Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60503

Summary

Dieses Protokoll beschreibt lasercapture microdissection for the isolation of knorpel and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Knorpel und Knochen können durch Kresylviolettfärbung schnell visualisiert und präzise gesammelt werden, um hochwertige RNA für die transkriptomische Analyse zu liefern.

Abstract

Laser capture microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um bestimmte Zelltypen oder Interessengebiete von heterogenen Geweben zu isolieren. Die zelluläre und molekulare Komplexität von Skelettelementen nimmt mit der Entwicklung zu. Gewebeheterogenität, wie z.B. an der Schnittstelle von knorpeligen und ossösen Elementen untereinander oder mit umgebenden Geweben, ist ein Hindernis für die Untersuchung der Entwicklung von Knorpel und Knochen. Unser Protokoll bietet eine schnelle Methode der Gewebeverarbeitung und Isolierung von Knorpel und Knochen, die eine qualitativ hochwertige RNA für die Genexpressionsanalyse liefert. Frische gefrorene Gewebe von Mausembryonen werden geschnitten und kurze kresylviolette Färbung wird verwendet, um Knorpel und Knochen mit Farben zu visualisieren, die sich von umgebenden Geweben unterscheiden. Die Rutschen werden dann schnell dehydriert, Knorpel und Knochen werden anschließend von LCM isoliert. Die Minimierung der Exposition gegenüber wässrigen Lösungen während dieses Prozesses bewahrt die RNA-Integrität. Maus Meckels Knorpel und Unterkieferknochen bei E16.5 wurden erfolgreich gesammelt und die Genexpressionsanalyse zeigte die differenzielle Expression von Markergenen für Osteoblasten, Osteozyten, Osteoklasten und Chondrozyten. Hochwertige RNA wurde auch aus einer Reihe von Geweben und embryonalen Zeitaltern isoliert. Dieses Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung für LCM, einschließlich Kryoembedding, Schnitt, Färbung und Dehydrierung von frischem gefrorenem Gewebe, und eine präzise Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM, was zu einer qualitativ hochwertigen RNA für die transkriptomische Analyse führt.

Introduction

Das Muskel-Skelett-System ist ein Mehrkomponentensystem, bestehend aus Muskel, Bindegewebe, Sehne, Band, Knorpel und Knochen, innerviert durch Nerven und durch Blutgefäße vaskularisiert1. Das Skelettgewebe entwickelt sich mit zunehmender zellulärer Heterogenität und struktureller Komplexität. Knorpel und Knochen entwickeln sich aus der gleichen Osteochondroprogenitor-Linie und sind stark verwandt. Embryonaler Knorpel und Knochen entwickeln sich in Verbindung mit Muskeln, Nerven, Blutgefäßen und undifferenziertem Mesenchym. Knorpel kann auch von Knochen umgeben sein, wie Meckels Knorpel und Kondylarknorpel innerhalb des Unterkieferknochens. Diese Gewebe sind anatomisch assoziiert und interagieren während der Entwicklung durch extrazelluläre Signale miteinander. Bei der Untersuchung der Genexpression bei der Entwicklung von Knorpel und Knochen ist ein Hindernis die Heterogenität von Skelettstrukturen, die aus mehreren Gewebetypen bestehen. Eine präzise Isolierung des spezifischen Gewebes von Interesse ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Transkriptionsanalyse.

Lasercapture Microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zelltypen oder Relevante Regionen innerhalb heterogener Gewebe zu isolieren, ist reproduzierbar und empfindlich gegenüber der Einzelzellebene2. Es kann Zellen von Interesse für eine breite Palette von nachgelagerten Assays in Transkriptomik, Genomik und Proteomik präzise zielen und erfassen3,4. Die Qualität der isolierten RNA, DNA oder Protein kann mit einem Bioanalysator oder einer gleichwertigen Plattform beurteilt werden. Beispielsweise wird die RNA-Qualität durch die RNA-Integritätsnummer (RIN)5angezeigt.

Hier bieten wir ein Protokoll zur schnellen Färbung und Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM aus frisch gefrorenem Gewebe. Wir verwenden den Mausembryon, um zu zeigen, dass dieses Protokoll qualitativ hochwertige RNA für nachfolgende transkriptomische Analysen liefert, wie z. B. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gewebe von Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gewonnen, und Studienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai genehmigt.

1. Zubereitung von Frischgefrorenen Exemplaren

  1. Sezieren Sie den Embryo oder das Gewebe von Interesse. Einbetten der Probe in eine Einweg-Einbettform mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Passen Sie die Ausrichtung der Probe mit einer Spitze oder Nadel an.
  2. Die Proben in einem Trockeneis/Methyl-2-Butanbad schnell einfrieren. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie ihn bei -80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Kryosektion für Laser Capture Microdissection

  1. Kryostat auftauen und Innenflächen mit 70% Ethanol reinigen. Behandeln Sie die Anti-Roll-Platte und ein Paar Zangen mit RNase-Dekontaminationsmittel. Stellen Sie den Kryostat auf die gewünschte Schnitttemperatur (-18 bis -22 °C) ein. Bereiten Sie einen Deckelbehälter mit Trockeneis vor und legen Sie eine Aluminiumfolie auf das Trockeneis, um die geschnittenen Probenschlitten während des Kryosektions vorübergehend zu lagern.
    ACHTUNG: Trockeneis ist extrem kalt. Behandeln Sie Trockeneis immer mit Sorgfalt und tragen Sie isolierte Handschuhe, wenn Sie damit umgehen.
  2. Das frisch gefrorene Exemplar in einen Eimer Trockeneis geben. Legen Sie eine Schicht OCT-Verbindung auf einen Kryostat-Probenhalter und legen Sie die Probe sofort mit sanftem Druck auf das OCT. Wenn OCT vollständig eingefroren ist, befestigen Sie den Halter mit der Probe in den Kryostat-Schneidarm.
  3. Lassen Sie die Probe 15 min im Kryostat, um sie der Schnitttemperatur gleichzusam zu machen.
  4. Schneiden Sie das Gewebe und sammeln Sie die Scheiben auf Polyethylennaphthalate (PEN) Membran gleitet mit einer Dicke von 12 m. Richten Sie aufeinander folgende Abschnitte auf der Membran aus. Lassen Sie nach Abschluss einer Rutsche die Abschnitte für einige Minuten trocknen und übertragen Sie die Rutsche auf die Folie im Trockeneisbehälter, bis alle erforderlichen Rutschen gesammelt sind.
  5. Bewahren Sie die Dias bei -80 °C in einer Schiebebox auf.
    HINWEIS: Abschnitt steile wird gewählt, um die Menge des gesammelten Gewebes zu maximieren, während effizientes Schneiden des Gewebes ermöglicht wird, und kann je nach Gewebe von Interesse variieren. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Halten Sie Dias frei von RNase-Kontamination. Vermeiden Sie Temperaturänderungen. Obwohl die RINs von RNA aus Dias, die bis zu 6 Monate lang gespeichert sind, immer noch auf eine hohe Qualität der RNA hinweisen können, empfehlen wir, Dias so schnell wie möglich zu verwenden.

3. Probenvorbereitung für Laser Capture Microdissection

  1. Bereiten Sie Lösungen für Färbung und Austrocknung vor.
    1. 45 ml 80% Ethanol in jeweils drei 50 ml Zentrifugenrohre auf Eis legen. Beschriften Sie sie als #1, #2 und #3. Ethanol mit RNase/DNase freiem Wasser verdünnen.
    2. 45 ml 95% Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenrohr auf Eis legen.
    3. 45 ml 100% Ethanol in einem 50 ml Zentrifugenrohr auf Eis legen.
    4. 45 ml Xylol in ein 50 ml Zentrifugenrohr bei Raumtemperatur geben.
      ACHTUNG: Xylol sollte in einer Dunstabzugshaube verwendet werden.
  2. Eine PEN-Membran kurz auftauen, indem Sie sie gegen eine handgeliebte Hand legen, dann zweimal für 30 s in 45 ml 80% Ethanol (#1 und #2) mit Rührung in 50 ml Zentrifugenrohren waschen, um das OCT zu entfernen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, OCT vor der Färbung zu entfernen, um zu verhindern, dass OCT während der Färbung die Abschnitte verdunkelt. Zangen können verwendet werden, um die Entfernung von OCT zu erleichtern, die nicht durch Agitation abgewaschen wird.
  3. Schieben Sie den Schlitten auf ein Blatt Aluminiumfolie. Pipette 0,8 ml 0,1% Kresylviolett in 50% Ethanol auf den Schlitten und Fleck für 30 s. Waschen Sie das Dia in 45 ml 80% Ethanol (#3) für 30 s, und dehydrieren Sie dann durch Durchgang für je 30 s durch 45 ml 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol in 50 ml Zentrifugenröhren.
  4. Stand gleitet auf einem empfindlichen Aufgabenwischer für 5 min, um Xylol und trockene Abschnitte abtropfen zu lassen.
    HINWEIS: Die Dias müssen vor LCM vollständig getrocknet werden.

4. Laser Capture Mikrodissektion

HINWEIS: Tragen Sie bei der Ausführung von LCM pulverfreie Nitrilhandschuhe.

  1. Schalten Sie das LCM-Mikroskop, den Laser und den Computer ein. Melden Sie sich am Computer an und starten Sie die Software. Drehen Sie den Schlüssel in die Position "Ein", um den Laser zu starten. Wenn das grüne Licht (Laser) eingeschaltet ist, drücken Sie die rote Taste, um den Laser zu aktivieren, und dann wird das Licht (Laser) rot, was darauf hinweist, dass der Laser einsatzbereit ist.
    HINWEIS: Der Laser benötigt ca. 10 min zum Aufwärmen.
  2. Richten Sie die Sammelrohre ein.
    1. Setzen Sie die Kappe eines 0,5 ml Polymerase-Kettenreaktionsrohrs (PCR) in den Kollektor ein.
      HINWEIS: Wählen Sie den passenden Kollektor für die gewünschten PCR-Röhren (0,2 oder 0,5 ml).
    2. Pipette 50 l Extraktionspuffer (bereitgestellt durch RNA-Isolationskit in der Tabelle der Materialien) in die Kappe des 0,5 ml Sammelrohrs.
    3. Legen Sie das Sammelgerät in das Mikroskop ein.
    4. Klicken Sie im Fenster "Collector Device ändern" auf die Schaltfläche Zum Referenzpunkt verschieben, um den Kollektor zum Referenzpunkt (RP) zu verschieben. Passen Sie den Fokus an, um das RP klar anzuzeigen. Klicken Sie auf die Pfeile, um die RP in die Mitte der Ansicht zu verschieben.
  3. Laden Sie Probenschlitten.
    1. Klicken Sie auf die linke Schaltfläche Entladen in der Symbolleiste, um den Folienhalter zu senken.
    2. Legen Sie die Rutsche in den Halter, wobei der Gewebeabschnitt nach unten zeigt.
      HINWEIS: Diese Ausrichtung stellt sicher, dass die erfassten Gewebeabschnitte durch die Schwerkraft in die Kappe des Sammelrohrs fallen.
    3. Setzen Sie den Halter wieder in die Bühne ein.
  4. Richten Sie die Laserparameter ein.
    1. Wählen Sie die Steuerungsoption des Lasermenüs aus oder klicken Sie auf das Lasersymbol.
    2. Passen Sie diese Parameter wie gewünscht an: Leistung, die Leistung des Lasers; Blende, die Breite des Lasers; und Geschwindigkeit, die Geschwindigkeit des Schneidens im Draw- und Cut-Modus.
      HINWEIS: Testen Sie den Laser in einem Bereich aus Interesse. Höhere Leistung oder größere Blende erleichtert das Schneiden, verursacht aber mehr Schäden an den Zellen. Passen Sie die Kombination aus Leistung, Blende und Geschwindigkeit an, um ein effizientes Schneiden und minimale Schäden am Gewebe zu erzielen. Zum Beispiel Power = 40, Aperture = 5 und Speed = 7 für Knorpelgewebe auf einem 12-mm-Abschnitt.
  5. Wählen und schneiden Sie Interessenbereiche aus.
    1. Beginnen Sie mit 5x Objektiv und finden Sie die Interessengebiete, und wechseln Sie dann zum Ziel (5x, 10x oder 40x), das den Interessenbereich am besten anzeigt.
      HINWEIS: Nach der Kresylviolettfärbung sind Knorpel magenta gefärbt und mineralisierte Gewebe erscheinen braun oder schwarz, von anderen Geweben zu unterscheiden. Bilder können mit Bild speichern als aus dem Menü Datei gespeichert werden.
    2. Wählen Sie die Röhre für die Sammlung (A, B, C, D), indem Sie auf die Markierung am Kollektor klicken.
    3. Wählen Sie Verschieben und Schneiden oder Zeichnen und Schneiden. Im Bewegungs- und Schnittmodus wird die Probe manuell geschnitten, indem die Maus oder der Touchscreen-Stift verwendet wird, um Formen freihändig zu zeichnen. Im Draw- und Cut-Modus können Formen freihändig mit der Maus oder dem Touchscreen-Stift für das nachfolgende Schneiden gezeichnet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnitt starten", um das Laserschneiden zu initiieren.
    4. Sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Zielgewebe mit PEN-Membran durch Schwerkraft in die Kappe des Sammelrohrs. Wiederholen Sie 4.5, um bei Bedarf mehrere Interessenbereiche zu bündeln.
      HINWEIS: Wiederholte Schnitte oder eine Erhöhung der Kraft oder Blende können erforderlich sein, wenn das Gewebe nicht in die Kappe des Sammelrohrs aufgrund unvollständigen Schneidens fällt. Mineralisierte Knochen (braun oder schwarz) können nicht direkt per Laser geschnitten werden.
  6. Entladen Sie den Kollektor und schließen Sie das PCR-Rohr vorsichtig. Legen Sie das mikrosezierte Gewebe in Trockeneis. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie ihn bei -80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wiederholen Sie 4.2 bis 4.6 für die nächste Probe.

5. Lyse von mikrosezierten Geweben und RNA-Isolation

  1. Das mikrosezierte Gewebe bei Raumtemperatur auftauen. Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie die Proben für 30 min bei 42 °C.
  2. Nach der Inkubation drehen Sie den Lysepuffer in das 0,5 ml PCR-Rohr. Führen Sie die DNase-Behandlung und die RNA-Extraktion mit einem RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle) nach den Anweisungen des Herstellers durch.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Koronale Abschnitte von frisch gefrorenem Mausgewebe bei E16.5 wurden verwendet, um die Isolierung und Sammlung von Meckels Knorpel (MC), Kondylarknorpel und Unterkieferknochen durch LCM zu demonstrieren. Mausembryonen bei E16.5 wurden seziert und in kryogene Formen mit OCT-Verbindung eingebettet. Proben in Formen wurden schnell in einem Trockeneis- und Methyl-2-Butanbad eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Um die kresylviolette Färbung von Knorpel und Knochen zu demonstrieren, wurde eine Kryosektion in der koronalen Ebene durchgeführt und Proben auf Mikroskopdias gesammelt. Die Abschnitte wurden nach dem obigen Protokoll gewaschen, gebeizt und dehydriert (Schritt 3.2–3.4). Die Rutschen wurden luftgetrocknet und mit permanentem Montagemedium montiert. Alle untersuchten Knorpel waren gefärbtes Magenta (MC, Kondylarknorpel, Nasenseptumknorpel, Kostenknorpel, Knorpelprimordium des Präsphenoidknochens, Knorpelprimordien des Radius und ulna) und alle mineralisierten Gewebe waren braun oder schwarz gebeizt(Abbildung 1A-E). Knorpel und Knochen wurden leicht von anderen Geweben an mehreren anatomischen Stellen unterschieden.

Bei LCM wurden die Köpfe von Embryonen bei E16.5 in der koronalen Ebene auf PEN-Membranschlitten mit einer Dicke von 12 m geschnitten und 6–8 aufeinander folgende Abschnitte pro Dia gesammelt und bei -80 °C gelagert. OCT wurde entfernt und Abschnitte wurden nach dem oben beschriebenen Protokoll (Schritt 3.2–3.4) mit Kresylviolett gefärbt und dehydriert. MC, Kondylarknorpel und die Unterkieferknochenbereiche wurden von LCM ausgewählt und isoliert (Abbildung 2). Die ausgewählten Bereiche, die in den Lysepuffer in der Kappe des Sammelrohrs abgelegt wurden. Um genügend RNA für die Sequenzierung zu erhalten, haben wir 10 Regionen MC, 10 Regionen kondylaren Knorpel oder 4 Regionen unterkieferförmiger Knochen in jedes Sammelrohr als eine Probe gepoolt.

Die RNA wurde mit einem RNA-Isolationskit nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die gesamte RNA wurde mit einem Bioanalyzer analysiert (Abbildung 3A–B). Um die Wirkung von Kresylviolettfärbung auf die Qualität der RNA zu testen, verglichen wir RNA mit unterdubulären Knochenproben, die mit Kresylviolett und Proben ohne Färbung gefärbt sind (mineralisiertes Gewebe ist ohne Färbung sichtbar, aber Cresylviolettfärbung verbessert die Sichtbarkeit, um Knochen von umgebenden Geweben zu unterscheiden). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der RNA-Integrität zwischen gefärbten Proben (n = 4) und Proben ohne Färbung (n = 4) beobachtet, was darauf hindeutet, dass die schnelle kresylviolette Färbung in diesem Protokoll einen unbedeutenden Effekt auf die RNA-Qualität hat (P = 0,858, zweischwanzigen Welch-T-Test, Abbildung 3C). Wir verwendeten unser Protokoll für LCM verschiedener Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien und RINs wurden gemessen, was auf eine hohe RNA-Qualität hindeutet (Abbildung 3D). Die durchschnittlichen Erträge von RNA aus MC, Kondylarknorpel und Unterkieferknochen betrugen 7,50 x 1,45 ng, 12,55 x 2,75 ng und 33,02 x 7,63 ng (Abbildung 3E) und der Ertrag/die Fläche betrug 19,73 x 3,82 ng/mm2, 26,70 x 5,84 ng/mm2und 17,23 x 3,98 ng/mm2, bzw. (Abbildung 3F), ohne signifikanten Unterschied zwischen Geweben (MC versus Kondylarlarkarpel, P = 0,383; Kondylarknorpel versus Unterkieferknochen, P = 0,260; MC versus Unterkieferknochen, P = 0,674).

Bibliotheken wurden wie zuvor beschrieben vorbereitet und sequenziert6,7. Eine repräsentative cDNA-Größe betrug etwa 500 bp (Abbildung 4A). DIE RNA-seq-Daten wurden mit MultiQC8analysiert. Wir analysierten RNA-seq-Daten aus 18 LCM-Proben (MC1-6, Meckel-Knorpel; C1-6, Kondylarknorpel; M1-6, Unterkieferknochen). Die mittleren Qualitätswerte für jede Basisposition in den Lesevorgängen wurden von FastQC generiert, was auf sehr gute Anrufe von hoher Qualität hinweist (Abbildung 4B). Die Leseausrichtung wurde mit Picard analysiert (Abbildung 4C). Die Lesevorgänge zeigten hoch ausgerichtete Prozentsätze und der durchschnittliche Prozentsatz der ausgerichteten Lesevorgänge lag bei 75 %. Die Genabdeckung wurde mit Picard analysiert (Abbildung 4D), was auf eine gute Darstellung entlang der Transkription von den 5' bis zum 3' Ende hindeutete.

Die Differentialgenexpressionsanalyse wurdedurchgeführt 6,7. Es gab 4.006 Gene, die signifikant differenziert (P < 0,05) zwischen dem Unterkieferknochen und MC(Abbildung 5A) exprimiert wurden. Gene spezifisch für Osteoblasten oder Osteozyten (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715und Sparc16) waren im Unterkieferknochen stärker exprimiert als MC, während chondrocyte-spezifische Gene (Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123und Sox524) waren in MC stärker exprimiert als der Unterkieferknochen ( Abbildung5B und Tabelle 1). Darüber hinaus wurden Osteoklastmarker wie Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328und Oscar29 auch als stärker im Unterkieferknochen exprimiert identifiziert als MC ( Abbildung5B und Tabelle 1), was auf eine erfolgreiche Isolierung von Zielgeweben hindeutet.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative kresylviolette Färbung von Knorpel und Knochen in koronalen Abschnitten des Mausembryons bei E16.5. (A) Meckels Knorpel und hemimandbar. (B) Meckelknorpel, Kondylarknorpel und hemimandbar. (C) Nasenseptum und Maxillae. (D) Knorpelprimordium aus präsphenoiden Knochen und Palatinknochen. (E) Knorpel primordium Radius, Knorpel primordium von Ulna und Costalknorpel. C = Kondylarknorpel; CC = Costalknorpel; CP = Knorpelprimordium des präsphenoiden Knochens; M = hemimandbar; MC = Meckels Knorpel; MX = maxilla; NS = Nasenseptum; PL = Palatinknochen; R = Knorpel primordium des Radius; U = Knorpel primordium von ulna. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Regionen, die durch LCM isoliert und für RNA-seq gesammelt werden. (A–C) Repräsentativ gebeizt MC (A), Kondylar Knorpel (B), und hemimandbar mit MC bereits isoliert (C) in Kryosektion vor LCM. (D–F) Die Regionen in A, B und C nach gezielten Geweben wurden durch LCM isoliert. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: RNA-Qualität und -Menge der LCM-Proben. (A–B) Repräsentatives Elektropherogramm (A) und das zugehörige Gelbild (B) aus einem Bioanalysator für eine Unterkieferknochenprobe. (C) RINs der gesamten RNA aus unterdubulären Knochenproben, die mit Kresylviolett (n = 4) oder ohne Färbung (n = 4) gefärbt sind. (D) RINs der gesamten RNA aus verschiedenen Geweben, die durch LCM isoliert wurden. Meckelknorpel bei E16.5 (n = 6); Kondylarknorpel bei E16.5 (n = 6); Manibulärer Knochen bei E16.5 (n = 6); Nasenseptumknorpel bei E14.5 (n = 6); Gehirn bei E14.5 (n = 6); Gehirn bei E16.5 (n = 7); Gehirn bei E18.5 (n = 4). (E) Ertrag der gesamten RNA aus drei Geweben. Jede MC- oder Kondylarknorpelprobe war ein Pool von 10 mikrosezierten Knorpelregionen und jede Probe von Unterkieferknochen war ein Pool von 4 mikrosezierten Regionen mit Hämimandbarem. (F) Die Ausbeute pro Flächeneinheit (ng/mm2) in jedem Gewebe. Die Daten sind im Mittelwert s.e.m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die Qualität der Bibliotheken und RNA-Seq-Daten, die aus LCM-Proben generiert werden. (A) Repräsentative cDNA-Größen einer Bibliothek aus einer unterdubulären Knochenprobe, die durch einen Bioanalysator bestimmt wird. (B-D) Qualitätskontrolle von RNA-seq aus 18 LCM-Proben (MC1-6, Meckel-Knorpel; C1-6, Kondylarknorpel; M1-6, Unterkieferknochen) von MultiQC. (B) Die mittleren Qualitätswerte für jede Basisposition in den Lesevorgängen wurden von FastQC generiert. Der Hintergrund des Diagramms unterteilt die y-Achse in Anrufe von sehr guter Qualität (grün), Anrufe von angemessener Qualität (orange) und Anrufe von schlechter Qualität (rot). (C) Die Ausrichtung der Lesevorgänge wurde von Picard analysiert. Die Zusammenfassung wird als Prozentsatz ausgerichteter Lesevorgänge angezeigt. (D) Normalisierte Genabdeckung mit Picard analysiert. Das Diagramm gibt die relative durchschnittliche Abdeckung entlang des Transkripts von 5' Ende (links) bis 3' Ende (rechts) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Differentialexpressionsanalyse von RNA-Seq-Daten aus Unterkieferknochen und MC, die durch LCM isoliert sind. (A) Hierarchische Clusterbildung von 4.006 Genen signifikant differenziell exprimiert (P < 0,05) zwischen dem Unterkieferknochen und MC. Für jedes Gewebe wurden drei biologische Repliken verwendet. M1-3, Unterkieferknochen; MC1-3, MC. (B) Vulkandiagramm mit Faltenwechseln und P-Werten von differenziell exprimierten Genen zwischen Unterkieferknochen und MC. Beispiele für stark differenziell exprimierte zellspezifische Gene werden gezeigt: Osteoblasten- und Osteozytenmarker in blau, Osteoklastmarker in Grün und Chondrozytenmarker in Rot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gen Zelltyp log2FoldChange Durchschnittlicher Ausdruck Angepasster P-Wert
Col1a1 Osteoblast/Osteozyten 2.64 12.94 2.22E-05
Col1a2 Osteoblast/Osteozyten 3.41 12.87 8.27E-07
Dkk1 Osteoblast/Osteozyten 7.59 2.01 5.21E-03
Dmp1 Osteoblast/Osteozyten 9.73 3.42 3.19E-04
Dstn Osteoblast/Osteozyten 2.51 6.87 5.73E-07
Runx2 Osteoblast/Osteozyten 1.24 8.62 4.08E-02
Sp7 Osteoblast/Osteozyten 2.24 6.95 5.81E-03
Sparc Osteoblast/Osteozyten 3.40 12.26 5.56E-09
Acp5 Osteoklast 3.38 5.74 6.46E-06
Csf1r Osteoklast 2.01 5.80 1.17E-04
Ctsk Osteoklast 3.19 7.56 5.73E-07
Itgb3 Osteoklast 2.88 5.37 2.43E-04
Oscar Osteoklast 3.41 2.67 1.63E-04
Acan Chondrozyte -5.23 5.01 2.76E-04
Col2a1 Chondrozyte -3.61 9.47 3.29E-03
Col9a1 Chondrozyte -7.01 3.58 5.51E-03
Col9a2 Chondrozyte -5.40 3.76 2.60E-03
Col9a3 Chondrozyte -6.63 3.80 2.90E-02
Comp Chondrozyte -5.86 1.54 7.51E-03
Lect1 Chondrozyte -7.37 1.34 2.35E-02
Sox5 Chondrozyte -2.88 4.43 6.06E-04

Tabelle 1: Differentialexpression bekannter Gene in verschiedenen Zelltypen von Knochen und Knorpel (Mandibularknochen versus MC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LCM ermöglicht die Isolierung angereicherter oder homogener Zellpopulationen aus heterogenen Geweben. Zu seinen Vorteilen gehört die schnelle und präzise Erfassung von Zellen in ihrem In-vivo-Kontext, während mögliche Nachteile darin bestehen, dass sie zeitaufwändig, teuer und durch die Notwendigkeit begrenzt ist, dass der Benutzer unterschiedliche Subpopulationen innerhalb einer bestimmten Stichprobe30erkennt. Dieses Protokoll enthält Details zu LCM von embryonalem Knorpel und Knochen der Maus und hebt die Verwendung von kresylvioletten Färbungen in einem schnellen Verfahren hervor, um Knorpel und Knochen für eine präzise Gewebesammlung zu visualisieren und gleichzeitig eine hohe RNA-Integrität für die nachfolgende Analyse durch RNA-seq zu erhalten. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass das hier verwendete LCM-System nicht in der Lage ist, mineralisierte Gewebe direkt zu schneiden (z. B. das Unterkiefergewebe in Schwarz in Abbildung 2C); Daher muss der gesamte Knochenbereich seziert werden. Insbesondere sind die mikrosezierten verknözten Regionen, die durch LCM isoliert werden, nicht homogen und umfassen zumindest die Subpopulationen von Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten (Tabelle 1). Dennoch ist die Anreicherung durch LCM wertvoll, da unsere vorherige Studie gezeigt hat, dass transkriptionelle Veränderungen in bestimmten Subpopulationen wie Osteoklasten im mikrosezierten Knochengewebe immer noch durch RNA-seq6nachgewiesen werden können.

Für die Genexpressionsanalyse haben wir die Probenvorbereitung und das LCM-Verfahren für hohe RNA-Qualität und -Ausbeute optimiert. Unser Protokoll beginnt mit frisch gefrorenem Gewebe. Frische gefrorene Gewebeabschnitte ermöglichen eine ausgezeichnete Quantität und Qualität der extrahierten RNA3, da mRNA empfindlich auf Standardmethoden der Fixierung31reagiert. RNA wird durch RNase-Kontamination schnell abgebaut, und die Aufrechterhaltung einer RNase-freien Umgebung während der Probenvorbereitung, LCM- und RNA-Isolation ist entscheidend für eine erfolgreiche Anwendung. Die Exposition gegenüber Wasser während der Schnittbearbeitung ist schädlich für die RNA-Qualität31,32. Unser Protokoll begrenzt eine solche Exposition, wobei die höchste wässrige Exposition bei der Cresylviolettfärbung 50 % beträgt. Wir haben getestet, dass eine schnelle Färbung (30 s) mit 0,1% Kresylviolett in 50% Ethanol eine unterscheidbare Farbe für Knorpel gibt und die RNA-Integrität für nachgeschaltete Analysen wie z.B. RNA-seq mit niedrigem Input nicht senkt (Abbildung 3C und Abbildung 4). Die Ausbeute/Fläche (ng/mm2) beträgt ca. 20 ng/mm2 (Abbildung 3F), ähnlich oder höher als die bisherigen optimierten Methoden33. Nach den Zelldichten in MC und Unterkieferknochen6schätzen wir, dass mit diesem Protokoll die durchschnittliche Ausbeute einer Zelle etwa 5 pg RNA pro Zelle beträgt und 1–5 ng der gesamten RNA aus 200–1.000 Zellen extrahiert werden können, die für RNA-Seq6,7,33. Diese Ausbeute ist viel höher als die etablierten LCM-Methoden34, und auch überlegen oder ähnlich zu den jüngsten optimierten Protokollen33,35.

Die Fähigkeit, verschiedene Zelltypen in histologischen Abschnitten zu unterscheiden, ist für die präzise Sammlung bestimmter Gewebe von Interesse unerlässlich. Cresylviolett ist ein hydrophiler, grundlegender Fleck, der an negativ geladene Nukleinsäurenbindet 36. Diese Eigenschaft macht es nützlich für die Gegenfärbung mit Zelltyp Selektivität37, und es ist ein Standard histologische Fleck für Neuronen38. Cresylviolett wurde in LCM für eine Vielzahl von Geweben verwendet, bietet gute Gewebemorphologie und hohe RNA-Qualität33,36,39,40. Im Vergleich zu anderen Färbemethoden liefert die kresylviolette Färbung zytoplasmatische und nukleare Details und eine niedrige RNA-Abbaurate32. Wir zeigen hier, dass Kresylviolettfärbung eine einfache und schnelle Methode zur Visualisierung von Knorpel und Knochen ist und dass gewebegefärbt mit dieser Methode eine hohe RNA-Integrität bewahrt. Xylol-Behandlung wird häufig für die Dehydrierung des Gewebes vor LCM35,36,41,42verwendet. Wir verwenden Xylol, um die Visualisierung der Gewebemorphologie35 zu verbessern, die für die Unterscheidung von gezielten Geweben unerlässlich ist, insbesondere auf PEN-Membrandias, die nicht so optisch klar sind wie klar wie Klarglasglyse. Wir fanden kein signifikantes Auftreten von Abschnittsverlust von PEN-Dias während Färbung und Waschschritte, auch mit Rührung, um OCT zu entfernen.

Microdroplet oder Mikrofluidics-basierte einzellige RNA-seq (scRNA-seq) ist eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse von Transkriptotomen von Geweben mit heterogenen Zelltypen und hat begonnen, in der Skelettbiologie verwendet zu werden43. Im Gegensatz zu LCM beinhaltet scRNA-seq eine enzymatische und/oder mechanische Disaggregation von Gewebe in einzelne Zellen. Die meisten Protokolle für die Einzelzellpräparation erfordern, dass Gewebe bei Raumtemperatur oder 37 °C für längere Zeiträume inkubiert werden, was das Transkriptom44,45verändert. Darüber hinaus kann die Isolierung einzelner Zellen in Knorpel und Knochen durch die Komplexität des Skelettelements der Trabekulularisierung und Mineralisierung physisch eingeschränkt werden. Es ist immer noch eine technische Herausforderung, eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Zellen aus Skelettgeweben zu isolieren, die genau repräsentativ für die zelluläre Vielfalt von Geweben in vivosind, und eine unvollständige Dissoziation der Zellen kann zu Verzerrungen beim Nachweis von Zelltypenführen 43. Während scRNA-seq die Identifizierung unterschiedlicher Zelltypen ermöglicht, ist die Sequenzierungstiefe gering, und typische Sequenzierungsansätze erfassen 3' Transkriptenden und erlauben keine alternative Spleißanalyse. Bulk-RNA-seq aus LCM-abgeleitetem Gewebe homogenisiert Zellunterschiede, ermöglicht aber eine umfassende Transkriptionerkennung und alternative Spleißanalyse. LCM ist daher besonders nützlich für Skelettgewebe, die nicht leicht von umgebenden Geweben und intern komplex zu separierbar sind, und frische gefrorene Vorbereitung des Gewebes kann sowohl Transkriptionsprofile als auch RNA-Integrität für die Transkriptionsanalyse bewahren. Eine weitere Schwäche von scRNA-seq ist, dass nach der Einzelzellpräparation die räumliche Information der Zellen verloren geht. Eine Kombination aus LCM und scRNA-seq wurde entwickelt, um die Untersuchung des Transkriptoms einer kleinen Probe von definierten geografischen Standorten (Geo-seq)46zu ermöglichen, was ein weiterer Ansatz zur Verwendung von LCM zur Untersuchung der regionalisierten Genexpression ist.

Zusammenfassend enthält dieses Protokoll Details zu optimiertem LCM von Knorpel und Knochen, wobei die Verwendung von Kresylviolettfärbung in einem schnellen Verfahren zur Visualisierung von Knorpel und Knochen für eine präzise Gewebesammlung hervorgehoben wird, während eine hohe RNA-Integrität für die nachfolgende Analyse durch RNA-seq erhalten bleibt. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für LCM von Knorpel und Knochen in verschiedenen Entwicklungsstadien für die Genexpressionsanalyse6,7, verwendet und kann auch für andere Gewebe verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233) unterstützt. Die Autoren danken dem Biorepository und Pathologie-Kern für den Zugang zur Leica LMD 6500 Plattform an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 154 Lasercapture Mikrodissektion Meckel-Knorpel Unterkieferknochen Kresylviolett RNA-Isolation RNA-Sequenzierung
Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H.,More

Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter