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Biology

एंटरॉइड में प्रोलिफेरेटिव और डेड सेल्स का परिमाणीकरण

Published: January 31, 2020 doi: 10.3791/60501
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1, 1, 1
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सुसंस्कृत माउस एंटरॉइड में प्रसार और मृत कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। यह विधि ऑर्गेनोइड प्रसार और अस्तित्व पर दवा उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने में सहायक है।

Abstract

आंतों का एपिथेलियम एक बाधा के रूप में कार्य करता है जो शरीर के बाकी हिस्सों में प्रवेश करने से रोगजनक माइक्रोबायोटा और विषाक्त पदार्थों जैसी चमकदार सामग्री को रोकता है। एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन को आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की अखंडता की आवश्यकता होती है। जबकि एपिथेलियल सेल प्रसार कोशिकाओं की एक सतत परत रखता है जो एक बाधा बनाता है, एपिथेलियल क्षति बाधा रोग की ओर ले जाती है। नतीजतन, चमकदार सामग्री एक अप्रतिबंधित मार्ग के माध्यम से आंतों की बाधा के पार कर सकते हैं । आंतों की बाधा की शिथिलता कई आंतों की बीमारियों से जुड़ी हुई है, जैसे भड़काऊ आंत्र रोग। अलग-थलग माउस आंतों के तहखाने को क्रिप्ट-विलस जैसी संरचनाओं के रूप में सुसंस्कृत और बनाए रखा जा सकता है, जिन्हें आंतों के ऑर्गेनॉइड या "एंटरॉइड" कहा जाता है। एंटरॉइड विट्रो में आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार और कोशिका मृत्यु का अध्ययन करने के लिए आदर्श हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम सुसंस्कृत आंत्रशोथ में प्रसारात्मक और मृत कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। 5-एथिनिल-2'-डिऑक्सीरिडीन (ईडीयू) और प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग एंटोलाइड में प्रसार और मृत कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है, और इसके बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रसार और मृत कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण किया जाता है। यह आंतों के एपिथेलियल सेल प्रसार और सेल अस्तित्व पर दवा उपचार के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

Introduction

आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं का एक मौलिक कार्य रोगजनक बैक्टीरिया और विषाक्त पदार्थों जैसे चमकीली सामग्री के प्रवेश की रक्षा करना है1,2. इस तरह के एक समारोह को करने के लिए, आंतों स्टेम कोशिकाओं लगातार पैदा और आंत्रशोथ कोशिकाओं, enterocytes और गुप्त कोशिकाओं सहित एपिथेलियल कोशिकाओं की एक किस्म में अंतर, जो तंग कनेक्शन3बनाने के द्वारा एक बाधा फार्म । आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं के तेजी से नवीनीकरण के लिए सेल प्रसार, सेल भेदभाव और सेल डेथ4,5के सख्त समन्वय की आवश्यकता होती है। कोशिका प्रसार या अत्यधिक कोशिका मृत्यु कम होने से एपिथेलियल क्षति होती है और बाधा कार्य1,6से समझौता हो जाता है । आंतों की बाधा की शिथिलता भड़काऊ आंत्र रोगों7,8से जुड़ी हुई है ।

आंतों के तहखाने संस्कृति के लिए एक विधि पहले विकसित किया गया है । इस तकनीक का उपयोग करके, अलग-थलग माउस क्रिप्ट्स आंतों के ऑर्गेनॉइड (आंत्रशोथ) में विकसित होते हैं, जिनमें तहखाना-विलस जैसी संरचनाएं होती हैं और इसमें सभी आंतों के एपिथेलियल सेल वंश9,10होते हैं। 5- एथिनिल-2'-डिऑक्सीरिडीन (ईडीयू) एक थाइमिडीन एनालॉग है जो डीएनए में थाइमाइन (टी) को बदलने में सक्षम है जो कोशिका प्रसार के दौरान प्रतिकृति के दौर से गुजर रहा है। प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को ईडू धुंधला द्वारा जल्दी और सटीक रूप से लेबल किया जा सकता है। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) एथिडियम ब्रोमाइड का एक एनालॉग है जो डबल-फंसे डीएनए में सम्मिलन पर लाल फ्लोरेसेंस जारी करता है। पीआई विशेष रूप से मृत कोशिकाओं का पता लगाता है, क्योंकि यह केवल क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली से गुजरता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम पहले वर्णन करते हैं कि कैसे मूत्र छोटी आंत से तहखाने को अलग किया जाए फिर उन्हें विट्रो में आंत्रशोथ के रूप में संस्कृति। फिर हम ईडू और पीआई निगमन और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एंटरॉइड में प्रसारात्मक और मृत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के तरीके का वर्णन करते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को सोओखो विश्वविद्यालय में कैम्ब्रिज-सुडा जीनोमिक संसाधन केंद्र (कैम-सु) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. आंतों ऑर्गेनोइड आइसोलेशन और संस्कृति

  1. आंतों के तहखाने और आंत्रशोथ संस्कृति का अलगाव
    1. सीओ2 साँस लेना के साथ एक 8 सप्ताह पुराने जंगली प्रकार माउस इच्छामृत्यु । लगभग 8 सेमी इलियम को विच्छेदन करने के लिए ऊतक संदंश और ठीक आईरिस कैंची का उपयोग करें।
    2. बर्फ के बारे में ४० मिलील के साथ gavage खिला सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर बाहर फ्लश-ठंडा Dulbecco फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS), तो कैंची के साथ लंबाई में कटौती और ileum खुला ।
    3. इलियम को छोटे (0.5−1.0 सेमी) टुकड़ों में काट लें। टुकड़ों को बाँझ बर्फ के 5 मिलील में रखें- ठंडा डीपीबीएस 15 मिलीस शंकुट्यूब में, फिर बर्फ पर 5 मिन के लिए रॉक करें।
    4. डीपीबीएस को एस्पिरेट करने के लिए एक पिपेट नियंत्रक का उपयोग करें और इसे 10 मिलील कोल्ड बफर 1 (डीपीबीएस में 2 एमएम ईटीए) से बदलें। बर्फ पर 30 मिन के लिए रॉक।
    5. पाइप्ट नियंत्रक का उपयोग बफर 1 को एस्पिरेट करने के लिए करें और 10 मिलील कोल्ड बफर 2 (54.9 एम एम डी-सोर्बिटोल, डीपीबीएस में 43.4 m M sucrose) से बदलें। हाथ से 2−3 मिन के लिए हिला (~ 80 हिलाता है/
    6. एक माइक्रोस्कोप के नीचे मिलाते हुए और निरीक्षण करने के बाद बफर 2 सामग्री की 20 μL बूंद लें।
    7. फिल्टर बफर 2 सामग्री एक 70 μm बाँझ सेल छलनी के साथ, तो एक 50 mL शंकुट्यूब के साथ फ़िल्टर बफर इकट्ठा।
    8. लिप्ट्स गिनने के लिए स्लाइड पर फिल्ट्रेट के 20 माइक्रोन। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ~ 500 क्रिप्टाएं/
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 150 x ग्राम पर नीचे स्पिन। एक बार कताई समाप्त हो जाने के बाद, ध्यान से अलौकिक को एस्पिरेट करें।
    10. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (जैसे, मैट्रिक्स) प्रति ५०० तहखाने के ५० μL में तहखाने को निलंबित करें, ऊपर और नीचे पिपेट (बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहना), फिर 24 अच्छी प्लेट में एक अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स/तहखाना मिश्रण के 50 μL बूंद जगह । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बहुलक बनाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    11. बहुलीकरण के 30 मिनट के बाद, ध्यान से मिनीगट मीडिया के ६०० μL जोड़ें (उन्नत Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम [DMEM]/F12, 2 mM एल-alanine-L-ग्लूटामाइन, कलम/ 10 mM Hepes, N2 पूरक [1:100], B27 पूरक [1:50]एपिडर्मल विकास कारक के साथ [EGF; ५० एनजी/mL], नोगिन [१०० एनजी/mL], आर-स्पोंडिन [५०० एनजी/mL], और Y27632 [10 μM]) प्रत्येक अच्छी तरह से, तो 37 ccubar में थाली को वापस प्रत्येक दिन एक माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें, और हर 2−3 दिनों में मीडिया को बदलें।
  2. एंटरॉइड पासिंग
    नोट: लंबी संस्कृतियों के लिए, आंत्रशोथ लगभग प्रत्येक सप्ताह विभाजित किया जाना चाहिए।
    1. आंत्रशोथ को पारित करने के लिए, ऊतक संस्कृति प्लेट को बर्फ पर रखें। मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से ठंडे डीपीबीएस का 1 मिलील जोड़ें। जब तक कोई ठोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हिस्सा नहीं रहता है, तब तक ऊपर और नीचे पिपेट करने के लिए P1000 टिप का उपयोग करें।
    2. 1 मिलीआर इंसुलिन सिरिंज (27 जी) के माध्यम से और 15 मिलील शंकुई ट्यूब में एक बार ऊपर और नीचे पास करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 150 x ग्राम पर 5 मिन के लिए नीचे स्पिन।
    3. डीपीबीएस को हटाने के लिए पिपेट का प्रयोग करें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स/अच्छी तरह से ५० μL में फिर से निलंबित ।
    4. 30 मेंस के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें ताकि बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को पॉलीमरेज करने की अनुमति दी जा सके। ईएनआर मीडिया के ६०० μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ओवरले (minigut मीडिया, ५० एनजी/mL EGF, १०० एनजी/mL Noggin, ५०० एनजी/mL आर-स्पॉन्डिन), तो इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस ।

2. एंटरॉइड में एडु-पॉजिटिव कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

नोट: चित्रा 1 एंटरॉइड में एडु-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह दिखाता है।

  1. एडु के साथ एंटरॉइड का ऊष्मायन
    1. 5-7 दिनों के लिए चरण 1.2.4 से एंटरॉइड बढ़ाएं। 1:2 के बंटवारे के अनुपात में एक नई 24 अच्छी तरह से प्लेट में मार्ग प्रवेश करता है। प्रत्येक अच्छी तरह से ईएनआर माध्यम के 600 μL जोड़ें। इनक्यूबट 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4−5 दिनों के लिए प्रवेश करता है।
    2. नियंत्रण समूह (अनुपचारित आंत्रशोथ) और प्रायोगिक समूह (5 एनजी/mL interleukin 22 [आईएल-22]) के साथ इलाज enteroids सेट करें । प्रत्येक समूह के लिए कम से कम तीन प्रतिकृति तैयार करें।
    3. 50 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ एडु मीडियम तैयार करने के लिए ईएसआर मीडियम में ईडू जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से ईडू माध्यम के 600 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पृष्ठभूमि घटाव के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ईडू उपचार के बिना एंवोलाइड का एक अच्छी तरह से सेट करें।
  2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से आंत्रकी कटाई
    1. एडु मीडियम को एस्पिरेट करने और डीपीबीएस के साथ 1x धोने के लिए एक पिपेट कंट्रोलर का उपयोग करें। डीपीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    2. P1000 पिपेट टिप का उपयोग करें और जब तक कोई ठोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हिस्सा नहीं रहता है ऊपर और नीचे पिपेट। 15 mL ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेटेंट को छोड़ दें।
    3. सेल-विसोशन एंजाइमों(सामग्री की तालिका)के 500 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। एकल कोशिकाओं में एंप्लाइड तोड़ने के लिए P200 पिपेट टिप और पिपेट का उपयोग करें।
    4. डीएमईएम माध्यम के 3 mL जोड़ें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) होऔर बार-बार पी1000 पिपेट टिप के साथ पिपेट करें।
    5. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन और अलौकिक माध्यम aspirate। डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. कोशिकाओं का निर्धारण और परमीबिलाइजेशन
    1. सेल निलंबन को 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें, 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें, और सुपरनेटेंट को त्यागें।
    2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 1 mL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 न्यूनतम के लिए ठीक करें, और 5 न्यूनतम के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें। एक पिपेट टिप के साथ सुपरनेट को एस्पिरेट करें, डीपीबीएस के साथ 1x धोएं, और सुपरनेट को हटाने के लिए नीचे स्पिन करें।
    3. 0.5% nonionic सर्फेक्टेंट के 1 mL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आरटी में 10 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
    4. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन और अलौकिक aspirate। डीपीबीएस के साथ 1x धोएं और सुपरनेटेंट को हटाने के लिए नीचे स्पिन करें।
  4. ईदू का पता लगाना
    1. पहले से प्रत्येक घटक के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें: 1) एलेक्सा फ्लोर अजाइड का काम समाधान, 2) 1x ईडीयू प्रतिक्रिया बफर का काम समाधान, और 3) ईडीयू बफर योजक का 10x स्टॉक समाधान।
    2. डिओनाइज्ड पानी में 10x समाधान 1:10 को कमजोर करके 1x ईडू बफर योजक तैयार करें। इस समाधान को ताजा तैयार करें।
    3. टेबल 1के अनुसार रिएक्शन कॉकटेल तैयार करें ।
      नोट: तालिका में सूचीबद्ध आदेश में सामग्री जोड़ें। तैयारी के 15 मिनट के भीतर प्रतिक्रिया कॉकटेल का उपयोग करें।
    4. प्रत्येक 1.5 mL ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया कॉकटेल के 100 μL जोड़ें। कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, प्रकाश से बचाएं, आरटी में 30 किमी के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और पिपेट टिप के साथ प्रतिक्रिया समाधान को धीरे से एस्पिरेट करें।
    6. आरटी में 1x धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 0.5% nonionic surfactant पेनेट्रेंट जोड़ें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, पिपेट टिप के साथ सुपरनेट को धीरे से एस्पिरेट करें, और डीपीबीएस के 1 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण
    1. 40 माइक्रोन छलनी के साथ पुनर्निलंबित कोशिकाओं को फ़िल्टर करें, फिर 15 मिलील शंकुई ट्यूब के साथ फ़िल्टर की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करें। जितनी जल्दी हो सके FACS ऑन-मशीन डिटेक्शन करें।
      नोट: यदि स्थितियां सीमित हैं, तो सेल दाग नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जाना चाहिए और 3 दिनों के भीतर प्रवाह-परीक्षण किया जाना चाहिए।
    2. उचित चैनल का चयन करें (एडु किट में एलेक्सा फ्लोर अजाइड के प्रकार के अनुसार; यहां, लाल चैनल) और वोल्टेज (यहां, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए ~ 150-350 वी) ।
    3. गेटिंग रणनीति
      1. एफएससी-ए (एक्स-एक्सिस) बनाम एसएससी-ए (वाई-एक्सिस) छद्म रंग की साजिश को ड्रा करें और वोल्टेज को समायोजित करके डॉट मैप की दृश्यरेंज में अधिकांश कोशिकाओं को वितरित करें। सेल जनसंख्या (R1) का चयन करें और नीचे बाएं कोने में सेल मलबे को बाहर करें।
      2. R1 सेल आबादी से, एक एफएससी-ए (एक्स-एक्सिस) बनामस्थापित करें । एफएससी-एच (वाई-एक्सिस) छद्म रंग की साजिश, और सेल झुरमुट को बाहर करने के लिए एकल कोशिकाओं (R2) का चयन करने के लिए गेट सेट करें।
      3. R2 सेल आबादी से, फ्लोरेसेंस तीव्रता (एक्स-एक्सिस) बनामस्थापित करें । सेल नंबर (वाई-एक्सिस) प्लॉट, और गेट सेट करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें। फ्लोरोसेंट सिग्नल का क्षेत्र एक सकारात्मक सेल क्षेत्र (R3) है। प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के बीच ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं (R3) के अनुपात की तुलना करें।

3. एंटरॉइड में पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

नोट: चित्रा 2 एंटरॉइड में पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह दिखाता है।

  1. पीआई के साथ आंत्रशोथ कोशिकाओं का ऊष्मायन
    1. 5-7 दिनों के लिए चरण 1.2.4 से एंटरॉइड बढ़ाएं। 1:2 के बंटवारे के अनुपात में एक नई 24 अच्छी तरह से प्लेट में मार्ग प्रवेश करता है। प्रत्येक अच्छी तरह से ईएनआर माध्यम के 600 μL जोड़ें। इनक्यूबट 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4−5 दिनों के लिए प्रवेश करता है।
    2. प्रत्येक समूह के लिए कम से कम तीन प्रतिकृति यों का उपयोग करके नियंत्रण समूह (अनुपचारित) और प्रायोगिक समूह (आईएल-22 का इलाज) सेट करें।
    3. 3 माइक्रोएम की एकाग्रता के साथ पीआई माध्यम तैयार करने के लिए ईएनआर माध्यम में पीआई जोड़ें।
    4. प्रत्येक कुएं में पीआई माध्यम के 600 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। पृष्ठभूमि घटाव के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीआई उपचार के बिना एंप्लाइड ्समें से एक अच्छी तरह से सेट करें।
  2. 2.2.1−2.5 चरणों के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से फसल एंटरॉइड।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण
    1. 40 माइक्रोन छलनी के साथ पुनर्निलंबित कोशिकाओं को फ़िल्टर करें और 15 मिलील शंकुई ट्यूब के साथ फ़िल्टर की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    2. जितनी जल्दी हो सके FACS ऑन-मशीन डिटेक्शन करें।
      नोट: यदि स्थितियां सीमित हैं, तो सेल दाग नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जाना चाहिए और 3 दिनों के भीतर प्रवाह-परीक्षण किया जाना चाहिए।
    3. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयुक्त चैनल (यहां, लाल चैनल) और वोल्टेज (यहां, ~ 150-350 वी) का चयन करें।
    4. धारा 2.5.3 में वर्णित उसी गेटिंग रणनीति का उपयोग करें।

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Representative Results

छोटे आंतों के तहखाने अलग और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में आंत्रके रूप में सुसंस्कृत थे। आंत्रशोथ अलगाव के 2 दिन बाद कलियों के रूप में शुरू कर दिया। 6 दिन, एंटरॉइड में ल्यूमेन में बहुत सारे मलबे (मृत कोशिकाओं) के साथ कई कलियां थीं। एंटरॉइड इस स्तर पर पैसेज करने के लिए तैयार थे(चित्रा 3)।

कई अध्ययनों से पता चला है कि आंतों के एपिथेलियल होमोस्टोसिस के रखरखाव के लिए भड़काऊ साइटोकिन्स आवश्यक हैं। भड़काऊ साइटोकिन्स की असामान्य अभिव्यक्ति भड़काऊ आंत्र रोगों की घटनासेनिकटता से जुड़ी हुई है । उदाहरण के लिए, हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि आईएल-22 पारगमन-बढ़ाना कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देता है, लेकिन यह भी Lgr5+ स्टेम सेल12समाप्त ।

एंटरॉइड का इलाज आईएल-22 के साथ 3 दिनों तक किया गया, जिसके बाद सेल प्रसार का संकेत देने के लिए एडु के साथ सिंथेटिक डीएनए को लेबल किया गया । आईएल-22-इलाज एंटरॉइड ने एडु+ कोशिकाओं(चित्रा 4ए)की बढ़ी हुई संख्या प्रदर्शित की। आईएल-22 ने प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 4बी)द्वारा विश्लेषण के अनुसार 40.1% से 83.5% तक प्रसार कोशिकाओं में वृद्धि की। आईएल-22 उपचार भी एंप्लाइड्स में सेल मौत में वृद्धि हुई, PI धुंधला द्वारा संकेत(चित्रा 5ए)। आईएल-22 ने मृत कोशिकाओं को 4.9% से बढ़ाकर 16.2% कर दिया, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 5बी)द्वारा विश्लेषण किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एंटरॉइड में एडु-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए वर्कफ्लो आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आंत्रशोथ में पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए वर्कफ्लो आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: 2, 4, और 6 दिनों के बाद तहखाना अलगाव पर enteroids के ब्राइटफील्ड छवियां । स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आईएल-22 एंटरॉइड प्रसार को बढ़ाता है। (क)एंटरॉइड को 3 दिनों के लिए आईएल-22 (5 एनजी/एमएल) के बिना या उसके साथ मध्यम रूप से सुसंस्कृत किया गया था और 1 एच स्केल बार = १०० माइक्रोन के लिए ईडीयू (लाल) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । (ख)एंटरॉइड से फ्लो साइटोमेट्री डेटा बिना (बाएं) या (दाएं) आईएल-22 के साथ सुसंस्कृत । डेटा तीन अलग-अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: आईएल-22 एंटरॉइड में सेल डेथ को बढ़ावा देता है। (क)एंटरॉइड को 3 दिनों के लिए आईएल-22 (5 एनजी/एमएल) के बिना या उसके साथ मध्यम रूप से सुसंस्कृत किया गया था और प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल) से दाग दिया गया था । स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ख)एंटरॉइड से फ्लो साइटोमेट्री डेटा बिना (बाएं) या (दाएं) आईएल-22 के साथ सुसंस्कृत । डेटा तीन अलग-अलग प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रतिक्रिया घटक 24-कूक प्लेटों के कुओं की संख्या
1 2 5 10 20 50
1x रिएक्शन बफर 86 माइक्रोन 172 माइक्रोन 430 माइक्रोन 860 माइक्रोन 1.72 माइक्रोन 4.3 माइक्रोन
क्यूएसओ4 4 माइक्रोन 8 माइक्रोन 20 माइक्रोन 40 माइक्रोन 80 माइक्रोन 200 माइक्रोन
एलेक्सा फ्लोर अजाइड 0.25 माइक्रोन 0.5 माइक्रोन 1.25 माइक्रोन 2.5 माइक्रोन 5 माइक्रोन 12.5 माइक्रोन
रिएक्शन बफर योजक 10 माइक्रोन 20 माइक्रोन 50 माइक्रोन 100 माइक्रोन 200 माइक्रोन 500 माइक्रोन
कुल मात्रा 100 माइक्रोन 200 माइक्रोन 500 माइक्रोन 1 μL 2 माइक्रोन 5 माइक्रोन
नोट: तालिका में सूचीबद्ध आदेश में सामग्री जोड़ें।

तालिका 1: एडु रिएक्शन कॉकटेल।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल में विट्रो में आंत्रशोथ की संस्कृति के लिए आवश्यक कदमों और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एंटरॉइड में एडु और पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा का विवरण दिया गया है। इस रणनीति के कई फायदे हैं। सबसे पहले, एडु लेबलिंग का उपयोग एंटरॉइड में कोशिकाओं को प्रसारित करने के लिए किया जाता है। पारंपरिक BrdU परख के साथ तुलना में, EdU लेबलिंग विधि तेजी से, अधिक संवेदनशील है, और अधिक सटीक है । EdU बहुत थाइमाइन (टी), जो सेल डिवीजन के दौरान डीएनए संश्लेषण में थायमीन की जगह के समान है । BrdU एंटीबॉडी की तुलना में, EdU सेल में फैलाना आसान है, और EdU का पता लगाने डीएनए denaturation और एक एंटीजन एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की आवश्यकता नहीं है । दूसरे, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण एंप्लाइड्स में प्रोलाइफिंग (एडयू+)और डेड (पीआई+)कोशिकाओं को जल्दी और सटीक रूप से बता सकता है।

पूरी प्रक्रिया को सफलतापूर्वक करने के लिए, महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार किया जाना है । सबसे पहले, पर्याप्त परिस्थितियों में आंत्रशोथ संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है। अच्छी तरह से उगाए जाने वाले एंप्लॉयड में बहुत सारी कलियां होनी चाहिए, जिनमें प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं होती हैं। दूसरा, आंत्रशोथ को समय पर विभाजित करना महत्वपूर्ण है। ल्यूमेन में जमा मलबे में मृत कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें पीआई से दागा जा सकता है। यह निम्नलिखित प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए हानिकारक है। तीसरा, कई चरणों (यानी, सेल धुंधला, सेल निर्धारण, झिल्ली टूटना, और केंद्रीकरण) के कारण, कोशिकाओं को प्रक्रिया के दौरान आसानी से खो दिया जा सकता है। इस प्रकार, पर्याप्त संख्या में आंत्रशोथ एकत्र करना महत्वपूर्ण है। निर्धारण से पहले एंप्लाइड्स के 2−3 कुओं (24 अच्छी प्लेट में) गठबंधन करना महत्वपूर्ण है। अंत में, ईटू का पता लगाने के लिए बफर में सामग्री जोड़ना महत्वपूर्ण है, अन्यथा प्रतिक्रिया बेहतर ढंग से आगे नहीं बढ़ेगी।

संक्षेप में, प्रोटोकॉल विट्रो में माउस एंटरॉइड की मात्रा और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रसार और मृत कोशिकाओं की मात्रा के लिए चरणों का विवरण देता है। एंटरॉइड रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय दवा खोज के लिए उपयोगी उपकरण हैं। यह प्रोटोकॉल आंत्रविज्ञान संस्कृति मॉडल में कोशिका प्रसार और सेल अस्तित्व पर भड़काऊ साइटोकिन्स, रोगजनक और दवाओं के प्रभावों की खोज में मदद करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31971062, 31900326, और 31601022), जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (BK20190043, BK20180838), राज्य की दवा जैव प्रौद्योगिकी की राज्य कुंजी प्रयोगशाला के अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित है, नानजिंग विश्वविद्यालय (केएफ-जीएन-202004)। चीन के जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों की प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (19KJB320003), सूज़ौ शहर के आजीविका और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (SYS2019030), और जियांग्सू प्रांत के कॉलेज स्नातकों के लिए अनुसंधान नवाचार कार्यक्रम (KYCX19-1981) . इस काम को सोओखो विश्वविद्यालय के तांग विद्वान द्वारा भी समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Corning 430791
22 G gavage needle VWR 20068-608
24-well plate Nunc 142475
40 mm sterile cell strainer BD 352340
50 ml centrifuge tube Corning 430829
70 mm sterile cell strainer BD 352350
Advanced DMEM/F-12 GIBCO 12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer Invitrogen A24863
B-27 Supplement GIBCO 17504044
Buffer 1 2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE) Life technologies 12605-010
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Life technologies C10639
CO2 incubator Panasonic MCO-18AC
DPBS GIBCO 14190144
D-sorbitol BBI SB0491
EDTA BBI EB0185
ENR media Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
Fine Iris Scissors Tansoole 2037454
Fluorescence microscope Olympus FV1000
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061
Goat Serum Life technologies 16210-064
HDMEM Hyclone SH30243.01B
HEPES Sigma H4034
Matrigel Corning 356231
Minigut media Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement R&D AR009
Nonionic surfactant (Triton X) BBI TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm) Tansoole 2025785
Paraformaldehyde (PFA) sigma 158127-500g
Penn/Strep Invitrogen 15140-148
Phase contrast microscope Nikon TS1000
Propidium iodide Sigma P4170-25MG
Recombinant EGF PeproTech 315-09
Recombinant Mouse Noggin PeproTech 250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1 R&D 3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22 PeproTech 210-22-10
Sucrose BBI SB0498
Tissue Forceps Tansoole 2026704
Y-27632 2HC1 Selleck S1049

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References

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जीव विज्ञान अंक 155 आंत्रशोथ आंत प्रवाह साइटोमेट्री प्रसार ईडू प्रोपिडियम आयोडाइड
एंटरॉइड में प्रोलिफेरेटिव और डेड सेल्स का परिमाणीकरण
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Li, H. S., Xu, S. F., Sheng, J. Y.,… More

Li, H. S., Xu, S. F., Sheng, J. Y., Jiang, Z. H., Wang, J., Ding, N., Wang, T., Odenwald, M. A., Turner, J. R., He, W. Q., Xu, H., Zha, J. M. Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids. J. Vis. Exp. (155), e60501, doi:10.3791/60501 (2020).

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