Summary
Apresentado aqui é um protocolo para análise de hibridização de RNA in situ in situ em zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de células-tronco derivadas do paciente para estudar o papel da endoglina na formação vascular.
Abstract
O desenvolvimento vascular é determinado pela expressão sequencial de genes específicos, que podem ser estudados realizando ensaios de hibridização in situ em zebrafish durante diferentes estágios de desenvolvimento. Para investigar o papel da endoglin(eng) na formação de vasos durante o desenvolvimento da telangiectasia hemorrágica hereditária (HHT), o knockdown direcionado mediado por morfina de eng em zebrafish é usado para estudar sua expressão temporal e funções associadas. Aqui, a hibridização de RNA in situ (WISH) é empregada para a análise de eng e seus genes a jusante em embriões de zebrafish. Além disso, os ensaios de formação de tubos são realizados em células endoteliais induzidas pelo paciente HHT (iPSC-ECs; com mutações eng). Um sistema específico de amplificação de sinal usando toda a quantidade In Situ Hybridization – WISH fornece maior resolução e resultados de fundo mais baixos em comparação com os métodos tradicionais. Para obter um sinal melhor, o tempo de pós-fixação é ajustado para 30 minutos após a hibridização da sonda. Como a coloração da fluorescência não é sensível em embriões de zebrafish, ela é substituída por coloração diaminobezidina (DAB) aqui. Neste protocolo, as linhas iPSC derivadas do paciente HHT contendo uma mutação eng são diferenciadas em células endoteliais. Depois de revestir uma placa com matriz de membrana de porão por 30 min a 37 °C, os iPSC-CE são semeados como monocamadas em poços e mantidos a 37 °C por 3h. Em seguida, o comprimento do tubo e o número de ramos são calculados usando imagens microscópicas. Assim, com este protocolo WISH melhorado, mostra-se que a expressão eng reduzida afeta a formação de progenitores endoteliais em embriões de zebrafish. Isso é confirmado ainda por ensaios de formação de tubos utilizando iPSC-CEs derivados de um paciente com HHT. Esses ensaios confirmam o papel do eng no desenvolvimento vascular precoce.
Introduction
Uma única mutação no eng (CD105) foi relatada em pacientes com HHT. A mutação leva ao aumento da proliferação da CE e à redução do alongamento da CE mediada pelo fluxo1,,2. Também foi relatado anteriormente que a deficiência de ENG reduz a expressão de marcadores endoteliais (ou seja, kdrl, cdh5, hey2) em zebrafish3. Endoglin, expressa principalmente em células endoteliais, é uma glicoproteína transmembrana e funciona como um co-receptor para transformar o fator de crescimento β (TGF-β) membros da família. Ele direciona a ligação BMP9 na superfície celular para regular o gene a jusante, incluindo a expressão Id1, para induzir a diferenciação de células-tronco em relação aos CE4. Assim, o gene eng desempenha papéis importantes na vasculogênese e na doença vascular humana5,6. Examinamos anteriormente os efeitos da derrubada de endoglin na formação de vasos em embriões de zebrafish, seguido pela análise de CEs derivados de iPSCs adquiridos de um paciente com HHT com uma mutação eng 7. Este protocolo demonstra os efeitos da deficiência de ENG na expressão do marcador progenitor endotelial e na formação de tubos, que é um método quantificável para medir angiogênese in vitro.
Para estudar a expressão espacial e temporal, o WISH é empregado para detectar a expressão genética in vivo8. A hibridização in situ (ISH) é um método de uso de sondas rotuladas com sequências complementares de ácidos nucleicos-alvo (DNA ou mRNA) para detectar e visualizar híbridos de ácido nucleico alvo em uma amostra fixa. O processo amplifica sinais de expressão genética in vivo e é usado para detectar a expressão de genes por microscopia. A WISH tem sido amplamente utilizada em vários animais modelo, especialmente em zebrafish9. Também é usado para adquirir os seguintes dados: 1) padrões de expressão espacial/temporal genética, que fornecem informações sobre a função e classificação genética; e 2) marcadores genéticos expressos especificamente que são usados em drogas de alta produtividade ou triagem mutante10.
As sondas cromogênicas são facilmente degradadas com o cromossomo tradicional in situ hibridização (CISH), o que resulta em alto ruído de fundo e sinais inespecíficos11,12. O método WISH usa duas sondas Z duplas independentes, que são projetadas para hibridizar para atingir sequências de RNA. Cada sonda contém uma sequência de 18-25 complementar ao RNA alvo e uma sequência de cauda base de 14 (conceitualizada como Z). As sondas-alvo são usadas em um par (duplo Z). As duas sequências de cauda juntas formam um local de hibridização de 28 bases para o pré-amplificador, que contém 20 locais de ligação para o amplificador. O amplificador, por sua vez, contém 20 sites de vinculação para a sonda de etiqueta e pode teoricamente render até 8.000 etiquetas para cada sequência de RNA de destino.
Esta tecnologia avançada facilita a amplificação simultânea de sinal e a supressão de fundo para alcançar a visualização de molécula única, preservando a morfologia tecidual13. Outra modificação dos métodos WISH baseia-se em pesquisas anteriores14, incluindo fixação extra e coloração da DAB. Desde aqui está um protocolo WISH melhorado que pode funcionar mesmo que o RNA alvo seja parcialmente diminuído ou degradado. As vantagens incluem que ele pode ser concluído em 24 horas sem condições livres de RNase. Os sinais também podem ser detectados simultaneamente através de vários canais de vários alvos, e os resultados são consistentes e compatíveis com resultados de diferentes plataformas de automação de alto rendimento.
Os resultados de modelos animais não refletem o mesmo fenômeno que ocorre em humanos. A ENG contém dois pares de cisteínas conservadas, C30-C207 e C53-C182, que formam pontes de dissulfeto em regiões órfãs. Para estudar melhor o papel do eng em pacientes com HHT, ensaios de formação de tubos com iPSCs derivados de pacientes com HHT têm sido realizados em células sem/com mutações eng (Cys30Arg, C30R)15. Depois que Kubota et al. relataram pela primeira vez o experimento de formação detubos 16,o ensaio foi desenvolvido de várias maneiras. Tem sido usado para identificar fatores angiogênicos ou antiangiogênicos, definir as vias de sinalização na angiogênese e identificar genes que regulam a angiogênese17.
Antes da disponibilidade de iPSC-CE derivados do paciente, os pesquisadores usavam eCs principalmente cultos para estudar angiogense16. No entanto, para as células endoteliais, é um desafio técnico transduir genes exógenos com um vírus, devido ao número de passagem limitado que as CEs podem sofrer. Isso porque não há material celular suficiente para ser coletado de vasos humanos, seja de cirurgia ou doadores aprovados. Com a invenção da técnica de geração iPSC por Shinya Yamanaka, os CEs humanos derivados de iPSCs podem ser usados de forma confiável em experimentos in vitro, como relatado anteriormente18.
O uso de CEs transduzidas viralmente com números e passagens limitadas pode ser suficiente para estudos de sinalização, mas para estudos funcionais, é melhor gerar linhas de células-tronco pluripotentes mutantes, (iPSCs ou hESCs alvo CRISPER/Cas9), em seguida, diferenciá-los em CEs para estudos de angiogênese que usam ensaios de formação de tubos19. A formação de tubos pode ser usada para avaliar a função das células endoteliais que carregam mutações. Este protocolo também descreve a formação de tubos em uma placa de angiogênese de μ-slide, que é um método fácil, econômico e reprodutível.
O protocolo abaixo fornece um método confiável e sistêmico para estudar o papel de genes específicos na formação vascular, juntamente com detalhes para o padrão de expressão in vivo e quantificação funcional in vitro para modelagem de doenças humanas.
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Protocol
Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang.
1. Hibridização total in situ
- Criação e reprodução da linha zebrafish
- Alimente e levante todos os zebrafish adultos a 26-28 °C em um sistema de aquicultura recirculante com 14 h de ciclo escuro de luz/10h para cada dia. Use linhas de zebrafish AB (tipo selvagem) para os seguintes procedimentos.
- Coloque uma camada de pedras no fundo da caixa de reprodução como um abrigo para ovos. Peixe parental em grupo na proporção de 2:1 (ou seja, duas fêmeas e um macho) em cada caixa. Deixe a fêmea desovar por 1 dia. No final da desova, remova os peixes-mãe imediatamente para evitar que eles comam os ovos.
- Injete o 2 ng de morfolnos e 500 pg de mRNA em embriões de estágio de uma célula usando o sistema de injeção Femto Jet sob um microscópio (sequência endoglin-MOs: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; 5-mispair control MOs sequência: 5'-AAACAGACCACATCCCTCTC-3').
- Incubar as zigotes em água do mar ácido a 27 °C por aproximadamente 48 h.
- Coleta e fixação de embriões de zebrafish
- Use uma pipeta de transferência plástica para coletar 20-40 embriões de zebrafish da água do sistema circulante (pH = 5,0) em um tubo de 1,5 mL quando eles são descorrioados e atingem um período específico de desenvolvimento. Adicione 1 mL de solução PFA de 4% recém-preparada à temperatura ambiente (RT).
NOTA: O período em que o embrião escolhido baseia-se no propósito do experimento. A Tabela 1 mostra o tempo de fixação necessário para diferentes períodos embrionários. - Remova a solução de fixação, lave embriões com solução tamponada com fosfato com Tween-20 (PBST, diluir 1 mL de Interpol em 1000 mL de solução PBS) 3x por 5 min cada na RT.
- Desidratar os embriões através da incubação em uma série de 25%, 50% e 75% de metanol (diluído em PBST) por 5 min cada. Transfira embriões para 100% metanol por 5 min e substitua por metanol fresco. Armazene os embriões a -20 °C durante a noite ou mais.
- Use uma pipeta de transferência plástica para coletar 20-40 embriões de zebrafish da água do sistema circulante (pH = 5,0) em um tubo de 1,5 mL quando eles são descorrioados e atingem um período específico de desenvolvimento. Adicione 1 mL de solução PFA de 4% recém-preparada à temperatura ambiente (RT).
- Hidratação e digestão
- Hidrate os embriões preservados em 100% de metanol usando uma peneira com malha de nylon na parte inferior para lavar sequencialmente embriões nos poços de 12 placas de poço com uma série de 75%, 50% e 25% de metanol (diluído em PBST) por 5 min cada. Lave os embriões com PBST 3x por 5 min cada na RT.
- Adicione 50 μL de proteinase K (10 mg/mL) no tubo com embriões e siga o tempo de digestão na Tabela 2 em RT.
- Remova a proteína K e lave os embriões com PBST 3x por 5 min cada na RT.
- Hibridização da sonda e pós-fixação
- Coloque as sondas projetadas de acordo com as sequências de mRNA de cada gene em um sistema hibridizatina de 40 °C até que o precipitado seja dissolvido, que devem levar ~10 min. Misture as sondas-alvo de por exemplo (XM_007116,7) e dois genes adicionais importantes envolvem na formação progenitora endotheial do mesoderm (aqui, aplnr [NM_001075105.1] e nrp1a [NM_001040326.1]) em um tubo de 1,5 mL a uma proporção de 50:1:1.
- Adicione 50-100 μL de sondas alvo mistas em cada tubo com embriões e, em seguida, incubar durante a noite a 40 °C.
NOTA: As sondas pré-misturadas devem ser pré-aquecidas a 40 °C e resfriadas para RT antes de usar. - Prepare uma solução de citrato de sódio salino de 0,2x com Tween-20 (SSCT): dissolva 175,3 g de NaCl e 88 g de citrato de sódio em 1 L de dH2O para obter uma solução SSC de 20x. Em seguida, diluir a solução 1:100 em dH2O para obter uma solução 0,2 x SSCT. Diluir Tween-20 1:1000 na solução SSCT 0.2x.
- Transfira as sondas recicladas para um novo tubo. Lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 min cada na RT. As sondas recicladas podem ser reutilizadas 5x-10x.
- Use 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar os embriões por 30 minutos na RT. Lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 min cada na RT.
NOTA: O trabalho de Gross-Thebing et al. sugere um período pós-fixação de 10 min14,mas o valor real deve ser ajustado em conformidade. Aqui, testamos 10 min após a fixação 3x, e a sensibilidade da morte da DAB é significativamente influenciada. Após a investigação, certifique-se de que 0,5-1.0h de fixação é a condição ideal (um período de fixação mais curto não pode produzir um sinal claro do RNA alvo, e a extensão adequada do tempo de fixação ajuda a fortalecer o sinal e fornecer menos ruído de fundo).
- Hibridização do amplificador e da sonda de etiquetas sequenciais
- Remova a solução SSCT e substitua por 50 μL de Amp 1. Deixe os embriões se instalarem no Amp 1 a 40 °C por 30 min. Em seguida, lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 minutos cada na RT.
- Remova a solução SSCT e adicione 50 μL de Amp 2. Deixe os embriões se estabelecerem a 40 °C por 15 minutos. Em seguida, lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 minutos cada na RT.
- Remova a solução SSCT, adicione 50 μL de Amp 3 e toque levemente no tubo. Em seguida, incubar os embriões a 40 °C por 30 min. Lave os embriões em 0,2x solução SSCT 3x por 15 min cada na RT.
- Remova a solução SSCT, adicione 50 μL de Amp 4 dropwise e toque cuidadosamente no tubo. Em seguida, incubar os embriões a 40 °C por 15 min. Lave os embriões em 0,2x SSCT 3x por 15 min cada na RT.
- Contratensão e microscopia
- Remova a solução SSCT e adicione 50 μL de DAPI a cada tubo. Incubar os embriões durante a noite a 4 °C.
- Lave os embriões com PBST e prepare-os para imagem usando uma solução de 1% de baixo ponto de fusão (LMP) (1 g de LMP dissolvida em 100 mL de dH2O) em uma placa de Petri cheia de PBST.
- Use um kit de substrato de peroxidase DAB para manchar a amostra. Adicione os reagentes de cor A, B e C (50 μL cada) a 1 mL de água destilada e misture bem para obter um fluido de trabalho DAB completo. Adicione o fluido ao espécime e cubra por 10 minutos.
- Lave o espécime cuidadosamente com PBST após a coloração.
- Use um microscópio óptico com uma função fotográfica para a imagem das amostras.
NOTA: Se tirar imagens posteriormente, os tubos devem ser embrulhados em papel alumínio e armazenados a 4 °C.
2. Ensaio de formação de tubos
NOTA: Os ECs eng mutante e wildtype (controle) foram diferenciados dos iPSCs derivados de um paciente HHT (aqui, paciente do sexo feminino de 62 anos com epistaxis recorrentes desde 22 anos de idade, sangramento gastrointestinal, malformações arteriovenosas pulmonares, portadora de mutação missense eng na posição c.88T>C de exon 2) e um doador saudável (sem mutação eng), que foram fornecidos pelo Peking Union Medical College Hospital com aprovação do comitê de ética de pesquisa da faculdade.
- Controle e culturas celulares HHT iPSC
- Adicione um certo volume de matriz de membrana de porão (por exemplo, Matrigel) a uma placa de cultura de 6 poços para cobrir o fundo do poço e incubar as placas por 1h a 37 °C.
NOTA: Quando usar pela primeira vez a matriz de membrana do porão armazenada a -20 °C, incubar no gelo ou em uma geladeira de 4 °C sem gelo até descongelar. Em seguida, diluir às 1:100 em DMEM/F12, em seguida, distribua o diluente em tubos de 200 μL contendo 100 μL cada. Armazene os tubos a -20 °C e evite o congelamento e o descongelamento repetidos. Ao adicionar a matriz de membrana diluída do porão, não crie bolhas. Depois de adicionar a matriz de membrana diluída do porão, aperte a placa de 6 poços suavemente à mão para que ela cubra uniformemente o fundo. - Após o revestimento da placa, remova a solução de matriz de membrana do porão usada dos poços. Em seguida, adicione 2 mL de mTeSR1 médio em cada poço, e emplaque os iPSCs colhidos da última passagem em aproximadamente 1 x 106 por poço.
- Adicione um certo volume de matriz de membrana de porão (por exemplo, Matrigel) a uma placa de cultura de 6 poços para cobrir o fundo do poço e incubar as placas por 1h a 37 °C.
- Geração e expansão de CES a partir de iPSCs
- Após aproximadamente 4 dias de cultura iPSC, troque o meio de cultura com o meio BEL complementado com activin A (25 ng/mL), BMP4 (30 ng/mL), VEGF165 (50 ng/mL) e CHIR99021 (1,5 μM). Cresça as células por 3 dias para gerar células de mesoderme.
- Substitua o meio descrito na etapa 2.2.1 por meio BEL suplementado com VEGF (50 ng/mL) e SB431542 (10 μM) por 4 dias para expandir as CEs vasculares. Trate as células com o mesmo meio e cultura por mais 3-4 dias.
- Use as dinabeads CD31-dynabeads para purificar as CEs vasculares maduras: consulte as instruções do kit CD31-dynabeads, que liga o anticorpo CD31 humano com contas magnéticas para combinar moléculas CD31 expressas em CEs, em seguida, coletar as células CD31 positivas por tampão de eluição. Manter e expandir os CEs purificados em meio EC-SFM contendo VEGF165 (30 ng/mL), bFGF (30 ng/mL) e FBS (1%).
- Emplacando células endoteliais em placas revestidas de Matrigel e microscopia
- Adicione 10 μL de matriz de membrana por poço para revestir as placas de angiogênese (ver Tabela de Materiais) e incubar a 30 min a 37 °C.
- Colher células endoteliais depois de verificar os marcadores endoteliais CD31 e VE-cadherin com coloração de imunofluorescência e resuspensá-las no meio de crescimento endotelial 2 por pipetação repetidamente. Adicione 50 μL de suspensão celular (2 x 105 células/mL) por bem na matriz solidificada e incuba as células por 3-5 h a 37 °C.
NOTA: Antes do experimento de formação do tubo, os marcadores endoteliais devem ser verificados para ter certeza do fenótipo adequado das células endoteliais funcionais. 1 x 104 células por poço é um número ideal para a formação de tubos. Muitas ou poucas células não são propícias à formação de tubos. Adicione células do lado do prato e não toque na matriz de membrana do porão. Use microscópio leve em campo de alta ampliação para verificar as células e tirar fotos.
- Resultados quantitativos da formação de tubos
- Observe os resultados com um microscópio de alta resolução e tire fotos de pelo menos 10 áreas para cada grupo obter estatísticas confiáveis de dados.
- Examine a formação do tubo endotelial: estime a extensão da formação do tubo inspecionando o comprimento geral do tubo, o número do tubo e os pontos do ramo. Avalie e conte o número e o comprimento das filiais usando o software ImageJ.
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Representative Results
A hibridização total do situ baseia-se em um princípio semelhante à transferência de energia de ressonância fluorescência. Ele foi projetado para melhorar a sensibilidade e a especificidade no ISH de zebrafish, bem como amplificar sinais específicos de alvo sem afetar o sinal de fundo.
Em embriões de zebrafish de 24 hpf, a endoglina é altamente expressa na veia cardeal posterior (PCV), vasos intersegmentais (ISVs) e ilhas de sangue3. É difícil controlar o tempo de coloração na tradicional hibridização cromogênica in situ (CISH), com sinais não positivos ocorrendo em algumas regiões, como saco de gema(Figura 1A). Para investigar o papel do eng no desenvolvimento vascular precoce, foi utilizado um marcador endotelial hemogênico(aplnra),bem como outro marcador progenitor endotelial(nrp1a)para examinar qual tipo de endotélio foi afetado pelo silenciamento eng 20. A expressão de aplnra e nrp1a foi fraca em embriões de 24 hpf. Comparado ao CISH, o sinal fraco dos dois genes foi claramente demonstrado na região da cauda após o knockdown eng em WISH (Figura 1B). O knockdown do eng RNA causou a redução da expressão de dois tipos de células endoteliais marcadores de expressão em um modelo animal HHT.
Antes de realizar experimentos em iPSCs diferenciados, as células foram identificadas e confirmadas como CES. Morfologicamente, eles apareceram como forma de paralelepípedos. A expressão dos marcadores moleculares de superfície celular endotelial CD31, CD146, VE-cadherin e vWF foi confirmada com a coloração IF21. Após o isolamento baseado em magnético usando CD31, o ensaio funcional foi conduzido conforme descrito abaixo.
Aqui, o ensaio de formação do tubo foi realizado utilizando-se o mutante eng e controlava as células endoteliais derivadas do iPSC. A análise estatística foi realizada com base no número, ramos e comprimentos dos tubos. Um novo parâmetro também foi introduzido com base no trabalho anterior3, pontos de angiogênese, a fim de refletir a formação de tubos de células endoteliais. Eventualmente, descobriu-se que as células endoteliais mutantes eng formavam menos ramos do que controlam as células endoteliais, e que os ramos em células endoteliais mutantes eng aumentaram significativamente após a estimulação com fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Figura 2A,B). A mutação em eng resultou na formação de tubos de vaso defeituosos.
Figura 1: O knockdown de endoglin diminuiu a expressão dos marcadores endoteliais. (A) CISH e WISH foram realizados para determinar a expressão de endoglin em embriões de 24 hpf (n > 30). A caixa vermelha representa a região ampliada. Barras de escala = 200 μm. (B) aplnra e nrp1a expressão por WISH em embriões de zebrafish de 24 hpf do grupo control-MO e eng-MO. A seta vermelha indica regiões onde a expressão desses genes diminuiu significativamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Formação de tubos de eng mutante e controle iPSC-CEs. (A) A formação do tubo pelos quatro grupos, incluindo o grupo controle, o controle + VEGF (células endoteliais de controle + 30 ng/mL VEGF), o grupo eng mutante(eng mutante células endoteliais) e o grupo eng mutant + VEGF(células endoteliais mutantes + 30 ng/mL VEGF). A formação do tubo foi avaliada e fotografada após 3 h. Barras de escala = 100 μm. (B) Os resultados quantitativos da formação do tubo são mostrados. Na área coberta, o número de ramos e seu comprimento de tubos foram calculados pela Imagem J. As barras de erro representam o SD dos valores médios de três experimentos independentes. O valor de P foi considerado estatisticamente significativo quando *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Período embrionário | Tempo de fixação |
| 4 células a 8 hpf | 4 horas |
| 8 cvf a 24 cvf | 1 hora |
| 24 cvf a 4 dpf | 30 min. |
Tabela 1: Tempo de fixação necessário para diferentes estágios embrionários.
| Período embrionário | Tempo de digestão |
| 4 células a 8 hpf | 2 minutos |
| 8 cvf a 24 cvf | 5 minutos |
| 24 cvf a 4 dpf | 10 minutos |
Tabela 2: Tempo de digestão necessário para diferentes estágios embrionários.
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Discussion
Este protocolo aplicou uma melhor plataforma de análise de RNA in situ in situ para ensaios de formação de zebrafish e tubos em iPSC-CEs derivados de um paciente HHT. O método ISH tradicional requer um ciclo experimental mais longo com etapas experimentais extras. O protocolo possui algumas melhorias importantes, o uso de sondas independentes duplas Z e iPSCs derivados de um paciente com HHT que foram aplicados em ensaios WISH e formação de tubos, respectivamente. Esses refinamentos são cruciais para aumentar a sensibilidade de detecção em comparação com o que é observado com o ISH tradicional. As sondas exclusivamente projetadas e a amplificação do sinal de destino permitem a detecção de transcrições raramente expressas (aplnra é um gene mal expresso em embriões de 24 hpf). Uma modificação é a fixação extra após a hibridização da sonda. A fixação extra pode melhorar a combinação de sondas e transcrições. A coloração da DAB também é aplicada em vez de coloração de fluorescência, porque descobriu-se que era difícil realizar a coloração da fluorescência em certos genes de baixa abundância. Em seguida, foram utilizadas iPSCs para ensaios de angiogênese, o que aumenta a importância e a relevância clínica deste trabalho. A geração de iPSCs requer condições de cultura rigorosas e representa uma limitação do protocolo.
Alguns passos críticos devem ser destacados. Na análise do WISH, o tempo de digestão dos embriões de zebrafish deve ser seguido em estrita conformidade com o texto. Um tempo de digestão mais curto não pode garantir que a sonda se combine com transcrições com sucesso. Em contraste, o tempo de digestão prolongado destruirá a integridade dos embriões. Nos experimentos de formação de tubos, o tempo de imagem deve ser bem controlado. Geralmente, as células endoteliais se tornam tubos dentro de 12 h, mas a estrutura tubular tende a se desintegrar após 24 horas. O número celular também é importante para a formação de tubos, pois uma densidade celular muito alta ou muito baixa pode levar à formação de tubos falhando. Se é difícil induzir células endoteliais a formar tubos, é útil incluir a adição de fatores de crescimento como o VEGF ao meio da cultura como um controle positivo para testar a capacidade das CE de formar estruturas tubulares.
Em resumo, o método WISH aprimorado tem sido considerado uma técnica vantajosa para fluxos de trabalho laboratoriais. Recentemente, nosso grupo de pesquisa começou a testar este ensaio em amostras clínicas. Considerando maior sensibilidade e detecção mais eficiente do que o observado nos métodos tradicionais, este método WISH aprimorado mantém uma promessa significativa para o desenvolvimento e implementação de diagnósticos moleculares baseados em RNA22.
O desempenho do ensaio de formação de tubos utilizando iPSC-CEs do paciente permite a confirmação dos resultados de estudos em animais, bem como a identificação de mutações causadoras de doenças a partir de polimorfismo de nucleotídeo único no gene eng. A combinação desses métodos esclarece o papel do eng na formação vascular e tem potencial na correção genética dos iPSC-CE do paciente para terapia celular cardiovascular23.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Células-Tronco da China e pesquisa translacional [número de subvenção 2016YFA0102300 (para Jun Yang)];a Nature Science Foundation of China [número de subvenção 81870051, 81670054 (para Jun Yang)]; o CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [número de subvenção 2016-I2M-4-003 (para Jun Yang)]; o PUMC Youth Found e o Fundamental Research Funds for the Central Universities [número de subvenção 2017310013 (para Fang Zhou)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
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