Summary
ביואינפורמטיקה היא דרך שימושית לעיבוד ערכות נתונים בקנה מידה גדול. באמצעות יישום של ביואינפורמטיקה גישות, החוקרים יכולים במהירות, אמין, וביעילות להשיג בקשות תובנה ותגליות מדעיות. מאמר זה ממחיש את הניצול של ביואינפורמטיקה במחקר סרטן השחלות. הוא גם מאמת בהצלחה ממצאים בביואינפורמטיקה באמצעות ניסויים.
Abstract
איתות מדרגה הוא מסלול רגולציה שהוא שימור מאוד המעורב בתהליכים סלולאריים רבים. דיסרגולציה של מסלול זה איתות לעתים קרובות מוביל הפרעות עם התפתחות נאותה ואולי גם לגרום לחניכה או התקדמות של סרטן במקרים מסוימים. בגלל מסלול זה משרת פונקציות מורכבות תכליתי, זה יכול להיות למד באופן נרחב באמצעות גישות שונות רבות. מתוך אלה, ביואינפורמטיקה מספק שיטת לימוד חסכונית בעלות חסכונית, נגישה וידידותית למשתמש. ביואינפורמטיקה היא דרך שימושית לחלץ פיסות מידע קטנות יותר מערכות נתונים בקנה מידה גדול. באמצעות יישום של גישות שונות בביואינפורמטיקה, החוקרים יכולים במהירות, אמין, וביעילות לפרש אלה מערכות נתונים גדולות, מניב יישומים תובנה ותגליות מדעיות. כאן, פרוטוקול מוצג לאינטגרציה של ביואינפורמטיקה גישות לחקור את התפקיד של איתות חריץ בסרטן השחלות. יתרה מזאת, ממצאי ביואינפורמטיקה מאומתים באמצעות ניסויים.
Introduction
מסלול איתות חריץ הוא מסלול שמרו במיוחד כי חשוב עבור תהליכים התפתחותיים רבים בתוך אורגניזמים ביולוגיים. איתות חריץ הוכח לשחק תפקיד משמעותי התפשטות התא והתחדשות עצמית, פגמים במסלול איתות חריץ יכול להוביל לסוגים רבים של סרטן1,2,3,4,5,6. בנסיבות מסוימות, מסלול איתות חריץ נקשר הן גידול רקמות סרטן, כמו גם מוות תאים ודיכוי הגידול7. קולטנים מרובים (חריץ 1-4) ו co\u2012activator המוח (MAML 1-3), כולם עם פונקציות מגוונות, להוסיף רמה נוספת של מורכבות. בעוד מסלול איתות חריץ מתוחכם מבחינת פונקציות, מסלול הליבה שלה הוא פשוט על בסיס מולקולרי8. קולטנים חריץ לפעול כמו חלבונים חלבון טראנסממברנלי המורכב של מסחטות אזורים תאיים9. ליגאל באזור החילוץ של קולטני חריץ מקלה על מחשוף הנוגד חרדה, אשר מאפשר את התחום הבין-תאיים (NICD) להשתחרר לתוך הגרעין. NICD לאחר מכן נקשר co\u2012activator המוח כדי להפעיל ביטוי גנים במטה10.
בשנים האחרונות, איתות חריץ הוכח לשחק במגוון תפקידים בייזום והתקדמות של מספר סוגים של סרטן על פני זנים שונים6,11. לדוגמה, איתות מדרגה מקושר לטומגנזה המעורב בNOTCH1 הגן האנושי12. לאחרונה, the NOTCH2, NOTCH3, דלתא-כמו 3 (DLL3), מאסטר מראה כגון חלבון 1 (MAML1), ו מתפורר ומטאלויואז מטאומאו2012 המכילים חלבון 17 (ADAM17) גנים הוכחו להיות משויכים באופן מאוד לסרטן השחלות, במיוחד עם ההישרדות הכוללת המסכן של חולים13.
ככל שכמות הנתונים הניסיוניים והמטופלים מגדילה ברציפות, הביקוש לניתוח של הנתונים הזמינים גדל גם כן. הנתונים הזמינים מפוזרים על-פני פרסומים, והם עשויים לספק ממצאים לא עקביים או אפילו סותרים. עם התפתחות הטכנולוגיה החדשה בעשורים האחרונים, כגון רצפי הדור הבא, כמות הנתונים הזמינים גדל אקספוננציאלית. למרות שהדבר מייצג התקדמות מהירה במדע והזדמנויות למחקר ביולוגי מתמשך, הערכת המשמעות של נתונים זמינים לציבור לפתרון שאלות מחקר היא אתגר גדול14. אנו מאמינים שביואינפורמטיקה הוא דרך שימושית לחלץ פיסות מידע קטנות יותר מערכות נתונים בקנה מידה גדול. באמצעות יישום של גישות שונות בביואינפורמטיקה, החוקרים יכולים במהירות, אמין, וביעילות לפרש אלה מערכות נתונים גדולות, מניב גילויים תובנה. גילויים אלה עשויים לנוע מתוך זיהוי של מטרות הטיפול הפוטנציאלי תרופה חדשה או ביוארקרס מחלות, לטיפולים אישיים המטופל15,16.
ביואינפורמטיקה עצמה מתפתחת במהירות, והגישות משתנות באופן תמידי כהתקדמות טכנולוגית מנקה את המדע הרפואי והביולוגי. כיום, גישות נפוצות של ביואינפורמטיקה כוללות ניצול של מסדי נתונים ותוכנות נגישים לציבור לניתוח DNA או רצפי חלבונים, לזהות גנים של רלוונטיות מסוימת או חשיבות, ולקבוע את הרלוונטיות של גנים ומוצרים גנטיים דרך גנומיקה תפקודית16. למרות שהשדה של הביואינפורמטיקה הוא בהחלט לא מוגבל גישות אלה, אלה הם משמעותיים לסייע לרופאים וחוקרים לנהל נתונים ביולוגיים לטובת החולים כולה.
מחקר זה נועד להדגיש מספר מסדי נתונים חשובים השימוש שלהם למחקר על מסלול איתות חריץ. NOTCH2, NOTCH3, וMAML1 co\u2012activator שלהם שימשו כדוגמאות למחקר במסד הנתונים. גנים אלה שימשו כי החשיבות של מסלול איתות חריץ בסרטן השחלות כבר אומת. ניתוחים שיטתית של נתונים מאוחזרים אישר את החשיבות של איתות חריץ בסרטן השחלות. בנוסף, כיוון איתות חריץ הוא שימור היטב על פני מינים, זה אושר כי הביטוי oversopהילה melanogaster Nicd ו המוח יחד יכול לגרום לגידולים בשחלות drosophila ילה , תמיכה בממצאים מסד הנתונים ואת התפקיד משמעותי ושמרו של איתות חריץ בסרטן השחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חיזוי של תוצאות קליניות מפרופילים גנומית (PRECOG)
הערה: הפורטל הקדם (precog.stanford.edu) ניגש לנתונים זמינים לציבור מתוך 165 ביטוי סרטן מערכות נתונים, כולל רמות ביטוי גנטי ותוצאות קליניות החולה17. זה מספק במיוחד את מmeta\u2012z ניתוח, אשר משלבת מערכות נתונים גדולים כדי לספק הציונים של Z\u2012scores גנים שונים ב 39 סוגי סרטן לציון ההישרדות הכללית החולה. שיעורי ההישרדות העניים והטובים מצוינים על-ידי ערכי ניקוד חיוביים ושליליים של Z\u2012score בהתאמה.
- צור חשבון בעל מייל המזוהה עם השכלה אקדמית כדי לגשת למסד נתונים זה. הזן את כתובת הדוא ל והסיסמה המשויכים לחשבון.
- לחץ על הלחצן ' הצג פרטים ' הממוקם מתחת לכותרת הניתוח Meta-Z .
- הקלט את גן העניין בסרגל החיפוש .
- השתמש בפס הגלילה הממוקם בחלק התחתון של המסך כדי לקבל את Z-ציון ההישרדות עבור סוג הסרטן הספציפי של עניין.
2. CSIOVDB
הערה: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) הוא מסד נתונים microarray שפותחה על ידי המכון למדעי הסרטן של סינגפור ללמוד סרטן השחלות18. מסד נתונים זה מכיל נתונים של קרצינומות מאתרי גידולים שונים, כמו גם שחלות נורמלי נתונים רקמת השחלה. בנוסף, CSIOVDB מספק את מגרשי ההישרדות של Kaplan\u2012Meier אייר כדי להעריך הישרדות החולה עם רמות ביטוי גנים דיפרנציאלי. CSIOVDB ניתן להחיל כדי לחקור את הקשר בין רמות ביטוי גנים וסרטן השחלות שלבים/ציונים.
- הגן הקלט של עניין, ולאחר מכן לחץ על לחצן חיפוש .
- לחצו על הכרטיסייה ' מצב מחלה '.
הערה: כרטיסיה זו מספקת סטטיסטיקות סיכום של ביטוי גנים של הגן היעד של העניין במצבי סרטן השחלות מחלות. - לחץ על הכרטיסייה היסטולוגיה .
הערה: כרטיסיה זו מספקת סטטיסטיקות סיכום של ביטוי גנים של הגן היעד של עניין היסטוגיות סרטן השחלות הגדולות. - לחץ על הכרטיסייה של הפרמטרים הפתולוגיים הקליפיקו .
הערה: כרטיסיה זו מספקת השוואה בין רמות ביטוי הגן בין שלבים שונים של סרטן השחלות, ציונים, ותגובות קליניות עם בדיקות מאן-ויטני. - לחץ על הכרטיסייה הישרדות .
הערה: כרטיסיה זו מספקת מגרשים של קפלן-מאייר הקשורים להישרדות והישרדות כוללת ללא מחלות. עבור מסד הנתונים הזה, הישרדות ללא מחלות נחשב מהלך-והישרדות ללא מופע חוזר18. ניתוחים multivariate עבור הישרדות כולל הישרדות ללא מחלות מצויים גם תחת כרטיסיה זו. הניתוחים סטטיסטי להשוות תכונות המתייחסות התחזיות סרטן השחלות (שלב, כיתה, כירורגי debulking, היסטולוגיה, גיל) ואת הגן של עניין. - לחצו על הכרטיסייה ' תת-סוג '.
הערה: כרטיסיה זו מספקת סטטיסטיקות סיכום ובדיקות מאן-ויטני לרמת הביטוי של גן העניין בתתי-סוגי מולקולרית של סרטן השחלות. כרטיסיה זו מספקת גם מגרשים של קפלן-מאייר הקשורים הישרדות כוללת ונטולת מחלות של הגן של עניין תת מולקולרי של סרטן השחלות.
3. ביטוי גנים על פני רקמה נורמלית וסרטניים (GENT)
הערה: הפורטל החדש (רפואי \ u2012genome. kribb. re. kr/גנט) מפותח ומתוחזק על ידי מכון המחקר של מדעי הביולוגיה בביוכימיה וביוטכנולוגיה (KRIBB)19. היא אוספת 16,400 (U133A; 241 datasets) ו 24,300 (U133plus2; 306 datasets) מדגמים זמינים לציבור. לאחר הסטנדרטיזציה, GENT מציע נתונים ביטוי גנים על פני רקמות מגוונות, אשר מחולקים עוד לתוך הגידול ורקמות נורמלי.
- לחצו על הכרטיסייה ' חיפוש ' בחלק העליון של המסך.
- במקטע המסומן 1. מילת מפתח, בחר את סמל הגן עבור התנאים מהתפריט הנפתח, הקלט את סמל הגן של הגן של עניין באזור הריק של מקטע מילות המפתח , ובחר רקמות עבור אפשרות סוג .
- לחץ על לחצן החיפוש בתחתית ה -1. סעיף מילות מפתח . הוא מציג את גרפים הסיכום של ביטוי גנטי ברקמות נורמלי וגידולים של סוגי סרטן שונים מבוסס על U133A ו U122Plus2 פלטפורמות.
הערה: היא אופציונלית כדי לבחור את האפשרות סינון נתונים בחלק העליון של גרף הסיכום כדי לבודד מסד נתונים מסוים כדי ללמוד. - לחץ על הקישור לצד הורדת נתונים תוצאה כדי לגשת למידע המפורט אודות ערכי ביטוי הגנים, סוגי הרקמות ומקורות הנתונים.
4. האנציקלופדיה הרחבה של סרטן המכון (CCLE)
הערה: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) נוצר על ידי המכון הרחב ומספק פרופילים גנומית ומוטציות של 947 האדם תאים הסרטן האנושי20.
- הקלט את הגנים הרצויים לתוך סרגל החיפוש ולאחר מכן לחץ על לחצן החיפוש .
- במקטע שכותרתו בחירת ערכת נתונים, לחץ על האפשרות ביטוי Mrna (rnaseq) מהתפריט הנפתח.
הערה: אפשרויות אחרות כוללות את הביטוי mrna (Affy), שרין אכילס הסתרה והעתק מספר. - לחץ על לחצן החלף את כל העקבות . בחר את סוג הרקמה המעניינים מהתיבה האפורה שבצד ימין. גלול מטה לתחתית המסך ולחץ על לחצן ביטוי mRNA הורד .
- פתח את מסמך הטקסט שהורדת. העתק והדבק את כל הטקסט לגיליון 1. העתק את כל הטקסט שבגיליון 1.
- לחץ על הגיליון בכרטיסיה גיליון הגיליון האלקטרוני גליון 2 בחלק התחתון של הגיליון האלקטרוני. לחץ לחיצה ימנית על העמודה A , בחר הדבקה מיוחדתולאחר מכן בחר באפשרות ' בצע חילוף ' בגיליון 2.
- לאחר החלפת הטקסט בשתי עמודות בגיליון 2, לחץ על החץ הנפתח כדי למיין את כותרת האפשרות & סינון ולאחר מכן בחר באפשרות המסנן . חץ יופיע באזור הכותרת הנקרא גן. לחץ על החץ ולהקליד את סוג הרקמה של עניין.
הערה: שלב זה יסנן את כל הנתונים ויציג רק את רמות ביטוי הגנים של סוג הנייר המעניין.
5. ביוביוטל
הערה: ביוביוטל (www.cioportal.org) פותחה במרכז הסרטן בבית החולים הגדול (msk), וכניסה, מנתחת, ומדמיין נתונים גנומית של סרטן בקנה מידה רחב21,22. באופן ספציפי, הפורטל הזה מאפשר לחוקרים לחפש שינויים גנטיים ורשתות איתות.
- באמצעות השאילתה בדף הנחיתה, לחץ על האברים/רקמות העניין תחת המקטע המסומן בחירת מחקרים. בחר את מחקר מסוים של עניין, ואז להכות את השאילתה על ידי כפתור הגן.
- במקטע שכותרתו בחירת פרופילים גנומית, בחר מתוך שלוש האפשרויות: מוטציות, העתקה מספר שינויים במספר Gisticאו mrna ביטוי. בחרו עוד נתונים מתאימים מהתפריט הנפתח לבחירת ערכת מטופלים/אירועים.
- הזן את סמלי הגן היעד בתיבת השאילתה של הזן גנים. לחץ על לחצן שלח שאילתה .
- לחץ על הכרטיסייה רשת בחלק העליון של הדף כדי לאחזר את רשת הגנים הרצויה.
הערה: רשת האיתות מסומנת בצבע. הגנים הנכנסים מצוינים באמצעות צמתי seed עם גבול עבה. כל גן מיוצג על-ידי עיגול אדום, ועוצמת הצבע של העיגול האדום משקפת את תדר המוטציה שלו. גנים מחוברים על ידי קווים צבעוניים שונים. משמעות הקווים החומים "באותו מרכיב", המציינת את המעורבות באותו מרכיב ביולוגי. , הקווים הכחולים מתכוונים "מגיבים". מציינים תגובות גנים הקווים הירוקים מתכוונים "שינוי המדינה", ומציע כי גן אחד עלול לגרום לשינוי מדינה של גן אחר. - לחצו על הכרטיסייה ' קובץ ' בחלק העליון של התמונה כדי לבחור ' שמור כתמונה (PNG) ' להורדת תמונת רשת.
6. חיתוך דרוסופילה בעזרת גנוטיפים הרצויים וצביעת dapi
הערה: לאסוף את הנקבה הפילה עם גנוטיפים הרצוי, ולאחר מכן לנתח את השחלות לטוס לעבור את ההליכים של dapi הצביעת עבור הדמיה.
- הכינו לטוס מניות tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; א-אמא. א; ו- w [1118] כדי ליצור זבובים עם nicd-ביטוי יתר (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) ו nicd ואת אמא-אוברהביטוי (TJ-Gal4, Gal80ts/uas-אמא. A; יכולות UAS-NICD-GFP/+).
- החל את ביטוי הגנים הזמני והאזורי המכוון (TARGET) כדי לשלוט בביטוי הגן הזמני של המונח23. להעלות זבובים ב 18 ° צ' עד הבגרות, ואז לעבור 29 ° צ' עבור 48 h עם שמרים לפני חיתוך.
הערה: tj-Gal4 יכול לנהוג ביטוי uas רק בטמפרטורות גבוהות יותר, כאשר העיכוב על ידי Gal80ts הוא הקלה. תוספת של שמרים לפני הניתוח מגדיל את השחלות לקציר. - מקום 3 מ ל של 1 x פוספט באגירה מלוחים (PBS) (137 מ"מ, 2.7 mM KCl, 10 מ"מ Na2hpo4, 1.8 mm KH2הפו4) בתוך צלחת אוסף העובר. השתמש בלוח CO2 כדי להחטיף את הזבובים.
- בחר זבוב נקבה, ולאחר מכן בזהירות לתפוס את בית החזה התחתון של לעוף באמצעות זוג של מלקחיים מבתר ולהטביע אותו לתוך פתרון ה-PBS 1x בצלחת אוסף העובר. השתמש זוג שני של מלקחיים כדי לצבוט את הבטן התחתונה ולמשוך בעדינות כדי לשחרר את האיברים הפנימיים.
- לזהות ולנתק את זוג השחלות מהגוף לעוף. שבור את נדן השרירים הממוקם בקצה האחורי של השחלות והפרד את האושתנים.
הערה: הפרדת האושתנים ושבירת מעטפת השרירים נדרשת כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה יותר. - מניחים את השחלות בצינור צנטריפוגה 1.5 mL המכיל 500 μL של 1x PBS. הצינור צריך להישאר על הקרח עד כל השחלות נאספים.
- הסר את ה-PBS 1 x ומקום 0.5 mL של פתרון תיקון (4% פורמלדהיד) לתוך השפופרת. מניחים את הצינור על הנוטור. במשך 10 דקות
- הסר את פתרון התיקון מהצינור והיפטר ממנה במיכל פסולת מתאים. השתמש 1 mL של 1x PBT (1x PBS בתוספת 0.4% טריטון™ X-100) כדי לשטוף את 3x השחלות עבור 15 דקות.
- להשליך את הכביסה PBT הסופי ולהוסיף 1 מ ל של PBTG (0.2% בסרום שור, 5% סרום עז רגיל ב-1x PBT) כדי למנוע איגוד ספציפי.
הערה: ניתן לדלג על שלב זה לצביעת DAPI, אך היא חיונית לצביעת נוגדנים. כתמים אימונוהיסטוכימיה מפורטת ניתן למצוא ג ' יה ואח '24. - מקום 150 μL של DAPI (10 μg/mL) בצינור במשך 10 עד 15 דקות הרוטציה. להיפטר DAPI ולשטוף את השחלות 1 x עבור 10 דקות באמצעות 1 mL של 1x PBT. הסר את ה-PBT ושטוף את 2x עבור 10 דקות באמצעות 1x PBS.
- הסר את העודפים PBS עד כ 300 μL של PBS נשאר בצינור עם השחלות. Pipet השחלות למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות הפיפטה 200 μL, כדי לשחרר את תאי הביצה.
- בעדינות לסובב את הצינור בזהירות להסיר את הפתרון הגדול 1x PBS ככל האפשר מבלי להסיר את השחלות. מקום 120 μL של פתרון הרכבה (1 גרם n-פרופיל, 5 מ ל של 10X PBS, 40 מ ל של גליצרול ו 5 מ ל של dH2O) לתוך הצינור.
הערה: פתרון ההרכבה הוא דביק, כך קשה להעביר בדיוק 120 μL של הרכבה הפתרון לתוך צינור. כדי להקל על בעיה זו, ניתן להשתמש בתשר של 1,000 μL להוספת שלוש טיפות של פתרון הרכבה לתוך השפופרת. - להסיר כ 0.33 מ"מ מ-200 μL מתוך הטיפ להשתמש בקצה הפיפטה החדש כדי למקם את פתרון ההרכבה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ.
- בעדינות למקם את הזכוכית coverslip על הפתרון הרכבה ולאטום את הקצוות של שובר הכיסוי עם לק שקוף שקופה.
הערה: איטום קצות זכוכית העטיפה נדרש כדי למנוע מתאי הביצית לזרום בתוך הפתרון הגובר בעת נטילת תמונות מיקוד. - לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות ההגדרות הבאות: העדשה האובייקטיבית = 10x הגדלה; הצמצם מספריים = 0.8; פליטת DAPI באורך גל = 410-513 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך שהוזכר בשלב 1 באמצעות הפורטל PRECOG the Z-ציונים של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בסרטן השחלות הושגו (1.3, 2.32, 1.62, בהתאמה). הערכים השליליים של Z\u2012score מציינים את ההישרדות הכללית המסכנה של חולים עם רמות ביטויים גבוהים של שלושת הגנים. באמצעות עיצוב מותנה של תוכנת הגיליון האלקטרוני, ערכי הניקוד של Z\u2012score מוצגים בגרף של עמודות צבעוניות באיור 1.
מסד הנתונים CSIOVDB שימש כדי לאשר את הממצאים. באמצעות ההוראות בשלב 2, NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 היו ברציפות באופן רציף באזור החיפוש של מסד הנתונים csiovdb, ואת נתוני הישרדות המטופל הממוקם תחת הכרטיסייה הישרדות אוחזרו. בנוסף לנתונים ההישרדות הכוללת , CSIOVDB מספק הישרדות ללא מחלות. CSIOVDB עוד יותר מפריד חולים כדי להציג את נתוני ההישרדות המבוססים על רבעון 1 לעומת רבעון 4 (הרביעון התחתון לעומת הרביעון העליון) של רמות ביטוי גנים. עקבי עם ממצאים קודמים, ביטוי גבוה של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 לתאם עם הישרדות הכוללת המסכן הישרדות ללא מחלות (איור 2א, ב). בינתיים, הכרטיסייה הקליפיקו-הפרמטרים הפתולוגיים של CSIOVDB מספקת גם השוואה בין רמות ביטוי הגנים בין שלבים שונים לסרטן השחלות, ציונים, ותגובות קליניות עם בדיקות מאן-ויטני. התוצאות מראות כי רמות ביטוי גבוהות יותר של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 משויכים שלבים מתקדמים לסרטן השחלות (איור 2ג).
בגלל NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 הם קריטיים להישרדות החולה הכללית, רמות ביטוי גנים גידולים בשחלות ותאי סרטן נחקרו עוד. נתוני הביטוי של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 ברקמות השחלות הרגילות והגידול הורדו מפלטפורמת U133A באמצעות שלב 3 ההוראות עבור GENT. מדענים יכולים לעבד את הנתונים שהורדו בהתאם למטרות המחקר הספציפיות שלהם. כאן, היינו מנוצל את הנתונים כדי לייצר את הקופסה ומגרשים באמצעות גראפד פריזמה (גירסה 8). בדיקות נוספות הציע כי NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 מתבטאת מאוד ברקמות הגידול (איור 3א). בשלב הבא, נתוני הביטוי של NOTCH2, NOTCH3 וMAML1 בתאי סרטן השחלות הורדו בהתאם לצעד הפרוטוקול 4, באמצעות ccle. ביטויים גנטיים רמות של תאים סרטניים מוצגים על ידי הקופסה מגרשים (איור 3ב). למרות רמות הביטוי של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 הם גבוהים בקווי הסרטן, מסקנות לא יכול להיות נמשך עקב העדר של שורת תאים נורמליים במסד הנתונים של ccle. עם זאת, מדענים יכולים לזהות את המקור של קווי תאים סרטניים, ולהשוות את רמות הביטוי מבוסס על ציונים שונים, שלבים, ופרמטרים clinicopathological אחרים.
לאחר המשמעות של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בסרטן השחלות אושרו, cביובורטל היה מנוצל כדי לחקור את רשת האותות הקשורים שלהם. שימוש בשלב הפרוטוקול 5, השחלה/החצוצרה נבחר עבור מחקרים בחירה, ואז השחלות Serous CYSTADENOCARCINOMA (tcga, טבע 2011) dataset נבחרה לניתוח. עבור המקטע שכותרתו בחר פרופילים גנומית, ביטוי mrna נבחר, ולבסוף ביטוי mrna הפרופיל שלו (כל הגנים). עבור המקטע בחר בערכת מטופל/אירוע, האפשרות דוגמאות עם נתוני mrna (מיקרו-מערך agilent) (489) נבחרה מהתפריט הנפתח. בסוף, הגנים NOTCH2, NOTCH3ו- MAML1 נבחרו לשליחת השאילתה. מבוסס על שלושת הגנים ליבה, רשת איתות נוצר כדי לספק את 50 הגנים השכנים הנפוצים ביותר ששונו, אשר גם בנתיב זהה עם שיעורי המוטציה הגבוהה ביותר (איור 4).
מכיוון שאיתות מדרגה שימור היטב על-פני מינים, הוא נחקר בסרטן השחלות של דרוזוהילה . איתות מדרגה דווחה בעבר כדי לווסת את הפצת תאי הזקיק25, בידול26,27, ותקנה מחזור תאים28,29. ביטוי יתר של NICD בלבד לא לגרום לגידולים ב Drosophila ילה (איור 5א), כמו האפיתל של התאים ביצה drosophila ילה נשאר שלמים עם שכבה אחת. עם זאת, ביטוי יתר של NICD ואמא יחד המושרה גידולים ב Drosophila ילה (איור 5ב), אשר הפגינו על ידי שכבות אפיתל מרובות ותאים שהצטברו.
איור 1: ביטוי של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בסרטן השחלות קשורה הישרדות הכולל עניים. Z-עשרות ההישרדות של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בחולי סרטן השחלות מוצגים. הישרדות ירודה מצוין על-ידי ערכי Z\u2012score שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: רמות גבוהות של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בסרטן השחלות קשורים הישרדות הכולל עניים, הישרדות עניים ללא מחלות, ושלבים מתקדמים לסרטן. מסד הנתונים המיקרו-מערך CSIOVDB מספק את ההישרדות הכללית של קפלן ומאייר מגרשים ללא מחלות, הישרדות NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בחולי סרטן השחלות, ורמות ביטוי גנים בשלבי סרטן שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 מבוטא במידה רבה בגידולים השחלות ושורות תאים סרטניים. ערכי P מצוינים כדי להשוות ביטוי גנים בשחלות נורמלי גידולים השחלות המקביל. (קיצורים: שחלה-N = רקמות שחלות נורמליות; השחלה-C = סרטן השחלות רקמות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 גנים ורשת איתות הקשורים שלהם עם 50 הגנים הסמוכים ששונו לעתים קרובות. רשת האיתות מסומנת בצבע. הגנים הנכנסים מצוינים באמצעות צמתי seed עם גבול עבה. כל גן מיוצג על-ידי עיגול אדום, ועוצמת הצבע של העיגול האדום משקפת את תדר המוטציה שלו. גנים מחוברים על ידי קווים צבעוניים שונים. משמעות הקווים החומים "באותו מרכיב", המציינת את המעורבות באותו מרכיב ביולוגי. , הקווים הכחולים מתכוונים "מגיבים". מציינים תגובות גנים הקווים הירוקים מתכוונים "שינוי המדינה", ומציע כי גן אחד עלול לגרום לשינוי מדינה של גן אחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: Nicd ואמא ב drosophila ילה גם לגרום לגידולים בשחלות. א. ביטוי יתר של Nicd לבדו אינו מזרז את היווצרות הגידול בדרוסופילה. ב. ביטוי יתר של Nicd ואמא ביחד לגרום לגידולים בדרוזוהילה. סרגל בקנה מידה = 50 יקרומטר לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאחר וקיימות אינספור גישות ושיטות לניצול הביואינפורמטיקה, ישנם מספר מאגרים הזמינים באופן מקוון לציבור הרחב. ניתן להפיק שפע של מידע מכל אחד ממסדי הנתונים הללו, אך חלקם מתאימים במיוחד למטרות מסוימות, כגון הערכת הישרדות מטופלים המבוססת על כניסות מסוימות. ניתוחים שיטתיים של נתונים מאוחזרים ממסדי נתונים בודדים שונים עלולים להניב ממצאים מדעיים חשובים.
הניתוח הנוכחי מתמקד בתפקיד של איתות חריץ בסרטן השחלות באמצעות ניצול של ביואינפורמטיקה גישות. לדוגמה, ניתוח Meta-Z במסד הנתונים של הפורטל PRECOG שימש כדי לקבל Z-ציונים המציינים תוצאות הישרדות החולה במחקרים קליניים בסרטן. CSIOVDB הוא עוד מטא-ניתוח מסד נתונים ששימש לחקר תוצאות הישרדות של חולי סרטן השחלות. הנתונים CSIOVDB בהצלחה לאמת את הממצאים מפורטל PRECOG כי NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 הם קריטיים עבור הישרדות החולה הכוללת. מאוחר יותר, היישומים של מסדי נתונים GENT ו-CCLE הוכיחו עוד כי NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 מבוטא במידה רבה בגידולים בשחלות ובתאי הסרטן. השילוב של מסדי נתונים אלה חשף באופן שיטתי את התפקידים המשמעותיים של NOTCH2, NOTCH3, ו MAML1 בסרטן השחלות. שימוש זה בביואינפורמטיקה שיטות סיפק דרך יעילה לעשות מחקר הסרטן ביעילות ומראה כיצד הוא יכול להניב ממצאים חשובים עבור יישומים ניסיוניים וקליניים עתידיים.
ביואינפורמטיקה מספק לציבור את היכולת לגשת לתוצאות מאלפי ניסויים בבת אחת. המידע הנגזר ממסדי נתונים ציבוריים מספק דרך חסכונית ויעילה להקמת תכנון ניסיוני לפני ביצוע ניסויים. בנוסף, חשוב לציין שניתן להתפזר על נתונים זמינים בפומבי באמצעות פרסומים ולספק ממצאים לא עקביים או אפילו סותרים, הדורשים מטא-ניתוח שיבוצעו באמצעות הגישות של ביואינפורמטיקה. מדענים יכולים לעצב ולבצע ניסויים המבוססים על הנתונים שנמצאו באמצעות מסדי נתונים ביואינפורמטיקה גדולים כדי לאמת השערות מדעיות ספציפיות. תוצאות הניסוי Drosophila אישר את הממצאים ממסדי הנתונים בביואינפורמטיקה ותמך עוד יותר את הרעיון כי רכיבי מסלול חריץ צריך להמשיך להיחקר כמטרות התרופה הטיפולית פוטנציאליים. האימות המוצלח של ממצאים בביואינפורמטיקה באמצעות ניסויים גם מרמז על חשיבות הגישות של ביואינפורמטיקה לתגליות מדעיות.
ייתכן שקיימות מספר מגבלות של ביואינפורמטיקה. ראשית, ייתכן שאתרים/כלים מסוימים לא יעדכנו את הממצאים שלהם עקב מאמצי זמן או עלויות המשויכות לתחזוקה. שנית, אתרי אינטרנט/כלים מסוימים מתעדכנים באופן קבוע, אך העדכון עם קלט נוסף עשוי לשנות תוצאות שהתקבלו בעבר. שלישית, מפתחים של אתרים מסוימים/כלים שומרים על זכויות יוצרים ומגבילים את השימוש בתוכנם. ארבעה, ניתוחים או אלגוריתמים של אתרים/כלים מסוימים עשויים שלא להיות תמיד מדויקים.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה שלבים או שינויים ופתרון בעיות ליישומים עתידיים טובים יותר מוצעים. ראשית, אתרים/כלים מסוימים מאפשרים לחוקרים לטעון באופן ידני נתונים חדשים לצורך ניתוח. אם לא, החוקרים יכולים להוריד ולנתח את הנתונים האחרונים בעצמם. שנית, החוקרים צריכים להריץ שוב ושוב את הניתוחים שלהם, ולתעד את התאריכים. אם התוצאות ישתנו באופן משמעותי, ייתכן שהחוקרים יצטרכו להשתמש בקלט הנתונים הנוסף כדי להבין את הסיבות. שלישית, החוקרים יכולים למצוא אתר אינטרנט חלופי/הכלי כדי להפעיל את הניתוחים שלהם כדי למנוע בעיות זכויות יוצרים פוטנציאליים. רביעית, חוקרים יכולים לקבל אתרי אינטרנט נוספים/כלים כדי לאמת את הממצאים החשובים שלהם. אם יש בעיות עם ניתוחים או אלגוריתמים, החוקרים יכולים להוריד ולנתח מחדש את הנתונים כדי לתקן את הטעויות או להשתמש באתרי אינטרנט אחרים/כלים עם ההגדרות המתאימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי סטארט-Up מימון, המכללה למדעים ומענק מחקר מתמטיקה, פרס הפעלת מחקר קיץ, ופרס מימון זרעים מחקר מאוניברסיטת גאורגיה הדרומית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 1:1000 Dilution |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 | ThermoFisher | FLBP6651 | Dissolved with ddH2O to make 1X PBS |
| Goat serum | Gibco | 16210064 | Serum |
| Embryo dish | Electron Microscopy Sciences | 70543-45 | Dissection Dish |
| Nutating mixers | Fisherbrand | 88861041 | Nutator |
| tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B | Dr. Wu-Min Deng at Florida State University | N/A | Fly stock |
| w*; UAS-mam.A | Bloomington Drosophila Stock Center | #27743 | Fly stock |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | #5905 | Fly stock |
| The PRECOG portal | Stanford University | precog.stanford.edu | Publicly accessible database of cancer expression datasets |
| CSIOVDB | Cancer Science Institute of Singapore | csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html | Microarray database used to study ovarian cancer |
| The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal | Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) | medical–genome.kribb.re.kr/GENT | Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues. |
| Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) | Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research | portals.broadinstitute.org/ccle | Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines |
| cBioPortal | Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) | cioportal.org | Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks |
| Zeiss 710 Inverted confocal microscope | Carl Zeiss | ID #M 210491 | Examination and image collection of fluorescently labeled specimens |
References
- Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. , (2019).
- Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21 (7), 702-712 (2019).
- Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43 (1), 70-76 (2019).
- Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
- Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
- Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
- Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 722-735 (2016).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5 (2), 207-216 (2000).
- Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7761-7774 (2001).
- Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9 (5), 837-854 (2019).
- Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1 (5), 466-476 (2002).
- Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17 (6), 4914-4920 (2019).
- Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
- Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2 (9), 470-489 (2013).
- Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324 (7344), 1018-1022 (2002).
- Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21 (8), 938-945 (2015).
- Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6 (41), 43843-43852 (2015).
- Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6 (269), (2013).
- Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004 (220), 6 (2004).
- Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
- Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132 (2), (2019).
- Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209 (5), 301-311 (1999).
- Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132 (19), 4299-4308 (2005).
- Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
- Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131 (13), 3169-3181 (2004).
