Summary
Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l'isolement du cartilage et de l'os des sections congelées fraîches de l'embryon de souris. Le cartilage et l'os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.
Abstract
La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler des types de cellules ou des régions d'intérêt spécifiques des tissus hétérogènes. La complexité cellulaire et moléculaire des éléments squelettiques augmente avec le développement. L'hétérogénéité tissulaire, comme à l'interface des éléments cartilagineux et osseux les uns avec les autres ou avec les tissus environnants, est un obstacle à l'étude du développement du cartilage et des os. Notre protocole fournit une méthode rapide de traitement des tissus et l'isolement du cartilage et des os qui donne un ARN de haute qualité pour l'analyse de l'expression génique. Les tissus congelés frais des embryons de souris sont sectionnés et de brèves taches violettes cresyl est utilisée pour visualiser le cartilage et les os avec des couleurs distinctes des tissus environnants. Les glissements sont alors rapidement déshydratés, et le cartilage et l'os sont isolés par la suite par LCM. La minimisation de l'exposition aux solutions aqueuses au cours de ce processus maintient l'intégrité de l'ARN. Le cartilage et l'os mandibulaire de Mouse Meckel à E16.5 ont été avec succès rassemblés et l'analyse d'expression de gène a montré l'expression différentielle des gènes de marqueur pour des ostéoblastes, des osteocytes, des osteoclastes, et des chondrocytes. L'ARN de haute qualité a également été isolé à partir d'une gamme de tissus et d'âges embryonnaires. Ce protocole détaille la préparation de l'échantillon pour le LCM, y compris la cryoembedding, le sectionnement, la coloration et la déshydratation des tissus frais congelés, et l'isolement précis du cartilage et de l'os par LCM ayant pour résultat l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.
Introduction
Le système musculo-squelettique est un système multicomposant composé de muscle, tissu conjonctif, tendon, ligament, cartilage et os, innervé par les nerfs et vascularisé par les vaisseaux sanguins1. Les tissus squelettiques se développent avec l'hétérogénéité cellulaire croissante et la complexité structurale. Le cartilage et l'os se développent à partir de la même lignée osteochondroprogenitor et sont fortement liés. Le cartilage et l'os embryonnaires se développent en association avec des muscles, des nerfs, des vaisseaux sanguins, et le mésenchyme indifférencié. Le cartilage peut également être entouré par l'os, tel que le cartilage de Meckel et le cartilage condylar dans l'os mandibulaire. Ces tissus sont anatomiquement associés et interagissent les uns avec les autres par des signaux extracellulaires au cours du développement. Dans l'étude de l'expression génique dans le développement du cartilage et de l'os, un obstacle est l'hétérogénéité des structures squelettiques composées de plusieurs types de tissus. L'isolement précis du tissu spécifique d'intérêt est la clé pour l'analyse transcriptionnelle réussie.
La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler les types de cellules ou les régions d'intérêt dans les tissus hétérogènes, et est reproductible et est sensible au niveau cellulaire unique2. Il peut précisément cibler et capturer des cellules d'intérêt pour un large éventail d'essais en aval dans la transcriptomique, la génomique et la protéomique3,4. La qualité de l'ARN, de l'ADN ou de la protéine isolés peut être évaluée à l'aide d'un bioanalyseur ou d'une plate-forme équivalente. Par exemple, la qualité de l'ARN est indiquée par le numéro d'intégrité de l'ARN (RIN)5.
Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration rapide et l'isolement du cartilage et de l'os par LCM des tissus congelés frais. Nous utilisons l'embryon de souris pour démontrer que ce protocole donne de l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique ultérieure, comme le séquençage de l'ARN (ARN-seq).
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Protocol
Les tissus de souris ont été obtenus conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et les protocoles d'étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï.
1. Préparation de spécimens congelés frais
- Disséquer l'embryon ou le tissu d'intérêt. Intégrer l'échantillon dans un moule d'intégration jetable avec une température de coupe optimale (OCT). Ajuster l'orientation du spécimen à l'aide d'une pointe ou d'une aiguille.
- Congelez rapidement les échantillons dans un bain de glace sèche/méthyl-2-butane. Continuer jusqu'à l'étape suivante ou conserver à -80 oC.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Cryosectioning pour la microdissection de capture de laser
- Décongeler le cryostat et nettoyer les surfaces internes avec 70 % d'éthanol. Traiter la plaque anti-rouleau et une paire de forceps avec l'agent de décontamination RNase. Fixer le cryostat à la température de coupe désirée (-18 à -22 oC). Préparer un contenant à couvercle avec de la glace sèche, en plaçant une feuille de papier d'aluminium sur la glace sèche pour le stockage temporaire des glissières d'échantillon sectionnées pendant la cryosection.
MISE EN GARDE: La glace sèche est extrêmement froide. Manipulez toujours de la glace sèche avec soin et portez des gants isolés lorsque vous la manipulez. - Transférer le spécimen congelé frais dans un seau de glace sèche. Placez une couche de composé OCT sur un porte-spécimen de cryostat et placez immédiatement le spécimen sur le dessus de l'OCT avec une légère pression. Lorsque l'OCT est complètement congelé, attachez le support avec le spécimen dans le bras de coupe de cryostat.
- Laisser l'échantillon dans le cryostat pendant 15 min pour l'équilibre à la température de coupe.
- Sectionnez le tissu et collectez les tranches sur les glissières de membrane de naphtalate de polyéthylène (PEN) à une épaisseur de 12 m. Aligner les sections consécutives sur la membrane. Une fois la diapositive terminée, laisser sécher les sections pendant quelques minutes et transférer la glissière sur le papier d'aluminium dans le contenant de glace sèche jusqu'à ce que toutes les glissières requises soient ramassées.
- Conserver les diapositives à -80 oC dans une boîte à diapositives.
REMARQUE: L'épaisseur de la section est choisie pour maximiser la quantité de tissu recueillie tout en permettant une coupe efficace du tissu, et peut varier en fonction du tissu d'intérêt. Le protocole peut être mis en pause ici. Gardez les glissières exemptes de contamination par la RNase. Évitez les changements de température. Bien que les RIN de l'ARN des diapositives stockées pendant jusqu'à 6 mois puissent encore indiquer la haute qualité de l'ARN, nous recommandons d'utiliser des glissières dès que possible.
3. Préparation d'échantillon pour la microdissection de capture de laser
- Préparer des solutions pour la coloration et la déshydratation.
- Placer 45 ml d'éthanol à 80 % dans chacun des trois tubes centrifugeuses de 50 ml sur la glace. Étiquetez-les comme #1, #2 et #3. Diluer l'éthanol avec de l'eau libre RNase/DNase.
- Placer 45 ml d'éthanol à 95 % dans un tube de centrifugeuse de 50 ml sur la glace.
- Placer 45 ml d'éthanol à 100 % dans un tube de centrifugeuse de 50 ml sur la glace.
- Placer 45 ml de xylène dans un tube de centrifugeuse de 50 ml à température ambiante.
MISE EN GARDE: Xylène doit être utilisé dans une hotte de fumée.
- Décongeler brièvement une glissière à membrane PEN en la plaçant contre une main gantée, puis laver deux fois pendant 30 s chacune dans 45 ml d'éthanol à 80 % (#1 et #2) avec de l'agitation dans des tubes centrifugeurs de 50 ml pour enlever l'OCT.
REMARQUE: Il est important d'enlever l'OCT avant la coloration, pour empêcher OCT desserré pendant la coloration d'obscurcir les sections. Forceps peut être utilisé pour faciliter l'enlèvement de l'OCT qui n'est pas lavé par l'agitation. - Déposer la glissière sur une feuille de papier d'aluminium. Pipette 0,8 ml de 0,1 % de cresyl violet dans 50 % d'éthanol sur la glissière et tache pendant 30 s. Laver la glissière en 45 ml d'éthanol à 80 % (#3) pour 30 s, puis déshydrater par passage pour 30 s chacun à 45 ml d'éthanol à 95 %, 100 % d'éthanol et xylène dans des tubes de 50 ml centrifugeuses.
- Tenez les glissières sur un essuie-glace délicat pendant 5 min pour égoutter les sections xylène et sèches.
REMARQUE: Les glissières doivent être séchées complètement avant l'OrC.
4. Microdissection de capture de laser
REMARQUE: Portez des gants nitriles sans poudre tout en effectuant LCM.
- Allumez le microscope LCM, le laser et l'ordinateur. Connectez-vous à l'ordinateur et démarrez le logiciel. Tournez la clé de la position "On" pour démarrer le laser. Lorsque la lumière verte (Laser) est allumée, appuyez sur le bouton rouge pour activer le laser, puis la lumière (Laser) devient rouge indiquant laser est prêt à utiliser.
REMARQUE: Le laser a besoin d'environ 10 min pour se réchauffer. - Configurez les tubes de collecte.
- Insérer le bouchon d'un tube de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 0,5 mL dans le collecteur.
REMARQUE: Choisissez le collecteur correspondant pour les tubes PCR désirés (0,2 ou 0,5 ml). - Pipette 50 'L de tampon d'extraction (fourni par le kit d'isolement de l'ARN énuméré dans le tableau des matériaux) dans le bouchon du tube de collecte de 0,5 ml.
- Insérer le dispositif de collecte dans le microscope.
- Dans la fenêtre De change Collector Device, cliquez sur le bouton Move to Reference Point pour déplacer le collecteur vers le point de référence (RP). Ajuster la mise au point pour afficher clairement le RP. Cliquez sur les flèches pour déplacer le RP vers le centre de la vue.
- Insérer le bouchon d'un tube de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 0,5 mL dans le collecteur.
- Chargez les diapositives de spécimen.
- Cliquez sur le bouton déchargement gauche dans la barre d'outils pour abaisser le support de diapositive.
- Placez la glissière dans le support, avec la section de tissu orientée vers le bas.
REMARQUE: Cette orientation garantit que les sections de tissu capturées tombent dans le bouchon du tube de collecte par gravité. - Insérez le support dans la scène.
- Configurez les paramètres laser.
- Sélectionnez l'option Contrôle du menu Laser ou cliquez sur l'icône Laser.
- Ajuster ces paramètres comme vous le souhaitez: Puissance, la puissance du laser; Ouverture, la largeur du laser; et Speed, la vitesse de coupe en mode Dessiner et Coupe.
REMARQUE: Testez le laser dans une zone hors d'intérêt. Une puissance plus élevée ou une ouverture plus grande facilite la coupe, mais cause plus de dommages aux cellules. Ajuster la combinaison de puissance, d'ouverture et de vitesse pour obtenir une coupe efficace et des dommages minimes du tissu. Par exemple, puissance 40, Ouverture 5 et Vitesse 7 pour le tissu cartilagineux sur une section de 12 m.
- Sélectionnez et coupez les zones d'intérêt.
- Commencez avec 5x objectif et trouver les zones d'intérêt, puis passer à l'objectif (5x, 10x, ou 40x) qui montre le mieux la zone d'intérêt.
REMARQUE: Après la coloration violette cresyl, les cartilages sont magenta souillés et les tissus minéralisés semblent bruns ou noirs, se distinguant des autres tissus. Les images peuvent être enregistrées à l'aide de Save Image As du menu Fichier. - Choisissez le tube pour la collecte (A, B, C, D) en cliquant sur la marque au collecteur.
- Choisissez Move and Cut or Draw and Cut. En mode Déplacer et couper, le spécimen est coupé manuellement, à l'aide de la souris ou du stylo à écran tactile pour dessiner des formes à main levée. En mode Dessiner et Couper, les formes peuvent être dessinées à main levée avec la souris ou le stylo à écran tactile pour la coupe ultérieure. Cliquez sur le bouton Démarrer la coupe pour lancer la découpe au laser.
- Une fois la coupe terminée, le tissu cible avec membrane PEN tombe dans le bouchon du tube de collecte par gravité. Répétez 4.5 pour mettre en commun plusieurs domaines d'intérêt si nécessaire.
REMARQUE: Répéter des coupures ou augmenter la puissance ou l'ouverture peut être nécessaire si le tissu ne tombe pas dans le bouchon du tube de collecte en raison de la coupe incomplète. L'os minéralisé (brun ou noir) ne peut pas être coupé directement au laser.
- Commencez avec 5x objectif et trouver les zones d'intérêt, puis passer à l'objectif (5x, 10x, ou 40x) qui montre le mieux la zone d'intérêt.
- Déchargez le collecteur et fermez soigneusement le tube PCR. Placer les tissus microdissés dans de la glace sèche. Continuer jusqu'à l'étape suivante ou conserver à -80 oC.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Répétez 4,2 à 4,6 pour l'échantillon suivant.
5. Lysis des tissus microdissés et de l'isolement d'ARN
- Décongeler les tissus microdissés à température ambiante. Centrifugeuse brièvement et incuber les échantillons pendant 30 min à 42 oC.
- Après l'incubation, faites tourner le tampon de lyse vers le bas dans le tube PCR de 0,5 ml. Effectuer le traitement de DNase et l'extraction d'ARN à l'aide d'un kit d'isolement d'ARN (voir le tableau des matériaux) suivant les instructions du fabricant.
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Representative Results
Des sections coronales des tissus congelés frais de souris à E16.5 ont été employées pour démontrer l'isolement et la collection du cartilage de Meckel (MC), du cartilage condylar, et de l'os mandibulaire par LCM. Les embryons de souris à E16.5 ont été disséqués et incorporés dans des moules cryogéniques avec composé d'OCT. Les échantillons dans les moules ont été rapidement congelés dans un bain de glace sèche et de méthyl-2-butane et stockés à -80 oC.
Pour démontrer la coloration violette de cresyl du cartilage et de l'os, la cryosection dans le plan coronal a été exécutée et des échantillons ont été rassemblés sur des glissières de microscope. Les sections ont été lavées, tachées et déshydratées suivant le protocole ci-dessus (étape 3.2-3.4). Les glissières étaient séchées à l'air et montées avec un support de montage permanent. Tous les cartilages examinés étaient magenta taché (MC, cartilage condylar, cartilage septum nasal, cartilage costal, cartilage primordium de l'os présphénoïde, primordia de cartilage de rayon et ulna) et tous les tissus minéralisés étaient tachés brun ou noir(figure 1A-E). Le cartilage et l'os ont été facilement distingués des autres tissus aux emplacements anatomiques multiples.
Pour le LCM, les têtes d'embryons à E16.5 ont été sectionnées dans le plan coronal sur des glissières de membrane PEN d'une épaisseur de 12 m, et 6 à 8 sections consécutives ont été recueillies par diapositive et stockées à -80 oC. L'OCT a été enlevée et les sections ont été tachées de violette cresyl et déshydratées suivant le protocole décrit ci-dessus (étape 3.2-3.4). MC, cartilage condylar, et les régions d'os mandibulaires ont été choisis et isolés par LCM (figure 2). Les régions sélectionnées sont tombées dans le tampon de lyse dans le bouchon du tube de collecte. Pour obtenir suffisamment d'ARN pour le séquençage, nous avons mis en commun 10 régions de MC, 10 régions de cartilage condylar ou 4 régions d'os mandibulaire dans chaque tube de collecte comme un échantillon, respectivement.
L'ARN a été extrait à l'aide d'un kit d'isolement de l'ARN suivant les instructions du fabricant. L'ARN total a été analysé à l'aide d'un bioanalyseur (Figure 3A-B). Pour tester l'effet de la coloration violette cresyl sur la qualité de l'ARN, nous avons comparé l'ARN des échantillons d'os mandibulaires tachés de violette cresyl et des échantillons sans coloration (tissu minéralisé est visible sans coloration, mais la coloration violette cresyl améliore la visibilité pour distinguer l'os des tissus environnants). Aucune différence significative dans l'intégrité de l'ARN n'a été observée entre les échantillons tachés (n - 4) et les échantillons sans coloration (n - 4), ce qui indique que la coloration violette cresyl rapide dans ce protocole a un effet insignifiant sur la qualité de l'ARN (P - 0,858, test à deux queues de Welch, Figure 3C). Nous avons utilisé notre protocole pour le LCM de divers tissus à différents stades de développement et les RIN ont été mesurés, indiquant une qualité élevée d'ARN (Figure 3D). Les rendements moyens de l'ARN de MC, du cartilage condylar, et de l'os mandibulaire étaient 7.50 - 1.45 ng, 12,55 à 2,75 ng, et 33,02 à 7,63 ng (figure 3E) et le rendement/zone était de 19,73 à 3,82 ng/mm2, 26,70 à 5,84 ng/mm2, et 17,23 à 3,98 ng/mm2, respectivement (Figure 3F), sans différence significative entre les tissus (MC par rapport au cartilagineux condylar, P - 0,383; cartilage condylar par rapport à l'os mandibulaire, P - 0,260; MC contre os mandibulaire, P 0,674).
Les bibliothèques ont été préparées et séquencées comme indiqué précédemment6,7. La taille représentative de l'ADNc était d'environ 500 pb(figure 4A). Les données d'ARN-seq ont été analysées avec MultiQC8. Nous avons analysé des données d'ARN-seq de 18 échantillons de LCM (MC1-6, cartilage de Meckel ; C1-6, cartilage condylar; M1-6, os mandibulaire). Les valeurs de qualité moyennes à travers chaque position de base dans les lectures ont été générées par FastQC, indiquant des appels de très bonne qualité (Figure 4B). L'alignement de lecture a été analysé avec Picard (Figure 4C). Les lectures ont montré des pourcentages alignés élevés et le pourcentage moyen de lectures alignées était de 75%. La couverture génétique a été analysée avec Picard (Figure 4D), qui a indiqué une bonne représentation le long de la transcription de la 5' à la fin 3'.
L'analyse différentielle d'expression de gène a été exécutée6,7. Il y avait 4 006 gènes exprimés de façon significative de façon significative (P et lt; 0,05) entre l'os mandibulaire et MC (figure 5A). Les gènes spécifiques aux ostéoblastes ou ostéocytes (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715, et Sparc16) ont été plus fortement exprimés dans l'os mandibulaire par rapport à MC, tandis que les gènes chondrdrocyte-ocyte(Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123, et Sox524) ont été plus fortement exprimés en MC par rapport à l'os mandibulaire ( Figure5B et tableau 1). En outre, les marqueurs d'ostéoclaste tels que Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328, et Oscar29 ont également été identifiés comme plus fortement exprimés dans l'os mandibulaire par rapport à MC ( Figure5B et tableau 1), indiquant l'isolement réussi des tissus ciblés.
Figure 1 : Coloration violette cresyl représentative du cartilage et de l'os dans les sections coronaux de l'embryon de souris à E16.5. (A) Cartilage et hémimandiable de Meckel. (B) Cartilage de Meckel, cartilage condylar, et hémimandiable. (C) Septum nasal et maxillaire. (D) Cartilage primordium de l'os presphénoïde et de l'os palatin. (E) cartilage primordium de rayon, primordium de cartilage de ulna, et cartilage costal. C - cartilage condylar; CC - cartilage costal; CP - cartilage primordium de l'os présphénoïde; M - hemimandible; MC - cartilage de Meckel; MX et maxillaire; NS et septum nasal; PL et os palatin; R - cartilage primordium de rayon; U - cartilage primordium de ulna. Barre d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Régions représentatives isolées par LCM et recueillies pour l'ARN-seq. (A-C) Représentant teinté MC (A), cartilage condylar (B), et hémimandible avec MC déjà isolé (C) en cryosection avant LCM. (D-F) Les régions dans A, B, et C après que les tissus ciblés aient été isolés par LCM. Barre d'échelle de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Qualité et quantité d'ARN d'échantillons de LCM. (A-B) Électrophétoygramme représentatif (A) et l'image de gel associée (B) d'un bioanalyseur pour un échantillon d'os mandibulaire. (C) RINs d'ARN total à partir d'échantillons d'os mandibulaires tachés de violette cresyl (n - 4) ou sans coloration (n - 4). (D) RINs de l'ARN total de différents tissus isolés par LCM. Le cartilage de Meckel à E16.5 (n - 6); Cartilage condylar à E16.5 (n - 6); Os mandibulaire à E16.5 (n - 6); cartilage septum nasal à E14.5 (n - 6); Cerveau à E14.5 (n - 6); Cerveau à E16.5 (n ' 7); Cerveau à E18.5 (n ' 4). (E) Rendement de l'ARN total de trois tissus. Chaque échantillon de cartilage MC ou condylar était un pool de 10 régions microdissés du cartilage et chaque échantillon d'os mandibulaire était un pool de 4 régions microdissés de l'hémimandibilité. (F) Le rendement par unité (ng/mm2) dans chaque tissu. Les données sont moyennes et s.e.m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Figure 4 : La qualité des bibliothèques et des données RNA-seq générées à partir d'échantillons de LCM. (A) Tailles d'ADNC représentatives d'une bibliothèque à partir d'un échantillon d'os mandibulaire déterminé par un bioanalyseur. (B-D) Analyse de contrôle de qualité de l'ARN-seq de 18 échantillons de LCM (MC1-6, cartilage de Meckel ; C1-6, cartilage condylar; M1-6, os mandibulaire) par MultiQC. (B) Les valeurs de qualité moyennes à travers chaque position de base dans les lectures ont été générées par FastQC. L'arrière-plan du graphique divise l'axe y en appels de très bonne qualité (vert), appels de qualité raisonnable (orange) et appels de mauvaise qualité (rouge). (C) L'alignement des lectures a été analysé par Picard. Le résumé est indiqué sous forme de pourcentages de lectures alignées. (D) Couverture génétique normalisée analysée avec Picard. L'intrigue indique la couverture moyenne relative le long de la transcription de 5' fin (gauche) à 3' fin (droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse différentielle de l'expression des données d'ARN-seq de l'os mandibulaire et du MC isolés par LCM. (A) Le regroupement hiérarchique de 4 006 gènes exprimé de façon significative différentielle (P et 0,05) entre l'os mandibulaire et le MC. Trois répliques biologiques ont été utilisées pour chaque tissu. M1-3, os mandibulaire; MC1-3, MC. (B) Parcelle volcanique montrant les changements de pli et les valeurs P des gènes exprimés différemment entre l'os mandibulaire et LE MC. Des exemples de gènes cellulaires très différents sont présentés : marqueurs d'ostéoblaste et d'ostéocyte en bleu, marqueurs ostéoclastes en vert, et marqueurs de chondrocytes en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Gène | Type de cellule | log2FoldChange | Expression moyenne | Valeur P ajustée |
| Col1a1 (En) | Ostéoblaste/Osteocyte | 2.64 | 12.94 | 2.22E-05 |
| Col1a2 (Col1a2) | Ostéoblaste/Osteocyte | 3.41 | 12.87 | 8.27E-07 |
| Dkk1 (Dkk1) | Ostéoblaste/Osteocyte | 7.59 | 2.01 | 5.21E-03 |
| Dmp1 (Dmp1) | Ostéoblaste/Osteocyte | 9.73 | 3.42 | 3.19E-04 |
| Dstn (Dstn) | Ostéoblaste/Osteocyte | 2.51 | 6.87 | 5.73E-07 |
| Runx2 (runx2) | Ostéoblaste/Osteocyte | 1.24 | 8.62 | 4.08E-02 |
| Sp7 (sp7) | Ostéoblaste/Osteocyte | 2.24 | 6.95 | 5.81E-03 |
| Sparc | Ostéoblaste/Osteocyte | 3.40 | 12.26 | 5.56E-09 |
| Acp5 (En) | Ostéoclaste | 3.38 | 5.74 | 6.46E-06 |
| Csf1r (en) | Ostéoclaste | 2.01 | 5.80 | 1.17E-04 |
| Ctsk Ctsk | Ostéoclaste | 3.19 | 7.56 | 5.73E-07 |
| Itgb3 (en) | Ostéoclaste | 2.88 | 5.37 | 2.43E-04 |
| Oscar | Ostéoclaste | 3.41 | 2.67 | 1.63E-04 |
| Acan | Chondrocyte | -5.23 | 5.01 | 2.76E-04 |
| Col2a1 (En) | Chondrocyte | -3.61 | 9.47 | 3.29E-03 |
| Col9a1 (En) | Chondrocyte | -7.01 | 3.58 | 5.51E-03 |
| Col9a2 (En) | Chondrocyte | -5.40 | 3.76 | 2.60E-03 |
| Col9a3 (En) | Chondrocyte | -6.63 | 3.80 | 2.90E-02 |
| Comp | Chondrocyte | -5.86 | 1.54 | 7.51E-03 |
| Lect1 (lect1) | Chondrocyte | -7.37 | 1.34 | 2.35E-02 |
| Sox5 (en) | Chondrocyte | -2.88 | 4.43 | 6.06E-04 |
Tableau 1 : Expression différentielle des gènes connus dans divers types cellulaires d'os et de cartilage (os mandibulaire versus MC).
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Discussion
LCM permet l'isolement des populations cellulaires enrichies ou homogènes des tissus hétérogènes. Ses avantages incluent la capture rapide et précise des cellules dans leur contexte in vivo, tandis que les inconvénients potentiels incluent qu'il est long, coûteux, et limité par la nécessité pour l'utilisateur de reconnaître les sous-populations distinctes dans un échantillon spécifié30. Ce protocole fournit des détails de LCM du cartilage embryonnaire de souris et de l'os, soulignant l'utilisation de la coloration violette de cresyl dans une procédure rapide pour visualiser le cartilage et l'os pour la collecte précise de tissu tout en maintenant l'intégrité élevée d'ARN pour l'analyse suivante par L'ARN-seq. L'une des limites de ce protocole est que le système LCM utilisé ici n'est pas en mesure de couper directement sur les tissus minéralisés (p. ex., le tissu mandibulaire en noir à la figure 2C); par conséquent, toute la zone osseuse doit être disséquée. Notamment, les régions ossifiées microdisséisées isolées par l'AMT ne sont pas homogènes et comprennent au moins les sous-populations d'ostéoblastes, d'ostéocytes et d'ostéoclastes(tableau 1). Néanmoins, l'enrichissement par LCM est précieux car notre étude précédente a montré que les changements transcriptionnels dans des sous-populations spécifiques telles que les ostéoclastes dans le tissu osseux microdissé peuvent encore être détectés par L'ARN-seq6.
Pour l'analyse d'expression génique, nous avons optimisé la préparation de l'échantillon et la procédure LCM pour une qualité et un rendement élevés de l'ARN. Notre protocole commence avec des tissus congelés frais. Les sections fraîches congelées de tissu permettent l'excellente quantité et la qualité de l'ARN extrait3,car l'ARNm est sensible aux méthodes standard de fixation31. L'ARN est rapidement dégradé par la contamination par la RNase, et le maintien d'un environnement exempt de RNase tout au long de la préparation de l'échantillon, l'isolement de LCM, et d'ARN est essentiel pour l'application réussie. L'exposition à l'eau pendant le traitement de la section est préjudiciable à la qualité de l'ARN31,32. Notre protocole limite cette exposition, avec le plus haut niveau d'exposition aqueuse étant de 50% pendant la coloration violette cresyl. Nous avons testé qu'une coloration rapide (30 s) avec 0,1% de cresyl violet dans 50% d'éthanol donne une couleur distinctive au cartilage et ne diminue pas l'intégrité de l'ARN pour l'analyse en aval tels que l'ARN à faible entrée-seq (Figure 3C et Figure 4). Le rendement/zone (ng/mm2) est d'environ 20 ng/mm2 (figure 3F), similaire ou supérieur aux méthodes optimisées précédentes33. Selon les densités cellulaires dans MC et os mandibulaire6, nous estimons qu'avec ce protocole le rendement moyen d'une cellule est d'environ 5 pg d'ARN par cellule, et 1-5 ng d'ARN total peut être extrait de 200 à 1000 cellules, qui peuvent être utilisés pour l'ARN à faible entrée-seq6,7,33. Cette efficacité de rendement est beaucoup plus élevée que les méthodes LCM établies34, et aussi supérieure ou similaire aux protocoles optimisés récents33,35.
La capacité de distinguer différents types de cellules dans les sections histologiques est essentielle pour la collecte précise de tissus spécifiques d'intérêt. Cresyl violet est une tache hydrophile de base qui se lie aux acides nucléiques chargés négativement36. Cette propriété le rend utile pour la contre-staining avec la sélectivité de type cellulaire37,et c'est une tache histologique standard pour des neurones38. Cresyl violet a été utilisé en LCM pour une variété de tissus, fournissant une bonne morphologie des tissus et haute qualité d'ARN33,36,39,40. Comparé à d'autres méthodes de coloration, la coloration violette de cresyl fournit des détails cytoplasmiques et nucléaires, et un taux bas de dégradation d'ARN32. Nous démontrons ici que la coloration violette de cresyl est une méthode facile et rapide pour visualiser le cartilage et l'os et que le tissu souillé avec cette méthode conserve l'intégrité élevée d'ARN. Le traitement au xylène est couramment utilisé pour la déshydratation des tissus avant LCM35,36,41,42. Nous utilisons le xylène pour améliorer la visualisation de la morphologie tissulaire35 qui est essentielle pour distinguer les tissus ciblés, en particulier sur les glissières de membrane PEN qui ne sont pas aussi optiquement claires que les glissières en verre clair. Nous n'avons trouvé aucune occurrence significative de la perte de section des glissières de PEN pendant des étapes de coloration et de lavage, même avec l'agitation pour enlever OCT.
Microdroplet ou microfluidics à base d'ARN-seq à cellule unique (scRNA-seq) est une méthode à haut débit pour analyser les transcriptomes des tissus avec des types de cellules hétérogènes et a commencé à être utilisé dans la biologie squelettique43. Contrairement au LCM, le scRNA-seq implique la désagrégation enzymatique et/ou mécanique du tissu en cellules simples. La plupart des protocoles pour la préparation d'une seule cellule exigent que les tissus soient incubés à température ambiante ou à 37 oC pendant de longues périodes, ce qui modifie la transcriptome44,45. En outre, l'isolement des cellules simples dans le cartilage et l'os peut être physiquement limité par la complexité d'élément squelettique de la trabecularisation et de la minéralisation. Il est encore un défi technique d'isoler un nombre suffisant de cellules viables des tissus squelettiques qui sont exactement représentatifs de la diversité cellulaire des tissus in vivo, et la dissociation incomplète des cellules peut causer un biais dans la détection des types cellulaires43. Tandis que le scRNA-seq permet l'identification des types distincts de cellules, la profondeur de séquençage est basse, et les approches typiques de séquençage capturent 3' extrémités de transcription et ne permettent pas l'analyse alternative d'épissage. L'ARN-seq en vrac du tissu LCM-dérivé homogénéise des différences de cellules, mais permet la détection complète de transcription et l'analyse alternative d'épissage. LCM est donc particulièrement utile pour les tissus squelettiques qui ne sont pas facilement séparables des tissus environnants et complexes internes, et la préparation fraîche congelée du tissu peut préserver les profils transcriptionnels et l'intégrité de l'ARN pour l'analyse transcriptionnelle. Une autre faiblesse de scRNA-seq est qu'après la préparation de cellules simples, l'information spatiale des cellules est perdue. Une combinaison de LCM et de scRNA-seq a été développée pour permettre l'étude du transcriptome d'un petit échantillon à partir d'emplacements géographiques définis (Geo-seq)46, qui est une autre approche de l'utilisation de LCM pour étudier l'expression des gènes régionalisées.
En résumé, ce protocole fournit des détails de LCM optimisé du cartilage et de l'os, soulignant l'utilisation de la coloration violette de cresyl dans une procédure rapide pour visualiser le cartilage et l'os pour la collecte précise de tissu tout en maintenant l'intégrité élevée d'ARN pour l'analyse suivante par L'ARN-seq. Ce protocole a été utilisé avec succès pour le LCM du cartilage et de l'os à différents stades de développement pour l'analyse de l'expression génique6,7, et peut également être utilisé pour d'autres tissus.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) et l'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Les auteurs remercient le Biorepository and Pathology Core pour l'accès à la plate-forme Leica LMD 6500 à l'école de médecine Icahn à Mount Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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