקרוסקופ אור בשדה הגדלה גבוהה כדי לבדוק את התאים ולצלם.
- התוצאות הכמותיות של היווצרות הצינור
- בדוק את התוצאות בעזרת מיקרוסקופ עם רזולוציה גבוהה וצלם לפחות 10 אזורים עבור כל קבוצה כדי לקבל סטטיסטיקת נתונים אמינה.
- לבחון את היווצרות הצינור האנדותל: לאמוד את היקף היווצרות הצינור על-ידי בדיקת אורך הצינור הכולל, מספר הצינורית ונקודות ההסתעפות. העריכו וספרו את המספר והאורך של הסניפים באמצעות תוכנת ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כל הר היברידיזציה באתרו מבוסס על עיקרון דומה העברת אנרגיה התהודה הפלואורסצנטית. הוא נועד לשפר את הרגישות והספציפיות ביותר בדגים, כמו גם להגביר אותות ספציפיים למטרה מבלי להשפיע על אות הרקע.
בשנת 24 העוברים עוברי דגים, אנדוגלין מתבטא במידה רבה בווריד הקרדינל האחורי (pcv), כלי הקיבול (isv), ואיי הדם3. קשה לשלוט על זמן מכתים בתוך כרומוגניים מסורתיים היברידיזציה באתרו (CISH), עם אותות לא חיוביים המתרחשים באזורים מסוימים, כגון שק חלמון (איור 1א). כדי לחקור את התפקיד של eng בפיתוח כלי דם מוקדם, היה בשימוש סמן אנדותל הומוגניים (aplnra), כמו גם סמן מחולל קדמון נוסף (nrp1a) כדי לבחון איזה סוג של אנדותל היה מושפע eng השתקה20. הביטוי של aplnra ו nrp1a היה חלש ב 24 עוברי hpf. לעומת CISH, האות החלשה משני הגנים היה בבירור הפגינו באזור הזנב לאחר האנג ' ל ברצון (איור 1B). הנוק-אין של eng RNA גרם ביטוי מופחת של שני סוגים של תאים אנדותל לסמן גנים ביטוי במודל חיה hht.
לפני ניהול ניסויים על iPSCs הבדיל, התאים זוהו ואושרו כ-ECs. מורורפולוגית, הם נראו כצורת האבן. ביטוי של משטח תא אנדותל מולקולרי סמנים CD31, CD146, VE-קדהרין, ו vWF אושרה עם צביעת IF21. לאחר בידוד מגנטי המבוסס על CD31, השיטה הפונקציונלית נערכה כמתואר להלן.
כאן, שיטת היווצרות הצינורית בוצעה באמצעות החשבונאי הeng ושליטה בתאי האנדותל של ipsc. אנליזה סטטיסטית בוצעה על בסיס מספר, ענפים, ואורכי צינורות. פרמטר הרומן הוצג גם בהתבסס על העבודה הקודמת3, נקודות אנגיוגנזה, על מנת לשקף את היווצרות הצינור של תאי האנדותל. בסופו של דבר, התגלה כי תאי מוטציה אנדותל של המוטציות יצרו פחות ענפים מאשר לשלוט בתאי האנדותל, ושענפים בתאי מוטציה של מוטציות באופן משמעותי גדלו לאחר גירוי בכלי הדם של מקדם הגידול האנטי- וסקולרית (באיור 2א, ב). המוטציה ב- eng הביאה להיווצרות צינור פגום.
איור 1: אנגלין מנוק הקטן את הביטוי של סמנים אנדותל. (א) cish והמשאלה בוצעו כדי לקבוע את הביטוי של אנדוגלין ב 24 העוברים (n > 30). התיבה האדומה מייצגת את האזור המורחב. קנה מידה ברים = 200 μm. (ב) aplnra ו nrp1a ביטוי על ידי מאחל ב 24 hpf דג זברה עוברי שליטה-mo ו- eng-mo הקבוצה. החץ האדום מציין אזורים שבהם הביטוי של גנים אלה הופחת באופן משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: היווצרות הצינור של מוטציה eng הבקרה Ipsc-ecs. (א) המערך הצינור על ידי ארבע הקבוצות, כולל קבוצת הביקורת, הפקד + השליטה בתאי האנדותל + 30 ng/mL, החשבונאי הeng (תאי מוטציהבאנגלית ) הקבוצה, ו- eng מוטציה + וואג (בתאימוטציה מוטאלתל של כדוריות + 30 ng/mL הקבוצה). היווצרות צינור הוערך וצילם לאחר 3 h. סולם ברים = 100 μm. (ב) תוצאות כמותית של היווצרות צינור מוצגים. באזור המכוסה מספר הענפים ואורך הצינורות שלהם חושבו על ידי תמונה J. קווי שגיאה מייצגים את ה-SD של ערכי ממוצע משלושה ניסויים עצמאיים. ערך P נחשב משמעותי סטטיסטית כאשר * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| התקופה העובריים | זמן קיבעון |
| 4-תאים כדי 8 hpf | 4 שעות |
| 8 hpf כדי 24 hpf | 1 שעות |
| 24 hpf עד 4 dpf | . שלושים דקות |
טבלה 1: זמן קיבוע נדרש עבור שלבים עובריים שונים.
| התקופה העובריים | זמן העיכול |
| 4-תאים כדי 8 hpf | . שתי דקות |
| 8 hpf כדי 24 hpf | . חמש דקות |
| 24 hpf עד 4 dpf | . עשר דקות |
שולחן 2: זמן העיכול הנדרש עבור שלבים עובריים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה הוחל שיפור משופר הר הפלטפורמה באתרו של ה-RNA פלטפורמת היווצרות שפופרת של דג ומערכת צינור על iPSC-ECs נגזר מחולה HHT. שיטת ISH המסורתית מחייבת מחזור ניסיוני ארוך יותר עם צעדים ניסיוניים נוספים. הפרוטוקול יש כמה שיפורים חשובים, השימוש של בדיקה עצמאית כפולה Z ו iPSCs נגזר ממטופל עם hht שהוחלו ב-הלוואי בחני והיווצרות הצינור, בהתאמה. ליטושים אלה הם חיוניים לשיפור רגישות הגילוי לעומת מה שנצפה עם ISH המסורתית. הבדיקות שעוצבו באופן ייחודי והגברה אותות היעד מאפשרים זיהוי של תעתיקים המובטאים לעתים נדירות (aplnra הוא גן מבוטא בצורה גרועה ב -24 עוברי המשך). שינוי אחד הוא הקיבעון הנוסף. לאחר הכלאה בדיקה הקיבעון הנוסף יכול לשפר את השילוב של הבדיקות והתעתיקים. צביעת המריחה מוחלת גם במקום להכתים את הקרינה הפלואורסצנטית, משום שנמצא כי היה קשה לבצע כתמים פלואורסצנטית בגנים מסוימים שפע. לאחר מכן, iPSCs שימשו לאנגיוגנזה, המגביר את המשמעות והרלוונטיות של הקליניקה בעבודה זו. הדור של iPSCs דורש תנאי תרבות קפדניים ומייצג הגבלה של הפרוטוקול.
יש להדגיש חלק מהשלבים הקריטיים. בניתוח משאלה, יש לעקוב אחר זמן העיכול של עוברי הדגים, בהתאמה קפדנית עם הטקסט. זמן עיכול קצר לא יכול להבטיח כי החללית משלבת עם תעתיקים בהצלחה. לעומת זאת, זמן העיכול המורחב יהרוס את שלמות העוברים. בניסויי היווצרות הצינור, תזמון ההדמיה צריך להיות מבוקר היטב. בדרך כלל, תאי האנדותל יהפכו לצינורות בתוך 12 שעות אבל המבנה הצינורי נוטה להתפרק אחרי 24 שעות. מספר התא חשוב גם עבור היווצרות צינור, כמו צפיפות התא כי הוא גבוה מדי או נמוך מדי יכול להוביל היווצרות צינור כושל. אם קשה לגרום לתאי האנדותל ליצור צינורות, מומלץ לכלול הוספת גורמי גדילה כגון מדיום התרבות כפקד חיובי כדי לבדוק את היכולת של ECs ליצור מבנים צינורי.
לסיכום, שיטת המשאלה המשופרת נחשבה לטכניקת יתרון עבור זרימות עבודה מעבדתיות. לאחרונה, קבוצת המחקר שלנו החלה לבחון את הבחינה הזאת בדגימות קליניות. בהתחשב רגישות גבוהה יותר וזיהוי יעיל יותר מאשר נצפתה בשיטות מסורתיות, זו שיטת משאלה משופרת מחזיקה הבטחה משמעותית לפיתוח ויישום של מבוססי RNA אבחון מולקולרי22.
ביצועי שיטת היווצרות הצינור באמצעות iPSC-ECs החולה מאפשר אישור של תוצאות מחקרי בעלי חיים, כמו גם זיהוי של מוטציות גרימת מחלות מפולימורפיזם יחיד בתוך הגן הeng . השילוב של שיטות אלה מבהיר את התפקיד של eng ביצירת כלי דם ולהחזיק פוטנציאל תיקון גנטי של החולה ipsc-ecs לטיפול בתאי קרדיו23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר ופיתוח של המפתח הלאומי של סין, תאי גזע ומחקר טרנסלtional [מספר 2016YFA0102300 (כדי יוני יאנג)]; הקרן למדעי הטבע של סין [גרנט מספר 81870051, 81670054 (ליוני יאנג)]; קרן חדשנות מצלמות למדעי הרפואה (CIFMS) [גרנט מספר 2016-I2M-4-003 (כדי יוני יאנג)]; הנוער PUMC נמצא ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות [מספר 2017310013 (לפאנג ג'ואו)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
