Summary
Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.
Abstract
Laser Capture microdissection (LCM) is een krachtig hulpmiddel om specifieke celtypen of regio's van belang te isoleren van heterogene weefsels. De cellulaire en moleculaire complexiteit van skeletelementen neemt toe met de ontwikkeling. Weefsel heterogeniteit, zoals op het raakvlak van kraakbeen-en osseeuze elementen met elkaar of met omringende weefsels, is een obstakel voor de studie van het ontwikkelen van kraakbeen en botten. Ons protocol biedt een snelle methode van weefsel verwerking en isolatie van kraakbeen en botten die hoge kwaliteit RNA voor genexpressie analyse oplevert. Verse bevroren weefsels van muis embryo's worden verdeeld en korte Cresylacetaat Violet kleuring wordt gebruikt om kraakbeen en botten te visualiseren met kleuren die verschillend zijn van omringende weefsels. Dia's worden vervolgens snel gedehydrateerd en kraakbeen en botten worden vervolgens geïsoleerd door LCM. De minimalisatie van blootstelling aan waterige oplossingen tijdens dit proces handhaaft de RNA-integriteit. Het kraakbeen van de muis Meckel en het mandibulaire bot bij E 16.5 werden met succes verzameld en de analyse van genexpressie toonde differentiële expressie van marker genen voor osteoblasten, osteocyten, osteoclasten en chondrocyten. RNA van hoge kwaliteit werd ook geïsoleerd uit een aantal weefsels en embryonale leeftijden. Dit protocol Details monstervoorbereiding voor LCM met inbegrip van cryoinbed ding, snijden, kleuring en dehydrerende verse bevroren weefsels, en precieze isolatie van kraakbeen en bot door LCM resulterend in hoge kwaliteit RNA voor Transcriptomic analyse.
Introduction
Het bewegingsapparaat is een multicomponentsysteem bestaande uit spier, bindweefsel, pees, ligament, kraakbeen, en bot, geïncubeerd door zenuwen en gevasculariseerde door bloedvaten1. De skelet weefsels ontwikkelen met toenemende cellulaire heterogeniteit en structurele complexiteit. Kraakbeen en bot ontwikkelen van dezelfde osteochondroprogenitor lineage en zijn sterk gerelateerd. Embryonaal kraakbeen en bot ontwikkelen in associatie met spieren, zenuwen, bloedvaten, en ongedifferentieerde Mesenchyme. Kraakbeen kan ook worden omgeven door bot, zoals het kraakbeen van Meckel en condylenbaan kraakbeen binnen het mandibulaire bot. Deze weefsels zijn anatomisch geassocieerd en interactie met elkaar via extracellulaire signalen tijdens de ontwikkeling. In de studie van genexpressie bij de ontwikkeling van kraakbeen en botten is één obstakel de heterogeniteit van skelet structuren samengesteld uit meerdere weefsel typen. Nauwkeurige isolatie van het specifieke weefsel van belang is de sleutel voor succesvolle transcriptionele analyse.
Laser Capture microdissection (LCM) is een krachtig hulpmiddel om celtypen of interessegebieden binnen heterogene weefsels te isoleren, en is reproduceerbaar en is gevoelig voor het enkele celniveau2. Het kan zich precies richten en cellen van belang te vangen voor een breed scala van downstream assays in transcriptomics, Genomics, en proteomica3,4. De kwaliteit van het geïsoleerde RNA, DNA of eiwit kan worden beoordeeld met een bioanalyzer of gelijkwaardig platform. De kwaliteit van RNA wordt bijvoorbeeld aangegeven door het RNA-integriteits nummer (RIN)5.
Hier bieden we een protocol voor de snelle kleuring en isolatie van kraakbeen en botten door LCM uit verse bevroren weefsels. We gebruiken het embryo van de muis om aan te tonen dat dit protocol kwalitatief hoogwaardig RNA oplevert voor daaropvolgende transcriptomische analyse, zoals RNA-sequencing (RNA-SEQ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Weefsels van muizen werden verkregen in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en studie protocollen werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.
1. bereiding van vers bevroren specimen
- Het embryo of het weefsel van belang ontleden. Sluit het monster in een wegwerp-insluitings mal met optimale snijtemperatuur (OCT) compound. Pas de oriëntatie van het preparaat aan met een punt of naald.
- Vries de monsters snel in een droogijs/methyl-2-butaan bad. Ga door naar de volgende stap of winkel bij-80 °C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. cryosectioning voor laser Capture Microdissectie
- Ontdooi de cryostaat en reinig de inwendige oppervlakken met 70% ethanol. Behandel de anti-roll plaat en een paar tang met RNase decontaminatie middel. Stel de cryostaat in op de gewenste snijtemperatuur (-18 tot-22 °C). Maak een hard plastic container met droogijs en plaats een vel aluminiumfolie op het droogijs voor tijdelijke opslag van de verdeelde sample glaasjes tijdens het cryosnijden.
Let op: Droogijs is extreem koud. Behandel het droogijs altijd met zorg en draag geïsoleerde handschoenen wanneer u het gaat hanteren. - Breng het verse bevroren specimen over in een emmer droogijs. Plaats een laag LGO-verbinding op een cryostaat-preparaathouder en plaats het preparaat onmiddellijk op de top van de LGO met zachte druk. Wanneer OCT volledig is bevroren, bevestig de houder met het preparaat in de snij-arm van cryostaat.
- Laat het monster gedurende 15 minuten in de cryostaat om naar de snijtemperatuur te gaan.
- Sectie het weefsel en verzamel de plakjes op polyethyleen naftalaat (PEN) membraan dia's met een dikte van 12 μm. Lijn opeenvolgende secties op het membraan uit. Als één dia is voltooid, laat u de secties een paar minuten drogen en zet u de dia op de folie in de droogijscontainer totdat alle benodigde dia's zijn verzameld.
- Bewaar de dia's bij-80 °C in een Slide box.
Opmerking: De dikte van de sectie wordt gekozen om de hoeveelheid verzamelde weefsel te maximaliseren terwijl het efficiënt snijden van het weefsel mogelijk is, en kan variëren afhankelijk van het weefsel van belang. Het protocol kan hier worden onderbroken. Houd dia's vrij van RNase contaminatie. Vermijd temperatuurwisselingen. Hoewel de RINs van RNA uit dia's die tot 6 maanden zijn bewaard nog steeds een hoge kwaliteit van het RNA kunnen aanduiden, raden we aan om dia's zo snel mogelijk te gebruiken.
3. monstervoorbereiding voor laser Capture micro dissectie
- Bereid oplossingen voor vlekken en uitdroging.
- Plaats 45 mL 80% ethanol in elk van 3 50 mL centrifugebuizen op ijs. Label ze als #1, #2 en #3. Verdun ethanol met RNase/DNase vrij water.
- Plaats 45 mL 95% ethanol in een centrifugebuis van 50 mL op ijs.
- Plaats 45 mL 100% ethanol in een centrifugebuis van 50 mL op ijs.
- Plaats 45 mL xyleen in een centrifugebuis van 50 mL bij kamertemperatuur.
Let op: Xyleen moet worden gebruikt in een rook afzuigkap.
- Ontdooi een PENMEMBRAAN dia kort door deze tegen een hand gehandschoende handen te plaatsen en vervolgens tweemaal voor 30 s te spoelen in 45 mL 80% ethanol (#1 en #2) met agitatie in 50 mL centrifugebuizen om de OCT te verwijderen.
Opmerking: Het is belangrijk om te verwijderen van de LGO vóór de kleuring, om te voorkomen dat de LGO losgemaakt tijdens het vlekken van de secties verduistert. Tang kan worden gebruikt om het verwijderen van de LGO die niet wordt weggespoeld door agitatie vergemakkelijken. - Leg de glijbaan op een vel aluminiumfolie. Pipetteer 0,8 mL 0,1% Cresylacetaat Violet in 50% ethanol op de glijbaan en vlek voor 30 s. was de glijbaan in 45 mL 80% ethanol (#3) gedurende 30 sec. en dehydraat vervolgens met een doorgang voor 30 sec. per 45 mL 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen in 50 mL centrifugebuizen.
- Stand schuift op een delicate taak wisser voor 5 min om xyleen en droge secties af te voeren.
Opmerking: De glaasjes moeten vóór de LCM volledig worden gedroogd.
4. laser Capture Microdissectie
Opmerking: Draag Poedervrije nitril handschoenen tijdens het uitvoeren van LCM.
- Schakel de LCM-Microscoop, laser en computer in. Meld u aan bij de computer en start de software. Draai de sleutel naar de "on"-stand om de laser op te starten. Wanneer het groene lampje (laser) brandt, drukt u op de rode knop om de laser te activeren, waarna het licht (laser) rood wordt, wat aangeeft dat laser klaar is voor gebruik.
Opmerking: De laser heeft ongeveer 10 minuten nodig om op te warmen. - De collectie buizen instellen.
- Steek de dop van een 0,5 mL polymerase kettingreactie (PCR) buis in de collector.
Opmerking: Kies de bijpassende collector voor de gewenste PCR-tubes (0,2 of 0,5 mL). - Pipetteer 50 μL van de extractiebuffer (geleverd door de RNA-isolatie kit die wordt vermeld in de inhoudstafel) in de dop van de 0,5 ml-opvang buis.
- Plaats het opvangapparaat in de Microscoop.
- Klik in het venster Collector apparaat wijzigen op de knop verplaatsen naar referentiepunt om het verzamelprogramma naar het referentiepunt (RP) te verplaatsen. Pas de focus aan om de RP duidelijk te bekijken. Klik op de pijlen om de RP naar het midden van de weergave te verplaatsen.
- Steek de dop van een 0,5 mL polymerase kettingreactie (PCR) buis in de collector.
- Laad de specimen dia's.
- Klik op de knop links verwijderen op de werkbalk om de dia-houder te verlagen.
- Plaats de Schuif in de houder, met de weefsel sectie naar beneden gericht.
Opmerking: Deze oriëntatie zorgt ervoor dat de vastgelegde weefsel secties in de dop van de opvang buis vallen door zwaartekracht. - Plaats de houder weer in het werkgebied.
- Stel de laser parameters in.
- Selecteer de optie besturingselement van het Laser menu of klik op het Laser pictogram.
- Pas deze parameters naar wens aan: vermogen, de kracht van de laser; Diafragma, de breedte van de laser; en snelheid, de snelheid van snijden in de teken-en snij modus.
Opmerking: Test de laser in een gebied buiten de belangstelling. Een hoger vermogen of groter diafragma maakt het gemakkelijker om te knippen, maar veroorzaakt meer schade aan cellen. Pas de combinatie van vermogen, diafragma en snelheid aan om efficiënt snijden en minimale beschadiging van het weefsel te verkrijgen. Bijvoorbeeld, vermogen = 40, diafragma = 5, en snelheid = 7 voor kraakbeenweefsel op een 12 μm-sectie.
- Selecteer en snijd gebieden van belang.
- Begin met 5x objectief en vind de interessegebieden en schakel vervolgens over naar het doel (5x, 10x of 40x) dat het beste het interessegebied toont.
Opmerking: Na Cresylacetaat Violet kleuring, kraakbeen zijn gekleurd magenta en gemineraliseerde weefsels verschijnen bruin of zwart, te onderscheiden van andere weefsels. Afbeeldingen kunnen worden opgeslagen met de optie afbeelding opslaan als in het menu bestand . - Kies de tube voor de collectie (A, B, C, D) door op de markering bij de verzamelaar te klikken.
- Kies verplaatsen en knippen of tekenen en knippen. In de modus verplaatsen en knippen wordt het preparaat handmatig geknipt, met de muis of de touch-screen pen om vormen uit de vrije hand te tekenen. In de teken-en snij modus kunnen vormen worden getekend met de muis of de touch-screen pen voor het volgende snijden. Klik op de knop Begin knippen om lasersnijden te starten.
- Zodra de snede is voltooid, valt het doelweefsel met het PENMEMBRAAN in de dop van de opvang buis door de zwaartekracht. Herhaal 4,5 als u meerdere interessegebieden wilt pool, indien nodig.
Opmerking: Herhaalde sneden of vergroten van het vermogen of diafragma kunnen nodig zijn als het weefsel niet in de dop van de opvang buis daalt als gevolg van onvolledig snijden. Gemineraliseerd bot (bruin of zwart) kan niet rechtstreeks door laser worden afgesneden.
- Begin met 5x objectief en vind de interessegebieden en schakel vervolgens over naar het doel (5x, 10x of 40x) dat het beste het interessegebied toont.
- Verwijder de collector en sluit de PCR-buis voorzichtig. Plaats de microdissected weefsels in droogijs. Ga door naar de volgende stap of winkel bij-80 °C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Herhaal 4,2 tot 4,6 voor het volgende voorbeeld.
5. Lysis van Microdissected weefsels en RNA-isolatie
- Ontdooit de micro-ontleed weefsels bij kamertemperatuur. Centrifugeer kort en inincuberen de monsters gedurende 30 minuten bij 42 °C.
- Na incubatie draait u de lysisbuffer naar beneden in de PCR-buis van 0,5 mL. Voer DNase-behandeling en RNA-extractie uit met behulp van een RNA-isolatie kit (Zie de tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coronale gedeelten van vers bevroren muizen weefsels bij e 16.5 werden gebruikt om de isolatie en verzameling van het kraakbeen (MC), condylenbaan kraakbeen en mandibulaire bot door LCM aan te tonen. Muizen embryo's bij E 16.5 werden ontleed en ingebed in cryogene mallen met een LGO-compound. Monsters in mallen werden snel bevroren in een droogijs en methyl-2-butaan bad en opgeslagen bij-80 °C.
Voor het demonstreren van Cresylacetaat Violet kleuring van kraakbeen en bot, werd cryosectioning in het coronale vlak uitgevoerd en werden monsters verzameld op Microscoop-dia's. Secties werden gewassen, gekleurd en gedehydrateerd volgens het bovenstaande Protocol (stap 3.2 – 3.4). Dia's werden lucht gedroogd en gemonteerd met een permanent bevestigings medium. Alle kraakbeen onderzoeken werden gekleurd magenta (MC, condylenbaan kraakbeen, nasale septum kraakbeen, ribben kraakbeen, kraakbeen primordium van presphenoid bot, kraakbeen Primordia van RADIUS en ulna) en alle gemineraliseerde weefsels werden bruin of zwart gekleurd (Figuur 1A – E). Zowel kraakbeen en bot werden gemakkelijk onderscheiden van andere weefsels op meerdere anatomische plaatsen.
Voor LCM werden de hoofden van embryo's bij E 16.5 in het coronale vlak op de glijbanen van het PENMEMBRAAN met een dikte van 12 μm verdeeld en werden 6 – 8 opeenvolgende delen per dia verzameld en opgeslagen bij-80 °C. OCT werd verwijderd en secties werden gekleurd met Cresylacetaat Violet en gedehydrateerd volgens het hierboven beschreven Protocol (stap 3.2 – 3.4). MC, condylenbaan kraakbeen, en de mandibulaire botten gebieden werden geselecteerd en geïsoleerd door LCM (Figuur 2). De geselecteerde gebieden daalden in de lysisbuffer in de dop van de verzamelbuis. Om voldoende RNA voor sequencing te verkrijgen, hebben we 10 regio's van MC, 10 regio's van condylenbaan kraakbeen of 4 gebieden van Mandibulair bot in elke verzamelbuis samengevoegd als één monster.
RNA werd geëxtraheerd met behulp van een RNA Isolation Kit volgens de instructies van de fabrikant. Totaal RNA werd geanalyseerd met behulp van een bioanalysator (Figuur 3a – B). Om het effect van Cresylacetaat Violet kleuring op de kwaliteit van RNA te testen, vergeleken we RNA van mandibulaire botmonsters gekleurd met Cresylacetaat Violet en monsters zonder kleuring (mineraliseerd weefsel is zichtbaar zonder kleuring, maar Cresylacetaat Violet kleuring verbetert de zichtbaarheid om bot te onderscheiden van omringende weefsels). Er werd geen significant verschil in RNA-integriteit waargenomen tussen gekleurd monster (n = 4) en monsters zonder kleuring (n = 4), wat aangeeft dat de snelle Cresylacetaat-Violet kleuring in dit protocol een onbelangrijk effect heeft op de RNA-kwaliteit (P = 0,858, tweezijdige Welch-t-toets, Figuur 3C). We gebruikten ons protocol voor LCM van verschillende weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia en RINs werden gemeten, wat duidt op een hoge RNA-kwaliteit (Figuur 3D). De gemiddelde opbrengsten van RNA van MC, condylenbaan kraakbeen en mandibulaire bot waren 7,50 ± 1,45 ng, 12,55 ± 2,75 ng, en 33,02 ± 7,63 ng (Figuur 3E) en de opbrengst/oppervlakte was 19,73 ± 3,82 ng/mm2, 26,70 ± 5,84 ng/mm2en 17,23 ± 3,98 ng/mm2, respectievelijk (Figuur 3F), zonder significant verschil tussen de weefsels (MC versus condylenbaan kraakbeen, p = 0,383; condylenbaan kraakbeen versus Mandibulair bot, p = 0,260; MC versus Mandibulair bot, P = 0,674).
Bibliotheken werden voorbereid en geordend zoals eerder beschreven6,7. Een representatieve cDNA-grootte was ongeveer 500 BP (Figuur 4A). RNA-SEQ-gegevens werden geanalyseerd met MultiQC8. We analyseerden RNA-SEQ-gegevens uit 18 LCM-samples (MC1-6, het kraakbeen van Meckel; C1-6, condylenbaan kraakbeen; M1-6, Mandibulair bot). De gemiddelde kwaliteitswaarden over elke basispositie in de leesbewerkingen werden gegenereerd door FastQC, wat duidt op zeer goede kwaliteits oproepen (Figuur 4B). Lees uitlijning werd geanalyseerd met Picard (Figuur 4C). De leesbewerkingen toonden hoge uitgelijnde percentages en het gemiddelde percentage uitgelijnde leesbewerkingen bedroeg 75%. Gendekking werd geanalyseerd met Picard (Figuur 4D), die een goede vertegenwoordiging gaf langs de transcriptie van de 5 ' naar het 3 ' einde.
Differentiële genexpressie analyse werd uitgevoerd op6,7. Er waren 4.006 genen significant differentieel uitgedrukt (P < 0,05) tussen het mandibulaire bot en MC (Figuur 5A). Genen die specifiek zijn voor osteoblasten of osteocyten (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, DSTN13, Runx214, Sp715en sparc16) waren meer uitgesproken in het mandibulaire bot in vergelijking met MC, terwijl Chondrocyte-specifieke genen (Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, comp22, Lect123en Sox524) werden meer uitgesproken in MC ten opzichte van het mandibulaire bot (Figuur 5B en tabel 1). Daarnaast werden osteoclast markers zoals Acp525, Csf1r26, ctsk27, Itgb328en Oscar29 ook geïdentificeerd als meer sterk uitgedrukt in het mandibulaire bot vergeleken met MC (Figuur 5B en tabel 1), wat duidt op een geslaagde isolatie van gerichte weefsels.
Figuur 1: representatieve Cresylacetaat Violet kleuring van kraakbeen en bot in coronale delen van de muis embryo bij e 16.5. A) het kraakbeen en hemimandible van Meckel. B) het kraakbeen, condylenbaan kraakbeen en hemimandible van Meckel. (C) nasaal septum en maxillae. D) het kraakbeen primordium van het presphenoid bot en het paltserbot. (E) kraakbeen primordium van RADIUS, kraakbeen primordium van ulna en ribben kraakbeen. C = condylenbaan kraakbeen; CC = ribben kraakbeen; CP = kraakbeen primordium van presphenoid bot; M = hemimandible; MC = het kraakbeen van Meckel; MX = maxilla; NS = nasale septum; PL = paltserbot; R = kraakbeen primordium van RADIUS; U = kraakbeen primordium van ulna. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve regio's die door de LCM worden geïsoleerd en verzameld voor RNA-SEQ. (a – C) Representatief gekleurd MC (A), condylenbaan kraakbeen (B), en hemimandible met MC al geïsoleerd (C) in cryosectie voor LCM. (D – F) De regio's in A, B en C na gerichte weefsels werden geïsoleerd door LCM. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: RNA-kwaliteit en hoeveelheid van LCM-monsters. (a – B) Representatief elektrofiel gram (A) en het bijbehorende Gelbeeld (B) van een bioanalysator voor een mandibulaire botmonster. C) rinen van totaal RNA uit mandibulaire botmonsters, gekleurd met cresylviolet (n = 4) of zonder kleuring (n = 4). D) rinen van totaal RNA van verschillende weefsels, geïsoleerd door LCM. Het kraakbeen van Meckel bij E 16.5 (n = 6); Condylar kraakbeen bij E 16.5 (n = 6); Mandibulair bot bij E 16.5 (n = 6); Nasale septum kraakbeen bij E 14.5 (n = 6); Hersenen bij E 14.5 (n = 6); Hersenen bij E 16.5 (n = 7); Hersenen bij E 18.5 (n = 4). E) rendement van totaal RNA uit drie weefsels. Elke MC of condylenbaan kraakbeen monster was een pool van 10 microdissected gebieden van kraakbeen en elke steekproef van mandibulaire bot was een pool van 4 micro ontleed gebieden van hemimandible. F) het rendement per oppervlakte-eenheid (ng/mm2) in elk weefsel. Gegevens zijn gemiddeld ± s.e.m. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: de kwaliteit van bibliotheken en RNA-SEQ-gegevens die zijn gegenereerd uit LCM-samples. A) representatievecDNA-grootten van een bibliotheek uit een door een bioanalysator bepaald mandibulaire botmonster. (B – D) Analyse van de kwaliteitscontrole van RNA-SEQ uit 18 LCM-monsters (MC1-6, het kraakbeen van Meckel; C1-6, condylenbaan kraakbeen; M1-6, Mandibulair bot) door MultiQC. B) de gemiddelde kwaliteitswaarden over elke basispositie in de leesbewerkingen zijn gegenereerd door fastqc. De achtergrond van de grafiek verdeelt de y-as in zeer goede kwaliteit oproepen (groen), oproepen van redelijke kwaliteit (oranje), en oproepen van slechte kwaliteit (rood). (C) uitlijning van de leesbewerkingen werd geanalyseerd door Picard. De samenvatting wordt weergegeven als de percentages van uitgelijnde leesbewerkingen. (D) genormaliseerde gendekking geanalyseerd met Picard. Het plot geeft de relatieve gemiddelde dekking langs de transcriptie aan van 5 ' end (links) tot 3 ' end (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: differentiële expressie analyse van RNA-SEQ-gegevens van mandibulaire bot en MC geïsoleerd door LCM. A) hiërarchische clustering van 4.006 genen die significant worden uitgedrukt (P < 0,05) tussen het mandibulaire bot en MC. Voor elk weefsel werden drie biologische replicaten gebruikt. M1-3, mandibulaire bot; MC1-3, MC. (B) vulkaan plot met vouw veranderingen en P-waarden van differentiaal uitgedrukte genen tussen Mandibulair bot en MC. voorbeelden van zeer onderscheidende celspecifieke genen worden getoond: osteoblast en osteocyte markeringen in blauw, osteoclast markeringen in het groen en chondrocyten markeringen in rood. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gen | Celtype | log2FoldChange | Gemiddelde uitdrukking | Aangepaste P-waarde |
| Col1a1 | Osteoblast/Osteocyte | 2,64 | 12,94 | 2.22 e-05 |
| Col1a2 | Osteoblast/Osteocyte | 3,41 | 12,87 | 8.27 e-07 |
| Dkk1 | Osteoblast/Osteocyte | 7,59 | 2,01 | 5.21 e-03 |
| Dmp1 | Osteoblast/Osteocyte | 9,73 | 3,42 | 3.19 e-04 |
| DSTN | Osteoblast/Osteocyte | 2,51 | 6,87 | 5.73 e-07 |
| Runx2 | Osteoblast/Osteocyte | 1,24 | 8,62 | 4.08 e-02 |
| Sp7 | Osteoblast/Osteocyte | 2,24 | 6,95 | 5.81 e-03 |
| Sparc | Osteoblast/Osteocyte | 3,40 | 12,26 | 5.56 e-09 |
| Acp5 | Osteoclast | 3,38 | 5,74 | 6.46 e-06 |
| Csf1r | Osteoclast | 2,01 | 5,80 | 1.17 e-04 |
| Ctsk | Osteoclast | 3,19 | 7,56 | 5.73 e-07 |
| Itgb3 | Osteoclast | 2,88 | 5,37 | 2.43 e-04 |
| Oscar | Osteoclast | 3,41 | 2,67 | 1,63 e-04 |
| Antarctic | Chondrocyten | -5,23 | 5,01 | 2.76 e-04 |
| Col2a1 | Chondrocyten | -3,61 | 9,47 | 3.29 e-03 |
| Col9a1 | Chondrocyten | -7,01 | 3,58 | 5.51 e-03 |
| Col9a2 | Chondrocyten | -5,40 | 3,76 | 2.60 e-03 |
| Col9a3 | Chondrocyten | -6,63 | 3,80 | 2.90 e-02 |
| Comp | Chondrocyten | -5,86 | 1,54 | 7.51 e-03 |
| Lect1 | Chondrocyten | -7,37 | 1,34 | 2.35 e-02 |
| Sox5 | Chondrocyten | -2,88 | 4,43 | 6.06 e-04 |
Tabel 1: differentiële uitdrukking van bekende genen in verschillende celtypen van bot en kraakbeen (mandibulaire bot versus MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM maakt de isolatie van verrijkte of homogene celpopulaties uit heterogene weefsels mogelijk. De voordelen omvatten snelle en nauwkeurige vangst van cellen in hun in vivo context, terwijl potentiële nadelen omvatten het is tijdrovend, duur, en beperkt door de noodzaak voor de gebruiker om verschillende subpopulaties binnen een gespecificeerd voorbeeld te herkennen30. Dit protocol bevat details van LCM van muis embryonaal kraakbeen en bot, waarbij het gebruik van Cresylacetaat Violet kleuring in een snelle procedure wordt benadrukt om kraakbeen en botten te visualiseren voor precieze weefsel verzameling met behoud van hoge RNA-integriteit voor latere analyse door RNA-SEQ. Eén beperking van dit protocol is dat het hier gebruikte LCM-systeem niet in staat is om rechtstreeks over gemineraliseerde weefsels te snijden (bijv. het mandibulaire weefsel in het zwart in Figuur 2C); Als gevolg hiervan moet het hele been gebied worden ontleed. Met name de door de LCM geïsoleerde microdissected ossificeerde gebieden zijn niet homogeen, en omvatten ten minste de subpopulaties osteoblasten, osteocyten en osteoclasten (tabel 1). Niettemin is de verrijking door LCM waardevol, omdat uit onze vorige studie is gebleken dat transcriptionele veranderingen in specifieke subpopulaties zoals osteoclasten in het micro-gedissected botweefsel nog steeds kunnen worden opgespoord door RNA-SEQ6.
Voor genexpressie analyse hebben we de monstervoorbereiding en LCM-procedure geoptimaliseerd voor hoge RNA-kwaliteit en-opbrengst. Ons protocol begint met verse bevroren weefsels. Verse bevroren weefsel secties zorgen voor een uitstekende hoeveelheid en kwaliteit van geëxtraheerd RNA3, als mRNA is gevoelig voor standaardmethoden van fixatie31. RNA wordt snel aangetast door RNase besmetting, en het onderhoud van een RNase-vrije omgeving tijdens monstervoorbereiding, LCM, en RNA-isolatie is essentieel voor een geslaagde toepassing. Blootstelling aan water tijdens de verwerking van de sectie is schadelijk voor de RNA-kwaliteit31,32. Ons protocol beperkt deze blootstelling, waarbij het hoogste niveau van waterige blootstelling 50% is tijdens het kleuren van Cresylacetaat Violet. We hebben getest dat een snelle kleuring (30 s) met 0,1% Cresylacetaat Violet in 50% ethanol een te onderscheiden kleur geeft aan kraakbeen en de RNA-integriteit niet verlaagt voor downstreamanalyse, zoals lage input RNA-SEQ (Figuur 3C en Figuur 4). De opbrengst/oppervlakte (ng/mm2) is ongeveer 20 ng/mm 2 (Figuur 3F), vergelijkbaar met of hoger dan de vorige geoptimaliseerde methoden33. Volgens de celdichtheden in MC en mandibulaire Bone6, schatten we dat met dit protocol de gemiddelde opbrengst van één cel ongeveer 5 PG RNA per cel is en 1 – 5 ng van het totale RNA kan worden geëxtraheerd uit 200 – 1000 cellen, die kunnen worden gebruikt voor low-input RNA-SEQ6,7,33. Deze rendements efficiëntie is veel hoger dan de vastgestelde LCM-methoden34, en ook superieur of vergelijkbaar met recente geoptimaliseerde protocollen33,35.
De mogelijkheid om verschillende celtypen te onderscheiden in histologische secties is essentieel voor het nauwkeurig verzamelen van specifieke weefsels van belang. Cresyl Violet is een hydrofiele, basische vlek die bindt aan negatief geladen nucleïnezuren36. Deze eigenschap maakt het nuttig voor contra vlekken met cel-type selectiviteit37, en het is een standaard histologische vlek voor neuronen38. Cresyl Violet is gebruikt in LCM voor een verscheidenheid van weefsels, het verstrekken van goede weefsel morfologie en hoge RNA-kwaliteit33,36,39,40. In vergelijking met andere kleurings methoden biedt Cresylacetaat Violet kleuring cytoplasmische en nucleaire Details, en een lage RNA-afbraaksnelheid32. We laten hier zien dat Cresylacetaat Violet kleuring een eenvoudige en snelle methode is om kraakbeen en botten te visualiseren en dat weefsel bevlekt met deze methode de hoge RNA-integriteit vervormt. De behandeling met xyleen wordt vaak gebruikt voor uitdroging van de weefsels vóór LCM35,36,41,42. We gebruiken xyleen om de visualisatie van weefsel morfologie35 te verbeteren, wat essentieel is om gerichte weefsels te onderscheiden, vooral op dia's met een pen membraan die niet zo optisch helder zijn als gewone glaasjes. We vonden geen significant voorkomen van sectie verlies van PEN dia's tijdens kleuring en wassen stappen, zelfs met opwinding te verwijderen OCT.
Microdroplet of microfluidics-gebaseerde single-cell RNA-SEQ (scRNA-SEQ) is een high-throughput methode om transcriptomes van weefsels met heterogene celtypen te analyseren en is begonnen te worden gebruikt in de skelet biologie43. In tegenstelling tot LCM omvat scRNA-SEQ enzymatische en/of mechanische uitsplitsing van weefsel in afzonderlijke cellen. De meeste protocollen voor de bereiding van één cel vereisen dat weefsels gedurende langere tijd bij kamertemperatuur of 37 °c worden geïnineerd, wat de transcriptome44,45verandert. Bovendien kan isolatie van enkelvoudige cellen in kraakbeen en bot fysiek worden beperkt door de complexiteit van het skelet van trabecularisatie en mineralisatie. Het is nog steeds een technische uitdaging om een voldoende aantal levensvatbare cellen te isoleren van skelet weefsels die nauwkeurig representatief zijn voor de cellulaire diversiteit van weefsels in vivo, en onvolledige dissociatie van de cellen kan vooroordelen veroorzaken bij de detectie van celtypen43. Terwijl scRNA-SEQ identificatie van verschillende celtypen toestaat, is de sequentie diepte laag en typische sequentiëren benaderingen Capture 3 ' Transcript eindigt en niet toestaan dat alternatieve splicing analyse. Bulk RNA-seq van LCM-afgeleid weefsel homogeniseert celverschillen, maar maakt uitgebreide transcriptie detectie en alternatieve splicing analyse mogelijk. LCM is daarom vooral nuttig voor skelet weefsels die niet gemakkelijk te scheiden zijn van omringende weefsels en intern complex, en verse bevroren voorbereiding van het weefsel kan zowel transcriptionele profielen als RNA-integriteit voor transcriptionele analyse behouden. Een andere zwakte van scRNA-SEQ is dat na de voorbereiding van een enkele cel, de ruimtelijke informatie van de cellen verloren gaat. Een combinatie van LCM en scRNA-SEQ is ontwikkeld om de studie van het transcriptome van een klein monster uit afgebakende geografische locaties (geo-SEQ)46mogelijk te maken, wat een andere benadering is van het gebruik van LCM om regionaliseerde genexpressie te bestuderen.
Samenvattend, dit protocol bevat details van geoptimaliseerde LCM van kraakbeen en bot, waarbij het gebruik van Cresylacetaat Violet kleuring in een snelle procedure wordt benadrukt om kraakbeen en botten te visualiseren voor precieze weefsel verzameling met behoud van hoge RNA-integriteit voor latere analyse door RNA-SEQ. Dit protocol is met succes gebruikt voor LCM van kraakbeen en bot in verschillende ontwikkelingsstadia voor genexpressie analyse6,7, en ook kan worden gebruikt voor andere weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) en het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). De auteurs danken de Biorepository en pathologie kern voor toegang tot het Leica LMD 6500 platform aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
