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Developmental Biology

用于基因表达分析的小鼠胚胎软骨和骨骼的激光捕获微分

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60503
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

该协议描述了激光捕获微解剖，用于从小鼠胚胎的新鲜冷冻部分分离软骨和骨骼。软骨和骨骼可以通过紫罗兰染色快速可视化，并精确收集，产生高质量的RNA进行转录分析。

Abstract

激光捕获微分体（LCM）是一种强大的工具，用于从异构组织分离特定的细胞类型或感兴趣的区域。骨骼元素的细胞和分子复杂性随着发育的增加而增加。组织异质性，如软骨和骨质元素彼此或周围组织界面，是研究软骨和骨骼发育的一个障碍。我们的协议提供了一种快速的组织处理和软骨和骨分离方法，为基因表达分析产生高质量的RNA。小鼠胚胎的新鲜冷冻组织被分割，并用于用不同于周围组织的颜色来可视化软骨和骨骼的短暂克西尔紫染色。然后，幻灯片迅速脱水，软骨和骨骼随后被 LCM 分离。在此过程中，尽量减少接触水溶液，保持RNA的完整性。成功采集了小鼠Meckel在E16.5处的软骨和软骨骨，基因表达分析显示成骨细胞、成骨细胞、成骨细胞和软骨细胞的标记基因表达不同。高质量的RNA也从一系列组织和胚胎年龄中分离出来。该协议详细说明了LCM的样品制备，包括冷冻、切片、染色和脱水新鲜冷冻组织，以及LCM对软骨和骨骼的精确分离，从而产生用于转录组分析的高质量RNA。

Introduction

肌肉骨骼系统是由肌肉、结缔组织、肌腱、韧带、软骨和骨骼组成的多组分系统，由神经内膜连接，血管血管1。骨骼组织随着细胞异质性和结构复杂性的增加而发展。软骨和骨骼从相同的骨质滴激素系发展，并且高度相关。胚胎软骨和骨骼与肌肉、神经、血管和未分化的肌体结合发展。软骨也可能被骨头包围，如梅克尔的软骨和软骨在软骨内。这些组织在发育过程中通过细胞外信号在解剖学上关联并相互作用。在软骨和骨骼发育中的基因表达研究中，一个障碍是由多种组织类型组成的骨骼结构的异质性。精确分离感兴趣的特定组织是成功转录分析的关键。

激光捕获微分体（LCM）是一种强大的工具，用于分离异质组织内的细胞类型或感兴趣的区域，并且可重现，对单细胞级别2敏感。它可以精确定位和捕获感兴趣的细胞，用于转录组学、基因组学和蛋白质组学3、4中广泛的下游测定。分离的RNA、DNA或蛋白质的质量可以通过生物分析仪或等效平台进行评估。例如，RNA质量由RNA完整性数（RIN）5表示。

在这里，我们提供一个方案，通过LCM从新鲜冷冻组织中快速染色和分离软骨和骨骼。我们使用小鼠胚胎来证明该协议产生高质量的RNA，用于后续转录组分析，如RNA测序（RNA-seq）。

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Protocol

根据国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》，从小鼠身上获得组织，研究规程由西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 新鲜冷冻标本的制备

  1. 解剖感兴趣的胚胎或组织。将样品嵌入具有最佳切削温度 （OCT） 化合物的一次性嵌入模具中。用尖或针调整试样的方向。
  2. 在干冰/甲基-2-丁烷浴中快速冷冻样品。继续执行下一步或储存在 -80 °C。
    注：可以在此处暂停该协议。

2. 激光捕获微解剖的冷冻切片

  1. 用 70% 乙醇解冻冷冻和清洁内部表面。使用 RNase 去污剂处理防卷板和一对钳子。将低温设置为所需的切割温度（-18 至 -22 °C）。准备一个带干冰的带盖容器，在干冰上放置一块铝箔，在冷冻切片期间临时存放切片样品幻灯片。
    警告：干冰非常冷。务必小心处理干冰，每次处理时都要戴上绝缘手套。
  2. 将新鲜冷冻的样品转移到一桶干冰中。将一层 OCT 化合物放在低温试样支架上，并立即将试样置于 OCT 顶部，承受轻柔的压力。当 OCT 完全冻结时，用试样将支架固定到冷冻切割臂中。
  3. 将样品留在低温中 15 分钟，以平衡到切割温度。
  4. 截面组织，收集聚乙烯石脑油（PEN）膜上的切片，厚度为12μm。在膜上对齐连续部分。完成一张幻灯片后，让部分干燥几分钟，并将幻灯片转移到干冰容器中的箔上，直到收集所有必需的幻灯片。
  5. 将幻灯片以 -80 °C 存储在幻灯片框中。
    注：选择部分厚度以最大化收集的组织量，同时允许有效切割组织，并且可能因感兴趣的组织而异。可以在此处暂停该协议。使滑轨远离 RNase 污染。避免温度变化。尽管从存储长达 6 个月的幻灯片中产生的 RNA 的 RiN 可能仍表明 RNA 的高质量，但我们建议尽快使用幻灯片。

3. 激光捕获微解剖的样品制备

  1. 为染色和脱水准备解决方案。
    1. 将 45 mL 的 80% 乙醇放入三个 50 mL 离心管中。"将它们标记为#1、#2和#3。用无RNase/DNase水稀释乙醇。
    2. 将 45 mL 的 95% 乙醇放入 50 mL 离心管中的冰上。
    3. 将 45 mL 的 100% 乙醇放入 50 mL 离心管中的冰上。
    4. 在室温下将45 mL的二甲苯放入50 mL的离心管中。
      警告：二甲苯应用于烟气罩。
  2. 将 PEN 膜短暂解冻，将其放在戴手套的手上，然后用 45 mL 的 80% 乙醇（#1和#2）每部清洗两次，每次 30 s，在 50 mL 离心管中搅拌以去除 OCT。
    注：在染色前去除 OCT 非常重要，以防止在染色过程中 OCT 松动，使部分遮蔽。钳子可用于促进去除未被搅拌冲走的 OCT。
  3. 将幻灯片放在铝箔上。将0.8 mL的0.8 mL的0.1%铬色紫在50%乙醇的滑道上，在30s的滑轨上污渍30s。在45mL的80%乙醇（#3）中清洗滑轨30s，然后通过30s每层通过45mL的95%乙醇、100%乙醇和50mL离心管中的二甲苯脱水。
  4. 将滑梯放在精致的任务雨刷器上 5 分钟，以排空二甲苯和干燥部分。
    注：在 LCM 之前，幻灯片必须完全干燥。

4. 激光捕获微解剖

注：执行 LCM 时，请佩戴无粉手套。

  1. 打开 LCM 显微镜、激光和计算机。登录到计算机并启动软件。将钥匙打开"开"位置以启动激光。当绿灯（激光）亮起时，按下红色按钮激活激光，然后指示灯（激光）变为红色，指示激光已准备就绪。
    注：激光大约需要 10 分钟预热。
  2. 设置收集管。
    1. 将 0.5 mL 聚合酶链反应 （PCR） 管的盖插入收集器。
      注：为所需的 PCR 管（0.2 或 0.5 mL）选择匹配的收集器。
    2. 将液器 50 μL 的萃取缓冲液（由材料表中列出的RNA分离试剂盒提供）放入 0.5 mL 收集管的盖子中。
    3. 将收集装置插入显微镜。
    4. 在"更改收集器设备"窗口中，单击"移动到参考点"按钮将收集器移动到参考点 （RP）。调整焦点以清楚地查看 RP。单击箭头将 RP 移动到视图的中心。
  3. 装载试样滑轨。
    1. 单击工具栏中的左"卸载"按钮以降低幻灯片支架。
    2. 将滑移放入支架中，组织部分朝下。
      注：此方向可确保捕获的组织部分通过重力落入收集管的盖子中。
    3. 将支架重新插入舞台。
  4. 设置激光参数。
    1. 选择"激光"菜单的控制选项，或单击"激光"图标。
    2. 根据需要调整这些参数：功率，激光的功率;孔径，激光的宽度;和速度，在绘制和切割模式下的切割速度。
      注：在感兴趣的区域测试激光。更高的功率或更大的孔径使得切割更容易，但对细胞造成更大的损伤。调整功率、孔径和速度的组合，以获得高效的切割和最小的组织损伤。例如，12 μm 截面上的软骨组织功率 = 40，孔径 = 5，速度 = 7。
  5. 选择和剪切感兴趣的区域。
    1. 从 5x 目标开始，找到感兴趣的区域，然后切换到最能显示感兴趣区域的目标（5x、10x 或 40x）。
      注：紫软骨染色后，软骨被染色，矿化组织呈棕色或黑色，与其他组织有区别。可以使用从"文件"菜单中保存图像。
    2. 通过单击收集器上的标记，选择用于收集的管（A、B、C、D）。
    3. 选择"移动"和"剪切"或"绘制和剪切"。在"移动和剪切"模式下，使用鼠标或触摸屏笔手动剪切试样，以徒手绘制形状。在"绘制和剪切"模式下，可以使用鼠标或触摸屏笔手动绘制形状，以便进行后续切割。单击"开始切割"按钮以启动激光切割。
    4. 切割完成后，带有 PEN 膜的目标组织通过重力落入收集管的盖子中。如果需要，请重复 4.5 以汇集多个感兴趣的区域。
      注：如果组织由于不完全切割而未掉落到收集管的盖子中，则可能需要重复切割或增加功率或孔径。矿化骨（棕色或黑色）不能直接用激光切割。
  6. 卸载收集器并小心地关闭 PCR 管。将微解剖组织放入干冰中。继续执行下一步或储存在 -80 °C。
    注：可以在此处暂停该协议。对下一个示例重复 4.2 到 4.6。

5. 微分裂组织和RNA分离的分解

  1. 在室温下解冻微解剖组织。在42°C下进行短暂离心，孵育样品30分钟。
  2. 孵育后，将分解缓冲液向下旋转到0.5 mL PCR管中。按照制造商的说明，使用RNA分离试剂盒（参见材料表）进行DNase处理和RNA提取。

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Representative Results

E16.5 处新鲜冷冻小鼠组织的冠状部分用于演示 LCM 分离和收集梅克尔软骨 （MC）、软骨软骨和软骨。E16.5的小鼠胚胎被解剖，并嵌入与OCT化合物的低温模具。模具中的样品被迅速冷冻在干冰和甲基-2丁烷浴中，并储存在-80°C。

为了证明软骨和骨骼的紫紫色染色，在日冕平面上进行了冷冻切片，并在显微镜幻灯片上采集了样本。按照上述协议（步骤 3.2_3.4）对部分进行洗涤、染色和脱水。滑片为空气干燥，并安装有永久安装介质。所有检查的软骨均为染色品红色（MC、结颊软骨、鼻腔软骨、成本软骨、表皮骨软骨原状、半径和ulna的软骨原发），所有矿化组织均被染色成棕色或黑色（图1A+E）。软骨和骨骼都很容易区分为多个解剖部位的其他组织。

对于LCM，E16.5的胚胎头在PEN膜滑动的日冕平面上切片，厚度为12μm，每张幻灯片收集6~8个连续部分，并储存在-80°C。OCT 被移除，部分被染色，按照上述协议（步骤 3.2–3.4）进行紫罗兰和脱水。MC、软骨和软骨区域由LCM选择和分离（图2）。所选区域落入收集管盖中的莱沙缓冲液中。为了获得足够的RNA进行测序，我们分别将10个MC区域、10个软骨区域或4个软骨区域作为一个样本汇集到每个采集管中。

RNA是按照制造商的说明使用RNA分离试剂盒提取的。使用生物分析仪分析总RNA（图3A+B）。为了测试紫罗兰染色对RNA质量的影响，我们比较了用紫罗兰染色的骨质样本的RNA和无染色的样品（矿化组织是可见的，没有染色，但紫罗兰染色提高了可见度，以区分骨骼和周围组织）。染色样品（n = 4）和无染色（n = 4）之间在RNA完整性方面无显著差异，表明该协议中的快氯紫染色对RNA质量影响不大（P = 0.858，双尾韦尔奇的t-测试，图3C）。我们用我们的协议对不同发育阶段的各种组织的LCM进行了测量，并测量了RIN，表明RNA质量高（图3D）。MC、软骨和软骨RNA的平均产量为7.50 ±1.45 ng， 12.55 ± 2.75 ng， 和 33.02 × 7.63 ng （图 3E） 和产量/面积是 19.73 ± 3.82 纳克/毫米2，26.70 × 5.84 纳克/毫米2和 17.23 × 3.98 纳克/毫米2， 分别 （图 3F）， 没有组织之间的显著差异 （MC 与软骨， P = 0.383;软骨与骨骼，P = 0.260;MC 与硬骨，P = 0.674）。

图书馆的编制和排序如前所述6，7。代表性的cDNA大小约为500 bp （图4A）。使用MultiQC8对RNA-seq数据进行了分析。我们分析了来自18个LCM样本（MC1-6，梅克尔软骨）的RNA-seq数据;C1-6，软骨;M1-6，骨骨）。读取中每个基位置的平均质量值由 FastQC 生成，表示质量非常好（图 4B）。使用 Picard 分析读取对齐 （图 4C） 。读取显示高对齐百分比，对齐读取的平均百分比为 75%。用Picard（图4D）对基因覆盖率进行了分析，表明从5'到3'结束，在抄本上具有良好的表现。

微分基因表达分析进行了6，7。有4，006个基因在骨骼和MC之间显著的差异表示（P < 0.05）（图5A）。与MC相比，骨细胞或骨细胞特有的基因（Col1a19，Col1a2 10，Dkk111，Dmp1 12，Dstn 13，Runx2 14，Sp7 15和Sparc16）在软骨骨中表达的更强烈，而软骨素特异性基因（Acan17，Col2a18，Col9a1 Col9a220、Col9a3 21、Comp 22、Lect1 23和Sox524） 在 MC 中比硬骨骨表达的更高（图 5B和表1）。此外，与MC相比，Acp525、Csf1r 26、Ctsk 27、Itgb3 28和Oscar 29等骨细胞标记物在骨骼中表达得更强烈（图5B和表1），表明目标组织的成功分离。

Figure 1
图1：在E16.5处小鼠胚胎的冠状部分，软骨和骨骼的代表性乳糖紫染色。（A） 梅克尔的软骨和可骨性.（B） 梅克尔的软骨、 软骨软骨和可分骨。（C） 鼻腔和最大值.（D） 预发骨和紫杉骨的软骨原发性。（E） 半径的软骨原发，乌纳的软骨原发，和成本软骨。C = 软骨;CC = 成本软骨;CP = 前体骨的软骨原状;M = 可分明的;MC = 梅克尔的软骨;MX = maxilla;NS = 鼻膜;PL = 古骨;R = 半径的软骨原生;U = 乌纳软骨原发。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：由LCM分离并收集RNA-seq的代表性区域。（A+C）代表染色MC （A）， 软骨 （B） 和血质可同 MC 在 LCM 之前的低温部分已经隔离 （C ）.（D+F）在靶向组织之后，A、B和C区域被LCM分离。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：LCM样品的RNA质量和数量。（A+B）代表性电镜图 （A） 和相关的凝胶图像 （B） 从生物分析仪的软骨样本.（C） 从满骨质骨样本中沾染了紫罗兰（n = 4）或无染色（n = 4）的总RNA的RiN。（D） 从LCM分离出的不同组织中总RNA的RiN。梅克尔的软骨在E16.5 （n = 6）;E16.5 （n = 6） 的软骨;E16.5 （n = 6） 处的颌骨;E14.5 （n = 6） 的鼻隔膜软骨;E14.5 （n = 6） 的大脑;E16.5 （n = 7） 的大脑;E18.5 （n = 4） 的大脑。（E） 三个组织的总RNA产量.每个MC或软骨样本是10个软骨的微解剖区域的池，每个软骨样本是4个可切除的微切除区域的池。（F） 每个组织单位面积 （ng/mm2） 的产量。数据是均值 = s.e.m.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：从LCM样品生成的库和RNA-seq数据的质量。（A） 由生物分析仪测定的颌骨样本中，具有代表性的cDNA大小。（B+D）从18个LCM样品（MC1-6，梅克尔的软骨）对RNA-seq进行质量控制分析;C1-6，软骨;M1-6，骨骨）由多QC。（B） 读取中每个基位置的平均质量值由 FastQC 生成。图形的背景将 y 轴划分为非常高质量的调用（绿色）、质量合理的调用（橙色）和质量差的调用（红色）。（C） 读取对齐由 Picard 分析.摘要显示为对齐读取的百分比。（D） 用皮卡德分析的标准化基因覆盖率。该图指示从 5' 结束（左）到 3' 结束（右）的脚本沿线的相对平均覆盖率。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：从LCM分离出的骨骼和MC中RNA-seq数据的差分表达分析。（A） 4，006个基因的分层聚类在骨骼和MC之间显著地表示（P < 0.05）。每个组织都使用了三个生物复制。M1-3，骨骼;MC1-3，MC. （B） 火山图显示软骨和MC之间不同表达基因的褶皱变化和P值。 显示了高度差异表达的细胞特异性基因的例子：蓝色中的成骨细胞和骨细胞标记，绿色的成骨细胞标记，以及红色软骨细胞标记。请点击此处查看此图的较大版本。

基因 单元格类型 日志2折叠更改 平均表达式 调整后的 P 值
Col1a1 骨细胞/骨细胞 2.64 12.94 2.22E-05
科尔1a2 骨细胞/骨细胞 3.41 12.87 8.27E-07
丹麦克朗 骨细胞/骨细胞 7.59 2.01 5.21E-03
Dmp1 骨细胞/骨细胞 9.73 3.42 3.19E-04
德斯坦 骨细胞/骨细胞 2.51 6.87 5.73E-07
润x2 骨细胞/骨细胞 1.24 8.62 4.08E-02
Sp7 骨细胞/骨细胞 2.24 6.95 5.81E-03
Sparc 骨细胞/骨细胞 3.40 12.26 5.56E-09
Acp5 破 骨 细胞 3.38 5.74 6.46E-06
Csf1r 破 骨 细胞 2.01 5.80 1.17E-04
茨克 破 骨 细胞 3.19 7.56 5.73E-07
Itgb3 破 骨 细胞 2.88 5.37 2.43E-04
奥斯卡 破 骨 细胞 3.41 2.67 1.63E-04
委员会 软骨 细胞 -5.23 5.01 2.76E-04
Col2a1 软骨 细胞 -3.61 9.47 3.29E-03
Col9a1 软骨 细胞 -7.01 3.58 5.51E-03
Col9a2 软骨 细胞 -5.40 3.76 2.60E-03
Col9a3 软骨 细胞 -6.63 3.80 2.90E-02
康普 软骨 细胞 -5.86 1.54 7.51E-03
莱克1 软骨 细胞 -7.37 1.34 2.35E-02
索克斯5 软骨 细胞 -2.88 4.43 6.06E-04

表1：骨骼和软骨（骨骼与MC）各种细胞类型中已知基因的差分表达。

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Discussion

LCM能够从异质组织分离富集或均质细胞群。其优点包括快速、精确地捕获体内环境中的细胞，而潜在的缺点包括耗时、昂贵，且受限于用户在指定样本30中识别不同亚群的需求。该协议提供了小鼠胚胎软骨和骨骼的LCM细节，重点介绍了在快速过程中使用克西尔紫染色来可视化软骨和骨骼，从而精确收集组织，同时保持高RNA完整性，以便RNA-seq进行后续分析。该协议的一个限制是，这里使用的LCM系统不能直接切割成矿组织（例如，图2C中的黑色颌面组织）;因此，整个骨骼区域需要解剖。值得注意的是，由LCM分离的微解剖的骨化区域不是同质的，至少包括成骨细胞、成骨细胞和成骨细胞的亚种群（表1）。然而，LCM的富集是有价值的，因为我们先前的研究表明，在微解剖骨组织中，特定亚种群（如骨细胞细胞）的转录变化仍可以通过RNA-seq6检测出来。

在基因表达分析方面，我们优化了样品制备和LCM程序，提高RNA质量和产量。我们的协议从新鲜冷冻组织开始。新鲜冷冻组织部分允许提取的RNA3的优良数量和质量，因为mRNA对标准固定方法31很敏感。RNA 通过 RNase 污染迅速降解，在整个样品制备、LCM 和 RNA 分离过程中维护无RNase环境对于成功应用至关重要。在切片处理过程中接触水对RNA质量有害31，32。我们的协议限制了这种暴露，在紫罗兰染色期间，最高水暴露的50%。我们已经测试过，在50%乙醇中，具有0.1%克西尔紫的快速染色（30 s）为软骨提供可区分的颜色，并且不会降低下游分析的RNA完整性，如低输入RNA-seq（图3C和图4）。产量/面积（纳克/毫米2）约为20纳克/毫米2（图3F），与以前的优化方法33相似或更高。根据MC和地膜骨6的细胞密度，我们估计，通过该协议，一个细胞的平均产量约为每细胞5皮克RNA，从200-1，000个细胞中提取总RNA的1~5 ng，可用于低输入RNA-seq6、7、33。这种屈服效率远远高于既定的LCM方法34，也优于或类似于最近优化的协议33，35。

在组织学部分区分不同细胞类型的能力对于精确收集感兴趣的特定组织至关重要。克雷西尔紫罗兰是一种亲水性的基本染色，与带负电荷的核酸36结合。此属性使它可用于与细胞型选择性37进行反染色，它是神经元38的标准组织学染色。克雷西尔紫紫已经用于LCM的各种组织，提供良好的组织形态和高RNA质量33，36，39，40。与其他染色方法相比，紫罗兰染色可提供细胞质和核细节，RNA降解率低32。我们在这里证明，紫软骨染色是一种简单快捷的软骨和骨骼可视化方法，并且用这种方法染色的组织可以保存高RNA完整性。二甲苯治疗通常用于LCM35、36、41、42之前组织的脱水。我们使用二甲苯来增强组织形态35的可视化，这对于区分靶向组织至关重要，特别是在PEN膜幻灯片上，其光学清晰度不如普通玻璃玻片。我们发现在染色和洗涤步骤期间，PEN幻灯片的截面损失没有显著发生，即使通过搅拌去除 OCT。

微滴或基于微流体的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）是一种高通量方法，用于分析具有异质细胞类型的组织的转录，并开始用于骨骼生物学43。与LCM相比，scRNA-seq涉及组织酶和/或机械分解到单个细胞中。大多数单细胞制备方案要求组织在室温或37°C长时间孵育，这改变了转录组44，45。此外，软骨和骨骼中单细胞的分离可能受到骨骼元素复杂度和骨化的物理限制。从骨骼组织中分离出足够数量的活细胞仍然是一项技术挑战，这些细胞准确地代表了体内组织的细胞多样性，细胞的不完全分离可能导致细胞类型43的检测偏差。虽然scRNA-seq允许识别不同的细胞类型，但测序深度较低，典型的测序方法捕获3'的抄本结束，不允许进行替代拼接分析。LCM衍生组织的散装RNA-seq使细胞差异均匀化，但允许全面的转录检测和替代拼接分析。因此，LCM特别适用于不易与周围组织和内部复合体分离的骨骼组织，组织新鲜冷冻制剂可保存转录型材和RNA完整性，用于转录分析。scRNA-seq的另一个弱点是，在单细胞制备后，细胞的空间信息会丢失。已开发LCM和scRNA-seq的组合，以便研究来自定义地理位置（Geo-seq）46的小样本的转录组，这是利用LCM研究区域化基因表达的另一种方法。

总之，该协议提供了软骨和骨骼优化LCM的细节，强调了在快速过程中使用克西尔紫染色来可视化软骨和骨骼的精确组织采集，同时保持高RNA完整性，以便RNA-seq后续分析。该协议已成功用于不同发育阶段的软骨和骨骼的LCM基因表达分析6、7，也可用于其他组织。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家牙科和颅面研究所（R01DE022988）和尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康和人类发展研究所（P01HD078233）的支持。作者感谢生物储存库和病理学核心访问西奈山伊坎医学院的Leica LMD 6500平台。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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发育生物学，第154期，激光捕获微分体，梅克尔的软骨，颌骨，紫罗兰，RNA分离，RNA测序
用于基因表达分析的小鼠胚胎软骨和骨骼的激光捕获微分
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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

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