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Developmental Biology

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60503

Summary

Questo protocollo descrive la microdissezione di cattura laser per l'isolamento della cartilagine e dell'osso da sezioni fresche congelate dell'embrione di topo. La cartilagine e l'osso possono essere rapidamente visualizzate mediante colorazione viola cresilio e raccolte proprio per produrre RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Abstract

La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare specifici tipi di cellule o regioni di interesse da tessuti eterogenei. La complessità cellulare e molecolare degli elementi scheletrici aumenta con lo sviluppo. L'eterogeneità dei tessuti, come l'interfaccia di elementi cartilanei e ossei tra loro o con tessuti circostanti, è un ostacolo allo studio dello sviluppo della cartilagine e dell'osso. Il nostro protocollo fornisce un metodo rapido di elaborazione dei tessuti e l'isolamento della cartilagine e dell'osso che produce RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica. I tessuti congelati freschi di embrioni di topo sono sezionato e breve colorazione viola cresyl viene utilizzato per visualizzare la cartilagine e le ossa con colori distinti dai tessuti circostanti. I vetrini vengono quindi rapidamente disidratati e la cartilagine e l'osso vengono successivamente isolati dalla LCM. La minimizzazione dell'esposizione a soluzioni acquose durante questo processo mantiene l'integrità dell'RNA. La cartilagine e l'osso mandibolare di Mouse Meckel a E16.5 sono stati raccolti con successo e l'analisi dell'espressione genica ha mostrato l'espressione differenziale dei geni marcatori per osteoblasti, osteociti, osteoclasti e condrociti. L'RNA di alta qualità è stato anche isolato da una serie di tessuti ed ere embrionali. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione del campione per LCM, tra cui crioincorporando, sezionamento, colorazione e disidratazione dei tessuti freschi congelati, e un preciso isolamento della cartilagine e dell'osso da parte di LCM, con conseguente RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Introduction

Il sistema muscolo-scheletrico è un sistema multicomponente composto da muscoli, tessuto connettivo, tendine, legamento, cartilagine e ossa, innervato dai nervi e vascolarizzato dai vasi sanguigni1. I tessuti scheletrici si sviluppano con una crescente eterogeneità cellulare e complessità strutturale. Cartilagine e ossa si sviluppano dallo stesso lignaggio dell'osteochondroprogenitor e sono altamente correlati. La cartilagine embrionale e l'osso si sviluppano in associazione con muscoli, nervi, vasi sanguigni e mesenchyme indifferenziato. La cartilagine può anche essere circondata da ossa, come la cartilagine di Meckel e la cartilagine condilar all'interno dell'osso mandibolare. Questi tessuti sono associati anatomicamente e interagiscono tra loro attraverso segnali extracellulari durante lo sviluppo. Nello studio dell'espressione genica nello sviluppo della cartilagine e dell'osso, un ostacolo è l'eterogeneità delle strutture scheletriche composte da più tipi di tessuto. L'isolamento preciso del tessuto specifico di interesse è fondamentale per un'analisi trascrizionale di successo.

La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare i tipi di cellule o le regioni di interesse all'interno di tessuti eterogenei, ed è riproducibile ed è sensibile al livello a singola cellula2. Può colpire e catturare con precisione le cellule di interesse per una vasta gamma di analisi a valle in trascrittomica, genomica e proteomica3,4. La qualità dell'RNA, del DNA o della proteina isolata può essere valutata con un bioanalisi o una piattaforma equivalente. Ad esempio, la qualità dell'RNA è indicata dal numero di integrità dell'RNA (RIN)5.

Qui, forniamo un protocollo per la rapida colorazione e isolamento della cartilagine e dell'osso da LCM da tessuti freschi congelati. Usiamo l'embrione di topo per dimostrare che questo protocollo produce RNA di alta qualità per la successiva analisi trascrittomica, come il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq).

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Protocol

I tessuti dei topi sono stati ottenuti in conformità con la Guida Nazionale di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio, e i protocolli di studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

1. Preparazione di fresco congelato Campione

  1. Dissezionare l'embrione o il tessuto di interesse. Incorporare il campione in uno stampo di incorporamento usa e getta con composto ottimale per la temperatura di taglio (OCT). Regolare l'orientamento del campione con una punta o un ago.
  2. Congelare rapidamente i campioni in un bagno di ghiaccio secco/metil-2-butane. Proseguire con il passo successivo o conservare a -80 gradi centigradi.
    NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Criosezione per Laser Capture Microdissection

  1. Scongelare il criostato e pulire le superfici interne con il 70% di etanolo. Trattare la piastra anti-roll e un paio di pinze con agente di decontaminazione RNase. Impostare il criostato sulla temperatura di taglio desiderata (da -18 a -22 gradi centigradi). Preparare un contenitore scartato con ghiaccio secco, ponendo una lastra di foglio di alluminio sul ghiaccio secco per lo stoccaggio temporaneo dei vetrini di esempio sezionato durante la criosezione.
    ATTENZIONE: Il ghiaccio secco è estremamente freddo. Maneggiare sempre il ghiaccio secco con cura e indossare guanti isolati ogni volta che lo maneggia.
  2. Trasferire il campione fresco congelato in un secchio di ghiaccio secco. Posizionare uno strato di composto oct su un supporto di criostato e posizionare immediatamente il campione sopra lo OCT con una leggera pressione. Quando l'OCT è completamente congelato, fissare il supporto con il campione nel braccio di taglio criostato.
  3. Lasciare il campione nel criostato per 15 min per equilibrato alla temperatura di taglio.
  4. Sezionare il tessuto e raccogliere le fette su vetrini a membrana di polietilene naftalato (PEN) con uno spessore di 12 m. Allineare sezioni consecutive sulla membrana. Una volta completato uno scivolo, lasciare asciugare le sezioni per alcuni minuti e trasferire la diapositiva sulla lamina nel contenitore di ghiaccio secco fino a quando non vengono raccolti tutti i vetrini necessari.
  5. Conservare i vetrini a -80 gradi centigradi in una scatola di diapositive.
    NOT: Lo spessore della sezione è scelto per massimizzare la quantità di tessuto raccolto, consentendo un taglio efficiente del tessuto, e può variare a seconda del tessuto di interesse. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Mantenere le diapositive libere dalla contaminazione da RNase. Evitare i cambiamenti di temperatura. Anche se i RIN di RNA dai vetrini immagazzinati per un massimo di 6 mesi possono ancora indicare un'alta qualità dell'RNA, si consiglia di utilizzare i vetrini il prima possibile.

3. Preparazione del campione per la microdissezione di cattura laser

  1. Preparare soluzioni per la colorazione e la disidratazione.
    1. Mettere 45 mL di 80% di etanolo in ciascuno dei tre tubi di centrifugazione da 50 mL sul ghiaccio. Etichettarli come #1, #2 e #3. Diluire l'etanolo con acqua libera RNase/DNase.
    2. Mettere sul ghiaccio 45 mL di 95% di etanolo in un tubo centrifuga 50 mL.
    3. Mettere sul ghiaccio 45 mL di 100% di etanolo in un tubo centrifuga di 50 mL.
    4. Mettere 45 mL di xilene in un tubo di centrifuga 50 mL a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Xylene deve essere usato in una cappa di fumi.
  2. Scongelare brevemente uno slitta reCIzolo posizionandolo contro una mano guantata, quindi lavare due volte per 30 s ciascuno in 45 mL di etanolo 80% (#1 e #2) con agitazione in tubi di centrifuga 50 mL per rimuovere il OCT.
    NOT: È importante rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office prima della colorazione, per evitare che lo OCT si sciolse durante la colorazione oscuri le sezioni. Le pinze possono essere utilizzate per facilitare la rimozione dello Strumento di personalizzazione di Office che non viene lavato via dall'agitazione.
  3. Posare la diapositiva su un foglio di lamina di alluminio. Pipette 0,8 mL di 0,1% di violetta cresila nel 50% di etanolo sullo scivolo e macchia per 30 s. Lavare il vetrino in 45 mL dell'80% di etanolo (#3) per 30 s, quindi disidratare con passaggio per 30 s ciascuno a 45 mL di 95% di etanolo, 100% etanolo, e xilene in tubi centrifugati 50 mL.
  4. Resistere ai vetrini su un delicato tergicristallo per 5 min per drenare xilene e sezioni secche.
    NOT: I vetrini devono essere asciugati completamente prima di LCM.

4. Microdissection di cattura laser

NOT: Indossare guanti nitrile privi di polvere durante l'esecuzione di LCM.

  1. Accendere il microscopio LCM, il laser e il computer. Accedere al computer e avviare il software. Ruotare la chiave nella posizione "On" per avviare il laser. Quando la luce verde (Laser) è accesa, premere il pulsante rosso per attivare il laser, quindi la luce (Laser) diventa rossa per indicare che il laser è pronto per l'uso.
    NOT: Il laser ha bisogno di circa 10 min per riscaldarsi.
  2. Impostare i tubi di raccolta.
    1. Inserire il tappo di un tubo di reazione a catena di polimerasi (PCR) da 0,5 mL nel collettore.
      NOT: Scegliere il collettore corrispondente per i tubi PCR desiderati (0,2 o 0,5 mL).
    2. Pipette 50 - L di buffer di estrazione (fornito dal kit di isolamento RNA elencato nella Tabella dei Materiali) nel tappo del tubo di raccolta di 0,5 mL.
    3. Inserire il dispositivo di raccolta nel microscopio.
    4. Nella finestra Cambia dispositivo raccoglitore, fare clic sul pulsante Sposta nel punto di riferimento per spostare il raccoglitore nel punto di riferimento (RP). Regolare lo stato attivo per visualizzare chiaramente il componente. Fare clic sulle frecce per spostare il componente al centro della vista.
  3. Caricare i vetrini dei campioni.
    1. Fare clic sul pulsante Sinistro Scarica nella barra degli strumenti per abbassare il supporto della diapositiva.
    2. Posizionare il vetrino nel supporto, con la sezione del tessuto rivolta verso il basso.
      NOT: Questo orientamento assicura che le sezioni di tessuto catturate cadano nel tappo del tubo di raccolta per gravità.
    3. Inserire nuovamente il supporto nello stage.
  4. Impostare i parametri laser.
    1. Selezionare l'opzione Controllo del menu Laser o fare clic sull'icona Laser.
    2. Regolare questi parametri come desiderato: Potenza, la potenza del laser; Aperture, la larghezza del laser; e Velocità, la velocità di taglio in modalità Disegno e Taglio.
      NOT: Testare il laser in un'area per interesse. Una maggiore potenza o un'apertura più grande facilita il taglio, ma provoca più danni alle cellule. Regolare la combinazione di potenza, apertura e velocità per ottenere un taglio efficiente e danni minimi al tessuto. Ad esempio, Potenza 40, Apertura 5 e Velocità 7 per il tessuto cartilagineo su una sezione di 12 m.
  5. Selezionare e tagliare le aree di interesse.
    1. Inizia con l'obiettivo 5x e trova le aree di interesse, quindi passa all'obiettivo (5x, 10x o 40x) che meglio mostra l'area di interesse.
      NOT: Dopo la colorazione viola cresil, le cartilagini sono macchie magenta e i tessuti mineralizzati appaiono marroni o neri, distinguibili dagli altri tessuti. Le immagini possono essere salvate utilizzando Salva immagine con nome dal menu File.
    2. Scegliere il tubo per la raccolta (A, B, C, D) facendo clic sul contrassegno nel raccoglitore.
    3. Scegliere Sposta e taglia o Disegna e taglia. In modalità Sposta e taglia, il campione viene tagliato manualmente, utilizzando il mouse o la penna touch-screen per disegnare le forme a mano libera. In modalità Disegno e Taglio, le forme possono essere disegnate a mano libera con il mouse o la penna touchscreen per il taglio successivo. Fare clic sul pulsante Avvia taglio per avviare il taglio laser.
    4. Una volta completato il taglio, il tessuto bersaglio con membrana PEN rientra nel tappo del tubo di raccolta per gravità. Ripetere la ripetizione 4.5 per raggruppare più aree di interesse, se necessario.
      NOT: La ripetizione di tagli o l'aumento di Potenza o Apertura possono essere necessari se il tessuto non cade nel tappo del tubo di raccolta a causa di un taglio incompleto. L'osso mineralizzato (marrone o nero) non può essere tagliato direttamente dal laser.
  6. Scaricare il collettore e chiudere con attenzione il tubo PCR. Mettere i tessuti microdispiantati nel ghiaccio secco. Proseguire con il passo successivo o conservare a -80 gradi centigradi.
    NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Ripetere da 4.2 a 4.6 per il campione successivo.

5. Lisi dei tessuti microdisseci e isolamento dell'RNA

  1. Scongelare i tessuti microabpati a temperatura ambiente. Centrifuga brevemente e incubare i campioni per 30 min a 42 gradi centigradi.
  2. Dopo l'incubazione, far girare il buffer di lisi verso il basso nel tubo PCR da 0,5 mL. Eseguire il trattamento DNase e l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit di isolamento RNA (vedere la Tabella dei materiali)seguendo le istruzioni del produttore.

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Representative Results

Sezioni coronali di tessuti murini congelati freschi a E16.5 sono stati utilizzati per dimostrare l'isolamento e la raccolta della cartilagine di Meckel (MC), della cartilagine condilare e dell'osso mandibolare di LCM. Gli embrioni di topo all'E16.5 sono stati sezionati e incorporati in stampi criogenici con composto oct. I campioni negli stampi sono stati rapidamente congelati in un ghiaccio secco e in un bagno di metile-2-butano e conservati a -80 gradi centigradi.

Per dimostrare la colorazione cresilviola della cartilagine e dell'osso, è stata eseguita la criosezione nel piano coronale e sono stati raccolti campioni sui vetrini del microscopio. Le sezioni sono state lavate, colorate e disidratate secondo il protocollo precedente (passaggio 3.2–3.4). I vetrini sono stati essiccati all'aria e montati con un supporto di montaggio permanente. Tutte le cartilagini esaminate erano macchie magenta (MC, cartilagine condilare, cartilagine nasale setto, cartilagine costale, cartilagine di osso presfenoide, cartilagine primordia del raggio e ulna) e tutti i tessuti mineralizzati erano macchiati di marrone o nero (Figura 1A–E). Sia la cartilagine che l'osso erano facilmente distinguibili dagli altri tessuti in più siti anatomici.

Per l'LCM, le teste di embrioni a E16.5 sono state seziorate nel piano coronale su vetrini a membrana PEN con uno spessore di 12 m, e 6-8 sezioni consecutive sono state raccolte per diapositiva e conservate a -80 gradi centigradi. Lo Strumento di personalizzazione di Office è stato rimosso e le sezioni sono state macchiate di cresil viola e disidratate seguendo il protocollo descritto in precedenza (passaggio 3.2–3.4). MC, cartilagine condilare, e le regioni ossee mandibolare sono stati selezionati e isolati da LCM (Figura 2). Le regioni selezionate sono cadute nel buffer di lisi nel tappo del tubo di raccolta. Per ottenere RNA sufficiente per il sequenziamento, abbiamo raggruppato 10 regioni di MC, 10 regioni della cartilagine condilar o 4 regioni di osso mandibolare in ogni tubo di raccolta, rispettivamente.

L'RNA è stato estratto utilizzando un kit di isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore. L'RNA totale è stato analizzato utilizzando un bio/re/ (Figura 3A–B). Per testare l'effetto della colorazione viola cresyl sulla qualità dell'RNA, abbiamo confrontato l'RNA dai campioni di ossa mandibolare macchiati con cresyl viola e campioni senza colorazione (il tessuto mineralizzato è visibile senza colorazione, ma la colorazione viola cresil migliora la visibilità per distinguere l'osso dai tessuti circostanti). Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'integrità dell'RNA tra i campioni macchiati (n ) e i campioni senza colorazione (n ) che indica la rapida colorazione viola del cresilo in questo protocollo ha un effetto insignificante sulla qualità dell'RNA (P - 0,858, t-test di Welch a due code, Figura 3C). Abbiamo usato il nostro protocollo per LCM di vari tessuti in diversi stadi di sviluppo e sono stati misurati i RIN, indicando un'elevata qualità dell'RNA (Figura 3D). Le rese medie di RNA da MC, cartilagine condylar, e osso mandibolare erano 7.50 - 1.45 ng, 12.55 - 2,75 ng, e 33.02 - 7.63 ng (Figura 3E) e la resa/area era rispettivamente di 19,73 x ng/mm2, 26,70 5,84 ng/mm2e 17.23 3.93 ng/mm2, rispettivamente (Figura 3F), senza differenze significative tra i tessuti (MC contro condivare, cartina, P - 0,383; cartilagine condilar contro osso mandibolare, P - 0,260; dell'osso mandibolare, P -0,674).

Le biblioteche sono state preparate e sequenziate come descritto in precedenza6,7. Una dimensione cDNA rappresentativa era di circa 500 bp (Figura 4A). I dati RNA-seq sono stati analizzati con MultiQC8. Abbiamo analizzato i dati DI RNA-seq da 18 campioni di LCM (MC1-6, cartilagine di Meckel; C1-6, cartilagine condilar; M1-6, osso mandibolare). I valori medi di qualità in ogni posizione di base nelle letture sono stati generati da FastQC, indicando chiamate di ottima qualità (Figura 4B). L'allineamento di lettura è stato analizzato con Picard (Figura 4C). Le letture hanno mostrato alte percentuali allineate e la percentuale media di letture allineate era del 75%. La copertura genica è stata analizzata con Picard (Figura 4D), che indicava una buona rappresentazione lungo la trascrizione dal 5' alla fine 3'.

L'analisi dell'espressione genica differenziale è stata eseguita6,7. C'erano 4.006 geni significativamente espressi in modo differenziale (P < 0,05) tra l'osso mandibolare e MC (Figura 5A). I geni specifici per osteoblasti o osteociti (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715e Sparc16) erano più altamente espressi nell'osso mandibolare rispetto a MC, mentre i geni specifici del condrocito (Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123e Sox524) erano più altamente espressi in MC rispetto all'osso mandibolare ( Figura5B e Tabella 1). Inoltre, marcatori osteoclast come Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328, e Oscar29 sono stati identificati come più altamente espressi nell'osso mandibolare rispetto a MC ( Figura5B e Tabella 1), indicando l'isolamento di successo dei tessuti mirati.

Figure 1
Figura 1: rappresentativa colorazione cresila viola della cartilagine e dell'osso nelle sezioni coronali dell'embrione di topo a E16.5. (A) Cartilagine di Meckel ed emimandible. (B) Cartilagine di Meckel, cartilagine condiltrale ed emimanabile. (C) Setto nasale e mascellane. (D) Cartilagine primordium dell'osso presfenoide e dell'osso palatino. (E) Cartilagine primordio del raggio, cartilagine primordio di ulna e cartilagine costale. C - cartilagine condilar; CC - cartilagine costale; CP - cartilagine primordium dell'osso presfenoide; M - emimandible; MC - Cartilagine di Meckel; MX - maxilla; NS - setto nasale; PL - osso palatino; R - cartilagine primordio di raggio; U - cartilagine primordium di ulna. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: regioni rappresentative isolate da LCM e raccolte per RNA-seq. (A-C) Rappresentante macchiato MC (A), cartilagine condilustra (B) ed emimandible con MC già isolato (C) in criosezione prima di LCM. (D-F) Le regioni in A, B e C dopo tessuti mirati sono state isolate da LCM. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Qualità dell'RNA e quantità di campioni di LCM. (A–B) Rappresentativo dell'elettroferogramma (A) e dell'immagine gel associata (B) da un bioanalizzatore per un campione di osso mandibolare. (C) RIN di RNA totale da campioni ossei mandibolici macchiati con violetta cresilo (n ) o senza colorazione (n ) . (D) RINi di RNA totale provenienti da diversi tessuti isolati da LCM. Cartilagine di Meckel a E16.5 (n . 6); Cartilagine di Condilar a E16.5 (n ) Osso mandibolare a E16,5 (n ) Cartilagine del setto nasale a E14.5 (n ) ; Cervello a E14.5 (n s 6); Cervello a E16.5 (n : 7); Cervello all'E18,5 (n . 4). (E) Rendimento dell'RNA totale da tre tessuti. Ogni frammento di cartilagine MC o condigliatore era una pozza di 10 regioni microdisseche della cartilagine e ogni campione di osso mandibolare era una pozza di 4 regioni microdissected di emimandible. (F) La resa per unità di superficie (ng/mm2) in ogni tessuto. I dati sono medi: s.e.m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: La qualità delle librerie e dei dati di RNA-seq generati da campioni di LCM. (A) Dimensioni rappresentative dei cDNA di una biblioteca da un campione osseo mandibolare determinato da un bioanalisi. (B-D) Analisi del controllo qualità di RNA-seq da 18 campioni di LCM (MC1-6, cartilagine di Meckel; C1-6, cartilagine condilar; M1-6, osso mandibolare) di MultiQC. (B) I valori medi di qualità in ogni posizione di base nelle letture sono stati generati da FastQC. Lo sfondo del grafico divide l'asse y in chiamate di ottima qualità (verde), chiamate di qualità ragionevole (arancione) e chiamate di scarsa qualità (rosso). (C) L'allineamento delle letture è stato analizzato da Picard. Il riepilogo viene visualizzato come percentuali delle letture allineate. (D) Copertura genica normalizzata analizzata con Picard. La trama indica la copertura media relativa lungo la trascrizione dalla fine 5' (sinistra) all'estremità 3' (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi dell'espressione differenziale dei dati RNA-seq provenienti dall'osso mandibolare e MC isolato da LCM. (A) Raggruppamento gerarchico di 4.006 geni significativamente espressi in modo differenziale (P < 0,05) tra l'osso mandibolare e MC. Per ogni tessuto sono state utilizzate tre repliche biologiche. M1-3, osso mandibolare; MC1-3,(B) Grafico vulcano che mostra i cambiamenti di piegatura e i valori P dei geni espressi in modo differenziale tra l'osso mandibolare e L'MC. Sono mostrati esempi di geni specifici delle cellule altamente espressi in modo differenziale: marcatori osteoblasti e osteociti in blu, marcatori osteoclasti in nero e marcatori di condrociti in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gene Tipo di cella log2FoldChange (Modifica di log2Fold) Espressione media Valore P regolato
Col1a1 Osteoblast/Osteocite 2.64 12.94 2.22E-05
Col1a2 Osteoblast/Osteocite 3.41 12.87 8.27E-07
Dkk1 Osteoblast/Osteocite 7.59 2.01 5.21E-03
Dmp1 Osteoblast/Osteocite 9.73 3.42 3.19E-04
Dstn Osteoblast/Osteocite 2.51 6.87 5.73E-07
Runx2 Osteoblast/Osteocite 1.24 8.62 4.08E-02
Sp7 Osteoblast/Osteocite 2.24 6.95 5.81E-03
Sparc Osteoblast/Osteocite 3.40 12.26 5.56E-09
Acp5 Osteoclast 3.38 5.74 6.46E-06
Csf1r Osteoclast 2.01 5.80 1.17E-04
Ctsk Osteoclast 3.19 7.56 5.73E-07
Itgb3 (in via Itgb3) Osteoclast 2.88 5.37 2.43E-04
Oscar Osteoclast 3.41 2.67 1.63E-04
Acan Condrocite -5.23 5.01 2.76E-04
Col2a1 Condrocite -3.61 9.47 3.29E-03
Col9a1 Condrocite -7.01 3.58 5.51E-03
Col9a2 Condrocite -5.40 3.76 2.60E-03
Col9a3 Condrocite -6.63 3.80 2.90E-02
Comp Condrocite -5.86 1.54 7.51E-03
Lect1 Condrocite -7.37 1.34 2.35E-02
Sox5 Condrocite -2.88 4.43 6.06E-04

Tabella 1: Espressione differenziale di geni noti in vari tipi di cellule di osso e cartilagine (osso mandibolare contro MC).

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Discussion

LCM consente l'isolamento di popolazioni cellulari arricchite o omogenee da tessuti eterogenei. I suoi vantaggi includono la cattura rapida e precisa delle cellule nel loro contesto in vivo, mentre i potenziali svantaggi includono che richiede tempo, costoso e limitato dalla necessità per l'utente di riconoscere sottopopolazioni distinte all'interno di un campione specificato30. Questo protocollo fornisce dettagli di LCM della cartilagine embrionale e dell'osso del topo, evidenziando l'uso della colorazione viola cresilina in una procedura rapida per visualizzare la cartilagine e l'osso per la raccolta precisa dei tessuti, pur mantenendo un'elevata integrità dell'RNA per la successiva analisi tramite RNA-seq. Una limitazione di questo protocollo è che il sistema LCM utilizzato qui non è in grado di tagliare direttamente attraverso i tessuti mineralizzati (ad esempio, il tessuto mandibolare in nero in Figura 2C); di conseguenza, l'intera area ossea deve essere sezionata. In particolare, le regioni ossificate microconcio isolate dalla MCM non sono omogenee e comprendono almeno le sottopopolazioni di osteoblasti, osteociti e osteoclasti (Tabella 1). Tuttavia, l'arricchimento da parte di LCM è prezioso in quanto il nostro studio precedente ha dimostrato che i cambiamenti trascrizionali in sottopopolazioni specifiche come gli osteoclasti nel tessuto osseo microdisteso possono ancora essere rilevati dall'RNA-seq6.

Per l'analisi dell'espressione genica, abbiamo ottimizzato la preparazione del campione e la procedura LCM per un'elevata qualità e resa dell'RNA. Il nostro protocollo inizia con tessuti congelati freschi. Le sezioni di tessuto fresco congelato consentono un'eccellente quantità e qualità dell'RNA estratto3,poiché l'mRNA è sensibile ai metodi standard di fissazione31. L'RNA è rapidamente degradato dalla contaminazione da RNase e il mantenimento di un ambiente privo di RNasi durante la preparazione del campione, LCM e l'isolamento dell'RNA è fondamentale per il successo dell'applicazione. L'esposizione all'acqua durante la lavorazione della sezione è dannosa per la qualità dell'RNA31,32. Il nostro protocollo limita tale esposizione, con il più alto livello di esposizione acquosa del 50% durante la colorazione viola del cresil. Abbiamo testato che una colorazione rapida (30 s) con 0.1% cresyl viola in 50% etanolo dà un colore distinguibile alla cartilagine e non abbassa l'integrità dell'RNA per l'analisi a valle come basso ingresso RNA-seq (Figura 3C e Figura 4). La resa/area (ng/mm2) è di circa 20 ng/mm2 (Figura 3F), simile o superiore ai metodi ottimizzati precedenti33. Secondo la densità delle cellule in MC e mandibula osso6, stimiamo che con questo protocollo il rendimento medio da una cellula è di circa 5 pg RNA per cellula, e 1-5 ng di RNA totale può essere estratto da 200-1,000 cellule, che può essere utilizzato per basso input RNA-seq6,7,33. Questa efficienza di rendimento è molto più elevata rispetto ai metodi LCM34stabiliti e anche superiore o simile ai recenti protocolli ottimizzati33,35.

La capacità di distinguere diversi tipi di cellule nelle sezioni istologiche è essenziale per una raccolta precisa di tessuti specifici di interesse. Cresyl violet è una macchia idrofila e di base che si lega agli acidi nucleici caricati negativamente36. Questa proprietà lo rende utile per contrastare la selettività di tipo cell37ed è una macchia istologica standard per i neuroni38. Cresyl violet è stato utilizzato in LCM per una varietà di tessuti, fornendo una buona morfologia dei tessuti e alta qualità RNA33,36,39,40. Rispetto ad altri metodi di colorazione, la colorazione viola cresyl fornisce dettagli citoplasmatici e nucleari e un basso tasso di degradazione dell'RNA32. Dimostriamo qui che la colorazione viola cresil è un metodo facile e veloce per visualizzare la cartilagine e l'osso e che il tessuto macchiato con questo metodo conserva un'elevata integrità dell'RNA. Il trattamento dello xilene è comunemente usato per la disidratazione dei tessuti prima di LCM35,36,41,42. Usiamo lo xilene per migliorare la visualizzazione della morfologia dei tessuti35, che è essenziale per distinguere i tessuti mirati, in particolare sui vetrini a membrana PEN che non sono così chiari otticamente come i vetrini in vetro chiaro. Non è stato rilevato alcun evento significativo di perdita di sezione dai vetrini PEN durante le fasi di colorazione e lavaggio, anche con agitazione per rimuovere lo OCT.

Microdroplet o microfluidica -based RNA-seq a cellula (scRNA-seq) è un metodo ad alto throughput per analizzare i trascrittomi dei tessuti con tipi di cellule eterogenee e ha cominciato ad essere utilizzato nella biologia scheletrica43. A differenza di LCM, scRNA-seq comporta disaggregazione enzimatica e/o meccanica del tessuto in singole cellule. La maggior parte dei protocolli per la preparazione di una singola cellula richiede l'incubazione dei tessuti a temperatura ambiente o di 37 gradi centigradi per periodi prolungati, il che altera il trascrittoma44,45. Inoltre, l'isolamento di singole cellule nella cartilagine e nell'osso può essere fisicamente limitato dalla complessità degli elementi scheletrici della trabecularizzazione e della mineralizzazione. È ancora una sfida tecnica isolare un numero sufficiente di cellule vitali dai tessuti scheletrici che sono accuratamente rappresentativi della diversità cellulare dei tessuti in vivo, e la dissociazione incompleta delle cellule può causare pregiudizi nella rilevazione dei tipi di cellule43. Mentre scRNA-seq consente l'identificazione di tipi di cellule distinte, la profondità di sequenziamento è bassa e gli approcci di sequenziamento tipici catturano 3' finali di trascrizione e non consentono l'analisi alternativa dello splicing. Bulk RNA-seq del tessuto derivato da LCM omogeneizza le differenze cellulari, ma consente il rilevamento completo della trascrizione e l'analisi alternativa dello splicing. LCM è quindi particolarmente utile per i tessuti scheletrici che non sono facilmente separabili dai tessuti circostanti e complessi internamente, e la preparazione fresca congelata del tessuto può preservare sia i profili trascrizionali che l'integrità dell'RNA per l'analisi trascrizionale. Un'altra debolezza dello scRNA-seq è che dopo la preparazione di una singola cellula, le informazioni spaziali delle cellule vengono perse. È stata sviluppata una combinazione di LCM e scRNA-seq per consentire lo studio del trascrittoma di un piccolo campione proveniente da posizioni geografiche definite (Geo-seq)46, che è un altro approccio di utilizzo di LCM per studiare l'espressione genica regionalizzata.

In sintesi, questo protocollo fornisce dettagli di LCM ottimizzato di cartilagine e ossa, evidenziando l'uso della colorazione viola cresilina in una procedura rapida per visualizzare la cartilagine e l'osso per la raccolta precisa dei tessuti, pur mantenendo un'elevata integrità dell'RNA per la successiva analisi da parte dell'RNA-seq. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per l'LCM della cartilagine e dell'osso in diversi stadi di sviluppo per l'analisi dell'espressione genica6,7, e può essere utilizzato anche per altri tessuti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Gli autori ringraziano il Biorepository e Pathology Core per l'accesso alla piattaforma Leica LMD 6500 presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

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Biologia dello sviluppo numero 154 microdissezione di cattura laser cartilagine di Meckel osso mandibolare cresyl violetto isolamento dell'RNA sequenziamento dell'RNA
Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica
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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H.,More

Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

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