Summary
يصف هذا البروتوكول التشريح المجهري للتقاط الليزر لعزل الغضروف والعظم من الأجزاء المجمدة الطازجة من جنين الفاره. الغضروف والعظم يمكن تصورها بسرعة بواسطة تلطيخ البنفسج كريريل وجمعت علي وجه التحديد لإنتاج الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.
Abstract
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا المحددة أو المناطق ذات الاهتمام من الانسجه غير المتجانسة. التعقيد الخلوي والجزيئي للعناصر الهيكل العظمي يزيد مع التنمية. تغاير الانسجه ، مثل في واجهه العناصر الغضروفية والعظمية مع بعضها البعض أو مع الانسجه المحيطة بها ، هو عقبه واحده لدراسة تطوير الغضروف والعظام. بروتوكولنا يوفر طريقه سريعة لمعالجه الانسجه وعزل الغضروف والعظام التي تعطي الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة لتحليل التعبير الجيني. يتم تقسيم الانسجه المجمدة الطازجة من الاجنه الماوس ويتم استخدام قصيرة البنفسجية التلون الأرجواني لتصور الغضروف والعظم مع ألوان المتميزة من الانسجه المحيطة بها. ثم يتم تجفيف الشرائح بسرعة ، ويتم عزل الغضروف والعظم في وقت لاحق من قبل LCM. التقليل من التعرض للحلول المائية اثناء هذه العملية يحافظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي. تم جمع بنجاح الغضروف الماوس Meckel وعظم فك في E 16.5 وتحليل التعبير الجيني أظهرت التعبير التفاضلي من الجينات علامة لعظم ، والخلايا العظمية ، والعظم ، والغضروفي. كما تم عزل الحمض الريبي عالي الجودة من مجموعه من الانسجه والاعمار الجنينية. هذا البروتوكول تفاصيل اعداد العينة ل LCM بما في ذلك كريومبيدينج ، التقطيع ، تلطيخ وتجفيف الانسجه المجمدة الطازجة ، وعزل دقيق من الغضروف والعظم من قبل LCM مما ادي إلى الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.
Introduction
الجهاز العضلي الهيكلي هو نظام متعدد المكونات يتكون من العضلات, النسيج الضام, وتر, الرباط, الغضروف, والعظام, العصبية من الأعصاب والاوعيه الدموية بواسطة أوعيه دموية1. تتطور انسجه الهيكل العظمي مع زيادة التغاير الخلوي والتعقيد الهيكلي. الغضروف والعظام تتطور من نفس النسب أوستيوتشوندروبروجينيتور وذات الصلة للغاية. الغضروف الجنيني والعظام تتطور بالتعاون مع العضلات والأعصاب والاوعيه الدموية ، وغير متمايزة مسسبي. ويمكن أيضا ان يكون الغضروف محاطا بالعظم ، مثل غضروف ميكيل والغضروف المخروطي داخل عظم الفك. هذه الانسجه هي المرتبطة تشريحيا وتتفاعل مع بعضها البعض من خلال إشارات خارج الخلية اثناء التنمية. في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضروف والعظام ، عقبه واحده هي تغاير الهياكل الهيكلية التي تتالف من أنواع متعددة من الانسجه. العزل الدقيق للانسجه المحددة ذات الاهتمام هو المفتاح للتحليل الناجح للتحويل.
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا أو مناطق الاهتمام داخل الانسجه غير المتجانسة ، وهي قابله للتكرار وحساسة لمستوي الخلية الواحدة2. يمكن ان تستهدف بدقه والتقاط الخلايا من الفائدة لمجموعه واسعه من الاختبارات المصب في النسخ ، والجينوم ، وبروبروتيميكس3،4. ويمكن تقييم نوعيه الحمض النووي الريبي المعزول أو الدنا أو البروتين باستخدام محلل حيوي أو منصة مكافئه. مثلا, [رنا] أشرت نوعيه ب ال [رنا] نزاهة رقم ([رين])5.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتلطيخ السريع والعزلة من الغضروف والعظام من قبل LCM من الانسجه المجمدة الطازجة. نحن نستخدم الجنين الفار لإثبات ان هذا البروتوكول غله عاليه الجودة الجيش النيبالي الممتاز للتحليل اللاحقة الناسخ ، مثل التسلسل RNA (RNA-seq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول علي الانسجه من الفئران وفقا لدليل المعاهد الصحية الوطنية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية ، وتمت الموافقة علي بروتوكولات الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام في كليه الطب في إياهن في جبل سيناء.
1. اعداد العينات المجمدة الطازجة
- تشريح الجنين أو الانسجه ذات الفائدة. تضمين العينة في قالب تضمين المتاح مع الأمثل درجه حرارة القطع (أكتوبر) مجمع. ضبط اتجاه العينة مع تلميح أو ابره.
- تجميد العينات بسرعة في الجليد الجاف/ميثيل-2-البوتان حمام. المتابعة إلى الخطوة التالية أو تخزين في-80 درجه مئوية.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
2. التجميد للتقاط الليزر المجهرية تشريح
- تذويب البرد وتنظيف الأسطح الداخلية مع 70 ٪ الايثانول. علاج المضادة--لفه لوحه وزوج من ملقط مع عامل أزاله التلوث RNase. تعيين التبريد إلى درجه حرارة القطع المطلوبة (-18 إلى-22 درجه مئوية). اعداد حاويه بغطاء مع الثلج الجاف ، ووضع ورقه من رقائق ألومنيوم علي الجليد الجاف للتخزين المؤقت للشرائح عينه مقسمه اثناء التجميد.
تحذير: الثلج الجاف بارد جدا. دائما التعامل مع الثلج الجاف مع الرعاية وارتداء قفازات معزولة كلما التعامل معها. - نقل العينة المجمدة الطازجة إلى دلو من الثلج الجاف. وضع طبقه من أكتوبر مركب علي حامل العينة الباكية ووضع العينة علي الفور علي راس OCT مع ضغط لطيف. عندما يتم تجميد OCT تماما ، ربط حامل مع العينة في قطع الذراع الباكية.
- ترك العينة في البرد لمده 15 دقيقه لتتوازن إلى درجه حرارة القطع.
- قسم الانسجه وجمع الشرائح علي الشرائح غشاء البولي إيثيلين (PEN) الاغشيه بسماكة 12 μm. محاذاة المقاطع المتتالية علي الغشاء. مره واحده يتم الانتهاء من الشريحة ، والسماح للأقسام لتجف لبضع دقائق ونقل الشريحة إلى إحباط في حاويه الثلج الجاف حتى يتم جمع جميع الشرائح المطلوبة.
- تخزين الشرائح في-80 درجه مئوية في مربع شريحة.
ملاحظه: يتم اختيار سماكه القسم لتعظيم كميه الانسجه التي تم جمعها مع السماح بالقطع الفعال للانسجه ، وقد تختلف تبعا للانسجه ذات الاهميه. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. الحفاظ علي الشرائح خاليه من التلوث RNase. تجنب التغيرات في درجات الحرارة. علي الرغم من ان الجيش النيبالي الريبي من الشرائح المخزنة لمده تصل إلى 6 أشهر قد لا تزال تشير إلى جوده عاليه من RNA ، ونحن نوصي باستخدام الشرائح في أقرب وقت ممكن.
3. اعداد عينه للتقاط الليزر المجهرية تشريح
- اعداد حلول لتلطيخ والجفاف.
- مكان 45 mL من الايثانول 80 ٪ في كل من أنابيب الطرد المركزي 3 50 mL علي الجليد. قم بتسميتها علي انها #1 و#2 و#3. تمييع الايثانول مع المياه الحرة RNase/DNase.
- مكان 45 mL من 95 ٪ الايثانول في أنبوب الطرد المركزي 50 mL علي الجليد.
- مكان 45 mL من 100 ٪ الايثانول في أنبوب الطرد المركزي 50 mL علي الجليد.
- مكان 45 mL من اكسيلين في أنبوب الطرد المركزي 50 mL في درجه حرارة الغرفة.
تحذير: يجب استخدام اكسيلين في غطاء الدخان.
- ذوبان الشريحة غشاء القلم لفتره وجيزة عن طريق وضعه ضد اليد قفاز ، ثم يغسل مرتين ل 30 ثانيه في كل 45 ml من 80 ٪ الايثانول (#1 وال#2) مع التحريض في أنابيب الطرد المركزي 50 ml لأزاله OCT.
ملاحظه: من المهم أزاله OCT قبل تلطيخ ، لمنع OCT خففت اثناء تلطيخ من حجب الأقسام. يمكن استخدام الملقط لتسهيل أزاله OCT التي لا تغسل بواسطة الانفعالات. - وضع الشريحة علي ورقه من رقائق ألومنيوم. ماصه 0.8 ml من 0.1 ٪ البنفسج كريريل في 50 ٪ الايثانول علي الشريحة ووصمه عار ل 30 ق. اغسل الشريحة في 45 مل من 80 ٪ الايثانول (#3) لمده 30 ثانيه ، ثم ديهيدرات عن طريق المرور لمده 30 ثانيه كل من خلال 45 ml من 95 ٪ الايثانول ، 100 ٪ الايثانول ، و الزيلين في أنابيب الطرد المركزي 50 ml.
- الوقوف الشرائح علي ممسحة مهمة حساسة لمده 5 دقائق لاستنزاف اكسيلين والأقسام الجافة.
ملاحظه: يجب تجفيف الشرائح تماما قبل LCM.
4. التصوير بالليزر التشريح المجهري
ملاحظه: ارتداء قفازات النتريل مجانا مسحوق اثناء أداء lcm.
- قم بتشغيل المجهر LCM والليزر والكمبيوتر. قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر وبدء تشغيل البرنامج. قم بتحويل المفتاح إلى الموضع "تشغيل" لبدء تشغيل الليزر. عندما يكون الضوء الأخضر (ليزر) علي ، اضغط علي الزر الأحمر لتنشيط الليزر ، ومن ثم ضوء (ليزر) يتحول الأحمر يشير ليزر علي استعداد للاستخدام.
ملاحظه: يحتاج الليزر حوالي 10 دقيقه للتدفئة. - قم باعداد أنابيب التجميع.
- ادراج الحد الأقصى لل 0.5 mL البلمره سلسله تفاعل (PCR) أنبوب في جامع.
ملاحظه: اختيار جامع مطابقه للأنابيب PCR المطلوب (0.2 أو 0.5 mL). - ماصه 50 μL من المخزن المؤقت استخراج (التي تقدمها مجموعه العزل RNA المدرجة في جدول المواد) في الغطاء من أنبوب جمع 0.5 mL.
- ادخل جهاز التجميع في المجهر.
- في الإطار " تغيير جهاز جامع " ، انقر فوق الزر الانتقال إلى النقطة المرجعية لنقل المجمع إلى النقطة المرجعية (RP). اضبط التركيز لعرض RP بوضوح. انقر فوق الأسهم لنقل RP إلى مركز طريقه العرض.
- ادراج الحد الأقصى لل 0.5 mL البلمره سلسله تفاعل (PCR) أنبوب في جامع.
- تحميل الشرائح عينه.
- انقر فوق الزر إلغاء التحميل الأيسر في شريط الاداات لخفض حامل الشريحة.
- ضع الشريحة في الحامل ، مع مواجهه القسم النسيجي للأسفل.
ملاحظه: هذا التوجه يضمن ان المقاطع الانسجه الملتقطة تقع في الغطاء من أنبوب جمع حسب الجاذبية. - ادخل الحامل مره أخرى إلى المرحلة.
- قم باعداد معلمات الليزر.
- حدد خيار التحكم من القائمة ليزر أو انقر علي أيقونه ليزر .
- ضبط هذه المعلمات علي النحو المطلوب: السلطة، وقوه الليزر. فتحه, العرض من الليزر; والسرعة، وسرعه القطع في رسم ووضع قص .
ملاحظه: اختبر الليزر في منطقه بعيدا عن الاهتمام. الطاقة العالية أو الفتحة الأكبر تجعل من السهل قطعها ولكنها تسبب المزيد من الضرر للخلايا. ضبط مزيج من السلطة ، والفتحة ، والسرعة للحصول علي قطع فعاله والحد الأدنى من الضرر من الانسجه. علي سبيل المثال ، الطاقة = 40 ، الفتحة = 5 ، والسرعة = 7 للانسجه الغضروف علي قسم 12 μm.
- حدد وقطع مجالات الاهتمام.
- تبدا مع 5x الهدف والعثور علي مجالات الاهتمام ، ومن ثم التحول إلى الهدف (5x ، 10x ، أو 40x) التي تظهر أفضل منطقه الاهتمام.
ملاحظه: بعد تلطيخ البنفسج الهلالي ، والغضاريف الملونة الأرجواني والانسجه المعدنية تظهر البني أو الأسود ، يمكن تمييزها من الانسجه الأخرى. يمكن حفظ الصور باستخدام حفظ الصورة باسم من القائمة ملف . - اختيار أنبوب لجمع (A ، B ، C ، D) عن طريق النقر علي علامة في جامع.
- اختر نقل وقص أو رسم وقص. في التحرك ووضع قص ، يتم قطع العينة يدويا ، وذلك باستخدام الماوس أو القلم الشاشة التي تعمل باللمس لرسم الاشكال الحرة. في رسم وقص الوضع ، قد يتم رسمها الاشكال الحرة مع الماوس أو القلم الذي تعمل باللمس لقطع اللاحقة. انقر فوق بدء قص زر لبدء القطع بالليزر.
- وبمجرد الانتهاء من قطع ، والانسجه المستهدفة مع غشاء القلم يقع في الغطاء من أنبوب جمع من الجاذبية. كرر 4.5 لتجمع مناطق متعددة من الاهتمام إذا لزم الأمر.
ملاحظه: قد يكون تكرار التخفيضات أو زيادة الطاقة أو الفتحة ضروريا إذا لم ينخفض النسيج إلى الحد الأقصى لأنبوب التجميع بسبب القطع غير المكتملة. لا يمكن قطع العظام المعدنية (البني أو الأسود) مباشره عن طريق الليزر.
- تبدا مع 5x الهدف والعثور علي مجالات الاهتمام ، ومن ثم التحول إلى الهدف (5x ، 10x ، أو 40x) التي تظهر أفضل منطقه الاهتمام.
- تفريغ جامع وإغلاق بعناية أنبوب PCR. ضع الانسجه المجهرية في الثلج الجاف. المتابعة إلى الخطوة التالية أو تخزين في-80 درجه مئوية.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. كرر 4.2 إلى 4.6 للعينه التالية.
5. تحلل من الانسجه المجهرية والعزلة RNA
- أذابه الانسجه المجهرية في درجه حرارة الغرفة. الطرد المركزي لفتره وجيزة واحتضان عينات لمده 30 دقيقه في 42 درجه مئوية.
- بعد الحضانة ، تدور العازلة تحلل إلى أسفل في أنبوب PCR 0.5 mL. اجراء العلاج DNase واستخراج RNA باستخدام مجموعه العزل RNA (انظر جدول المواد) اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمت المقاطع الاكليليه من انسجه الفئران المجمدة الطازجة في البريد 16.5 لإظهار العزلة وجمع الغضروف meckel (MC) ، والغضروف فيزيولوجي ، وعظم فك من قبل lcm. تم تشريح أجنه الفئران في البريد 16.5 وجزءا لا يتجزا في قوالب المبردة مع مجمع أكتوبر. وجمدت العينات في قوالب بسرعة في الجليد الجاف وحمام ميثيل-2-البوتان وتخزينها في-80 درجه مئوية.
لإظهار تلطيخ البنفسج الأوج من الغضروف والعظام ، وأجريت التجميد في الطائرة الاكليليه وجمعت عينات علي الشرائح المجهر. تم غسل المقاطع وتلطيخها وتجفيفها باتباع البروتوكول المذكور أعلاه (الخطوة 3-2-3.4). وكانت الشرائح الهواء المجفف وشنت مع المستمر المتوسطة المتصاعدة. وكانت جميع الغضاريف التي فحصت الأرجواني الملون (MC ، غضروف كونديلار ، غضروف الحاجز الأنفي ، الغضروف الساحلي ، بريمورديوم الغضروف من العظام presphenoid ، الغضروف الغضروفي من نصف قطرها والulna) وجميع الانسجه المعدنية كانتملطخهالبني أو الأسود (الشكل 1 تم تمييز كل من الغضروف والعظم بسهوله من الانسجه الأخرى في مواقع تشريحيه متعددة.
بالنسبة لل LCM ، تم تقسيم رؤوس الاجنه في الطائرة التي تبلغ 16.5 في المستوي الإكليلي علي شرائح PEN الغشائية بسماكة 12 ميكرومتر ، وتم تجميع 6 إلى 8 أقسام متتالية لكل شريحة وتخزينها في-80 درجه مئوية. تمت أزاله OCT والمقاطع ملطخه بالبنفسج الهلالي والمجفف بعد البروتوكول الموصوف أعلاه (الخطوة 3.2 – 3.4). تم اختيار MC ، والغضروف فيزيولوجي ، والمناطق عظم الفك وعزله من قبل lcm (الشكل 2). أسقطت المناطق المحددة في المخزن المؤقت لتحلل في الحد الأقصى لأنبوب التجميع. للحصول علي ما يكفي من الحمض الريبي النيبالي للتسلسل ، ونحن تجميعها 10 مناطق MC ، 10 مناطق من الغضروف فيزيولوجي أو 4 مناطق من عظم فك في كل أنبوب جمع كعينه واحده ، علي التوالي.
تم استخراج الحمض الريبي النيبالي باستخدام مجموعه العزل RNA بعد تعليمات الشركة المصنعة. تم تحليل الحمض الريبي النيبالي الإجمالي باستخدام محلل حيوي (الشكل 3ا – ب). لاختبار تاثير الصبغة البنفسجية كريريل علي نوعيه الحمض الريبي النيبالي ، قارننا الحمض الريبي النيبالي من عينات العظم فك الملطخة بالبنفسج والعينات بدون تلطيخ (الانسجه المعدنية مرئية بدون تلطيخ ، ولكن تلطيخ البنفسج كريريل يعزز الرؤية لتمييز العظام من الانسجه المحيطة). ولوحظ عدم وجود فرق كبير في سلامه الحمض الريبي النيبالي بين عينات ملطخه (ن = 4) وعينات دون تلطيخ (ن = 4) ، مشيرا إلى تلطيخ البنفسج السريع في هذا البروتوكول له تاثير ضئيله علي نوعيه الحمض الريبي النيبالي (P = 0.858 ، واثنين من الذيل ولش t-اختبار ، الشكل 3ج). استخدمنا بروتوكول ل LCM من الانسجه المختلفة في مراحل النمو المختلفة وتم قياسها ، مشيرا إلى جوده عاليه الحمض الريبي النيبالي (الشكل 3د). وكان متوسط غله الحمض الريبي النيبالي من MC ، الغضروف فيزيولوجي ، وعظم فك 7.50 ± 1.45 ng ، 12.55 ± 2.75 ng ، و 33.02 ± 7.63 ng (الشكل 3ه) وكان العائد/المنطقة 19.73 ± 3.82 ng/mm2، 26.70 ± 5.84 ng/mm2، و 17.23 ± 3.98 ng/mm2، علي التوالي (الشكل 3و) ، دون اختلاف كبير بين الانسجه (MC مقابل غضروف فيزيولوجي ، p = 0.383 ؛ الغضروف فيزيولوجي مقابل عظم فك MC مقابل عظم فك ، P = 0.674).
وقد أعدت المكتبات وتسلسلها علي النحو المبين سابقا6و7. وكان حجم cDNA ممثل تقريبا 500 bp (الشكل 4ا). وقد تم تحليل البيانات المتسلسلة RNA مع MultiQC8. حللنا البيانات المتسلسلة للجيش النيبالي التابع من 18 عينه LCM (MC1-6 ، غضروف ميكيل ؛ C1-6 ، غضروف كونديلار. M1-6 ، عظم فك). تم إنشاء قيم الجودة المتوسطة عبر كل موضع أساسي في القراءات بواسطة FastQC ، مما يشير إلى مكالمات ذات جوده جيده جدا (الشكل 4ب). تم تحليل المحاذاة للقراءة مع Picard (الشكل 4ج). وأظهرت القراءة نسبا عاليه المحاذاة وكان متوسط النسبة المئوية لعدد القراءات المحاذية 75%. تم تحليل التغطية الجينية مع Picard (الشكل 4د) ، الذي أشار إلى تمثيل جيد علي طول النص من 5 ' إلى 3 ' نهاية.
اجري تحليلالتعبير الجيني التفاضلي 6 ،7. كانت هناك 4,006 جينات مختلفه بشكل ملحوظ (P < 0.05) بين العظم الفك و MC (الشكل 5ا). الجينات الخاصة لعظم أو العظام (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, dstn13, Runx214, Sp715, و sparc16) كانت أكثر بشكل كبير في عظم الفك مقارنه مع MC, في حين ان الجينات الخاصةغضروفي (كان17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123, و Sox524) وأعرب أكثر من ذلك بشكل كبير في MC مقارنه بعظم فك (الشكل 5ب والجدول 1). الاضافه إلى ذلك ، تم تحديد العلامات العظمية مثل Acp525، Csf1r26، ctsk27، Itgb328، وأوسكار29 كما تم التعبير عنها بشكل كبير في عظم الفك مقارنه مع MC (الشكل 5ب والجدول 1) ، مما يدل علي العزلة الناجحة للانسجه المستهدفة.
الشكل 1: التمثيل البنفسجي لتلطيخ الغضروف والعظم في الأجزاء الاكليليه من جنين الفاره في البريد 16.5. (ا) غضروف ميكيل والشلل النصفي. (ب) غضروف ميكيل ، غضروف الفك المخروطي ، والورم النصفي. (ج) الحاجز الأنفي والفكوك. (د) الغضروف الغضروفي للعظام المفصلية والعظم الحناني. (ه) الغضروف البريديوم من نصف قطرها ، الغضروف الغضروفي من ulna ، والغضروف الساحلي. C = غضروف كونديلار; CC = الغضروف الساحلي. CP = الغضروف الغضروفي للعظام المسبقة الفينول; M = hemimandible; MC = غضروف ميكيل; MX = maxilla; NS = الحاجز الأنفي; PL = العظم الحنيني; R = الغضروف بريبريديوم من دائره نصف قطرها; U = الغضروف بريبريديوم من ulna. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المناطق التمثيلية المعزولة بواسطة LCM والتي تم جمعها لل RNA المتسلسل. (الف – جيم) ممثل mc الملون (A) ، الغضروف فيزيولوجي (B) ، والhemimandible مع mc معزولة بالفعل (C) في كرويكتيون قبل lcm. (مد-واو) المناطق في A ، B ، و C بعد الانسجه المستهدفة كانت معزولة من قبل LCM. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نوعيه الحمض الريبي النيبالي وكميه عينات LCM. (الف-باء) الكهربائية التمثيلية (a) والصورة هلام المرتبطةبها (B) من محلل حيوي لعينه العظام فك. (ج) العدد الإجمالي لل RNA من عينات العظم فك الملطخة بالبنفسج الهلالي (ن = 4) أو بدون تلطيخ (ن = 4). (د) الحمض الريبي الإجمالي من الانسجه المختلفة المعزولة بواسطة lcm. غضروف ميكيل في البريد 16.5 (ن = 6); غضروف كونديلار في البريد 16.5 (ن = 6) ؛ فك العظام في البريد 16.5 (ن = 6) ؛ غضروف الحاجز الأنفي عند البريد 14.5 (n = 6) ؛ الدماغ في ه 14.5 (ن = 6); الدماغ في البريد 16.5 (ن = 7); دماغ في [ا] 18.5 ([ن] = 4). (ه) العائد من الحمض الريبي الإجمالي من ثلاثه انسجه. وكان كل عينه من الغضروف MC أو فيزيولوجي بركه من 10 المناطق الدقيقة من الغضروف وكانت كل عينه من العظم فك بركه من 4 المناطق المجهرية من hemimandible. (و) الغلة لكل وحده منطقه (ng/mm2) في كل نسيج. البيانات هي يعني ± s.e.m. الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: جوده المكتبات والبيانات المتسلسلة للجيش الريبي النيبالي المتولدة من عينات LCM. (ا) الاحجام التمثيلية لمكتبه من عينه العظم فك التي يحددها محلل حيوي. (ب-د) تحليل مراقبه الجودة لل RNA-seq من 18 عينات LCM (MC1-6 ، غضروف ميكيل ؛ C1-6 ، غضروف كونديلار. M1-6 ، فك العظام) من قبل MultiQC. (ب) تم إنشاء قيم الجودة المتوسطة عبر كل موضع أساسي في القراءات بواسطة fastqc. خلفيه الرسم البياني يقسم محور y إلى مكالمات ذات نوعيه جيده جدا (الأخضر) ، والمكالمات من نوعيه معقولة (البرتقالي) ، والمكالمات من نوعيه رديئه (الأحمر). (ج) تم تحليل مطابقه القراءات من قبل picard. يتم عرض الملخص كنسب القراءة المحاذاة. (د) التغطية الجينية الطبيعية التي حللت مع picard. المؤامرة تشير إلى متوسط التغطية النسبية علي طول النص من 5 ' نهاية (يسار) إلى 3 ' نهاية (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل التعبير التفاضلي للبيانات المتسلسلة لل RNA من عظم فك و MC المعزولة بواسطة LCM. (ا) التجميع الهرمي ل4,006 الجينات التي تم التعبير عنها بشكل مختلف إلى حد كبير (P < 0.05) بين العظم الفك والمولود الواحد. واستخدمت ثلاثه نسخ متماثلة البيولوجية لكل نسيج. M1-3 ، عظم فك. MC1 ، MC. (B) بركان المؤامرة تظهر التغييرات اضعاف و P-القيم من الجينات التي أعرب عنها بشكل مختلف بين العظم فك و MC. وتظهر أمثله علي الجينات الخاصة بالخلايا التي تم التعبير عنها بشكل مختلف جدا: علامات العظم والعظم في الأزرق ، علامات العظم في اللون الأخضر يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| الجينات | نوع الخلية | log2FoldChange | متوسط التعبير | قيمه P المعدلة |
| Col1a1 | العظم/العظم | 2.64 | 12.94 | 2-22 e-05 |
| Col1a2 | العظم/العظم | 3.41 | 12.87 | e-07 8.27 |
| Dkk1 | العظم/العظم | 7.59 | 2.01 | 5-12 e-03 |
| Dmp1 | العظم/العظم | 9.73 | 3.42 | 3.19 e-04 |
| دستن | العظم/العظم | 2.51 | 6.87 | e-07 5.73 |
| Runx2 | العظم/العظم | 1.24 | 8.62 | 4.08 e-02 |
| Sp7 | العظم/العظم | 2.24 | 6.95 | 5.81 البريد-03 |
| Sparc | العظم/العظم | 3.40 | 12.26 | 5.56 e-09 |
| Acp5 | ناقض | 3.38 | 5.74 | 6.46 e-06 |
| Csf1r | ناقض | 2.01 | 5.80 | 1.17 e-04 |
| كتسك | ناقض | 3.19 | 7.56 | e-07 5.73 |
| Itgb3 | ناقض | 2.88 | 5.37 | 2.43 e-04 |
| اوسكار | ناقض | 3.41 | 2.67 | 1.63 e-04 |
| اجان | غضروفي | -5.23 | 5.01 | 2.76 e-04 |
| Col2a1 | غضروفي | -3.61 | 9.47 | 3.29 e-03 |
| Col9a1 | غضروفي | -7.01 | 3.58 | البريد الكتروني-03 |
| Col9a2 | غضروفي | -5.40 | 3.76 | 2.6 e-03 |
| Col9a3 | غضروفي | -6.63 | 3.80 | 2.90 |
| شركات | غضروفي | -5.86 | 1.54 | 7.51 البريد-03 |
| Lect1 | غضروفي | -7.37 | 1.34 | 2.35 e-02 |
| Sox5 | غضروفي | -2.88 | 4.43 | 6.06 البريد-04 |
الجدول 1: التعبير التفاضلي للجينات المعروفة في مختلف أنواع الخلايا من العظام والغضاريف (فك العظم مقابل MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتيح LCM عزل الخلايا المخصبة أو متجانسة من الانسجه غير المتجانسة. وتشمل مزاياه القبض السريع والدقيق للخلايا في سياقها المجري ، في حين ان المساوئ المحتملة تشمل ان تكون مضيعه للوقت ، ومكلفه ، ومحدوده بالحاجة إلى ان يتعرف المستخدم علي السكان الفرعيين المتميزين ضمن عينه محدده30. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل LCM من الغضروف الجنيني الماوس والعظام ، وتسليط الضوء علي استخدام الصبغة البنفسجية كريريل في اجراء سريع لتصور الغضروف والعظام لجمع الانسجه دقيقه مع الحفاظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي عاليه للتحليل اللاحق من قبل الجيش الريبي النيبالي-seq. أحد القيود علي هذا البروتوكول هو ان نظام LCM المستخدم هنا غير قادر علي القطع المباشر عبر الانسجه المعدنية (علي سبيل المثال ، النسيج فك باللون الأسود في الشكل 2ج) ؛ ونتيجة لذلك ، يجب تشريح منطقه العظام بأكملها. وعلي وجه الخصوص ، فان المناطق المتحجرة الدقيقة المعزولة بواسطة LCM ليست متجانسة ، وتشمل علي الأقل السكان الفرعيين لعظم ، والخلايا العظمية ، والعظم الكبدي (الجدول 1). ومع ذلك ، فان الإثراء من قبل LCM هو قيمه كما أظهرت دراستنا السابقة ان التغييرات المتعلقة بالشلل في الفئات الفرعية المحددة مثل العظم الكبدي في الانسجه العظمية الدقيقة لا يزال يمكن الكشف عنها من قبل الحمض الريبي النيبالي-seq6.
لتحليل التعبير الجيني ، لدينا الأمثل لاعداد العينة و LCM الاجراء لجوده RNA عاليه والعائد. لدينا بروتوكول يبدا مع الانسجه المجمدة الطازجة. أقسام الانسجه المجمدة الطازجة تسمح لكميه ممتازة ونوعيه الحمض الريبي المستخرج3، كما mrna حساسة للطرق القياسية للتثبيت31. الحمض الريبي النيبالي المتدهورة بسرعة عن طريق التلوث RNase ، وصيانة بيئة خاليه من RNase في جميع انحاء اعداد العينة ، LCM ، والعزلة RNA أمر بالغ الاهميه لنجاح التطبيق. التعرض للمياه اثناء معالجه القسم يضر الجودة RNA31,32. بروتوكولنا يحد من هذا التعرض ، مع اعلي مستوي من التعرض المائي يجري 50 ٪ خلال تلطيخ البنفسج كريريل. لقد اختبرنا ان تلطيخ سريع (30 ق) مع 0.1 ٪ البنفسج كريريل في 50 ٪ الايثانول يعطي لون مميز إلى الغضروف ولا يقلل من سلامه الحمض الريبي النيبالي للتحليل المصب مثل انخفاض المدخلات الحمض الريبي النيبالي-seq (الشكل 3ج والشكل 4). العائد/المنطقة (ng/mm2) حوالي 20 نانوغرام/مم2 (الشكل 3و) ، مماثله أو اعلي من الأساليب المحسنة السابقة33. وفقا لكثافة الخلية في MC و فك bone6، ونحن نقدر انه مع هذا البروتوكول متوسط العائد من خليه واحده ما يقرب من 5 pg الجيش النيبالي الريبي لكل خليه ، و 1-5 نانوغرام من الحمض الريبي الإجمالي يمكن استخراج من 200-1000 الخلايا ، والتي يمكن استخدامها لانخفاض المدخلات rna-seq6،7،33. هذه الكفاءة الغلة هو اعلي بكثير من الأساليب lcm الراسخة34، وأيضا متفوقة أو مشابهه لبروتوكولات الأمثل الاخيره33،35.
القدرة علي التمييز بين أنواع الخلايا المختلفة في الأقسام النسيجية أمر ضروري لجمع دقيق من انسجه معينه من الفائدة. البنفسج كريريل هو المائية ، وصمه عار الاساسيه التي تربط إلى الأحماض النووية مشحونة سلبا36. هذه الخاصية يجعل من المفيد لتلطيخ مع الخلية من نوع الانتقائية37، وهو وصمه عار النسيجية القياسية للخلايا العصبية38. وقد استخدمت البنفسج كريريل في lcm لمجموعه متنوعة من الانسجه ، وتوفير المورفولوجية الانسجه جيده وعاليه الجودة RNA33،36،39،40. بالمقارنة مع غيرها من أساليب تلطيخ ، وتصبغ البنفسج كريريل يوفر التفاصيل الخلوية والنووية ، وانخفاض معدل تدهور الحمض الريبي النيبالي32. ونحن نظهر هنا ان تلطيخ البنفسج كريريل هو وسيله سهله وسريعة لتصور الغضروف والعظام وان الانسجه الملونة مع هذا الأسلوب يحفظ سلامه الحمض الريبي النيبالي عاليه. ويشيع استخدام العلاج اكسيلين للجفاف من الانسجه قبل lcm35،36،41،42. نحن نستخدم اكسيلين لتعزيز التصور من الانسجه المورفولوجية35 وهو أمر ضروري للتمييز بين الانسجه المستهدفة ، وخاصه علي الشرائح الغشاء القلم التي ليست واضحة بصريا كما الشرائح الزجاجية عادي. لم نجد اي حدوث كبير من فقدان القسم من الشرائح PEN اثناء تلطيخ وخطوات الغسيل ، حتى مع الانفعالات لأزاله OCT.
ميكروقطيرات أو ميكروفلويديكس المستندة إلى خليه واحده RNA-seq (scRNA-seq) هو أسلوب الانتاجيه العالية لتحليل النسخ من الانسجه مع أنواع الخلايا غير المتجانسة وبدات تستخدم في البيولوجيا الهيكل العظمي43. وعلي النقيض من LCM ، يتضمن التصنيف الانزيمي و/أو التقسيم الميكانيكي للانسجه إلى خلايا واحده. معظم البروتوكولات لاعداد خليه واحده تتطلب الانسجه لاحتضانها في درجه حرارة الغرفة أو 37 درجه مئوية لفترات طويلة ، والذي يغير الناسخ44،45. بالاضافه إلى ذلك ، قد تكون عزله الخلايا المفردة في الغضروف والعظم محدوده ماديا من خلال تعقيد عنصر الهيكل العظمي للتراب والتعدين. فانه لا يزال تحديا تقنيا لعزل عدد كاف من الخلايا القابلة للحياة من الانسجه الهيكلية التي تمثل بدقه التنوع الخلوي للانسجه في الجسمالحيوي ، والتفكك غير مكتملة من الخلايا قد يسبب التحيز في الكشف عن أنواع الخلايا43. بينما scRNA-seq يسمح بتحديد أنواع الخلايا المتميزة ، وعمق التسلسل منخفضه ، ونهج التسلسل النموذجية التقاط 3 ' ينتهي النص ولا تسمح تحليل الربط البديلة. الجزء الأكبر RNA-seq من الانسجه المشتقة من LCM المجانسة الاختلافات الخلية ، ولكن يسمح الكشف عن النص شامله وتحليل الربط البديلة. ولذلك فان LCM مفيده بشكل خاص للانسجه الهيكلية التي لا يمكن فصلها بسهوله عن الانسجه المحيطة والمعقدة داخليا ، ويمكن لاعداد الانسجه المجمدة الطازجة الحفاظ علي كل من التشكيلات الجانبية القابلة للتحويل وسلامه الحمض الريبي النيبالي للتحليل العابر. نقطه ضعف أخرى من [سكرنا-تلي] ان بعد واحده خليه تحضير, المعلومة مكانيه من الخلايا يكون خسرت. وقد تم تطوير مزيج من LCM و scRNA-seq للسماح بدراسة الناسخ من عينه صغيره من المواقع الجغرافية المحددة (Geo-seq)46، وهو نهج آخر لاستخدام lcm لدراسة التعبير الجيني الإقليمي.
وباختصار ، يوفر هذا البروتوكول تفاصيل LCM الأمثل من الغضروف والعظام ، وتسليط الضوء علي استخدام الصبغة البنفسجية كريريل في اجراء سريع لتصور الغضروف والعظام لجمع الانسجه دقيقه مع الحفاظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي عاليه للتحليل اللاحق من قبل الجيش الريبي النيبالي-seq. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح ل lcm من الغضروف والعظام في مراحل تنموية مختلفه لتحليل التعبير الجيني6,7, ويمكن استخدامها أيضا للانسجه الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لبحوث طب الأسنان والجمجمة (R01DE022988) ومعهد يونيس كينيدي شريفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (P01HD078233). ويشكر المؤلفون المستودع الحيوي والامراض الاساسيه للوصول إلى منصة لأيكا LMD 6500 في مدرسه Icahn للطب في جبل سيناء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
