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Developmental Biology

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60503

Summary

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

Abstract

레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이질적인 조직에서 특정 세포 모형 또는 관심 있는 지구를 격리하는 강력한 공구입니다. 골격 원소의 세포 및 분자 복잡성은 발달과 함께 증가합니다. 조직 이질성, 같은 서로 또는 주변 조직과 연골 및 골변 요소의 계면에서, 연골과 뼈를 개발하는 연구에 하나의 장애물이다. 당사의 프로토콜은 유전자 발현 분석을 위해 고품질 RNA를 산출하는 연골과 뼈의 조직 처리 및 격리의 신속한 방법을 제공합니다. 마우스 배아의 신선한 냉동 조직은 단면화되고 짧은 크레실 바이올렛 염색은 주변 조직과 구별되는 색상으로 연골과 뼈를 시각화하는 데 사용됩니다. 슬라이드는 다음 빠르게 탈수, 연골과 뼈는 LCM에 의해 이후에 격리. 이 프로세스 동안 수성 솔루션에 대한 노출을 최소화하면 RNA 무결성이 유지됩니다. 마우스 메켈의 연골과 E16.5에서 하악골이 성공적으로 수집되었고 유전자 발현 분석은 조골세포, 골세포, 골세포 및 연골세포에 대한 마커 유전자의 차등 발현을 보여주었다. 고품질 RNA는 또한 다양한 조직 및 배아 시대로부터 분리되었다. 이 프로토콜은 냉동, 절제, 염색 및 탈수를 포함한 LCM에 대한 샘플 준비를 자세히 설명하며, LCM에 의한 연골과 뼈의 정밀한 분리는 전사분석을 위한 고품질 RNA를 생성합니다.

Introduction

근골격계는 근육, 결합 조직, 힘줄, 인대, 연골 및 뼈로 구성된 다성분 시스템으로, 신경에 의해 심이도가 있고혈관에의해 혈관이 혈관에 의해 1. 골격 조직은 증가 세포 이질성 및 구조적 복잡성으로 개발. 연골과 뼈는 동일한 골연방울 감소기 계보에서 개발하고 매우 관련이 있습니다. 배아 연골과 뼈는 근육, 신경, 혈관 및 미분화 중간엽과 관련하여 발생합니다. 연골은 또한 뼈에 의해 포위 될 수있다, 이러한 Meckel의 연골과 하악골 내의 condylar 연골 등. 이 조직은 해부학적으로 연관되고 발달 도중 세포외 신호를 통해 서로 상호 작용합니다. 연골과 뼈의 발달에 있는 유전자 발현의 연구 결과에서, 1개의 장애물은 다중 조직 모형으로 구성된 골격 구조물의 이질성입니다. 관심 있는 특정 조직의 정밀한 분리는 성공적인 전사 분석을 위한 열쇠입니다.

레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이기종 조직 내의 세포 유형 또는 관심 영역을 분리하는 강력한 도구이며 재현 가능하며 단일 세포 수준2에민감합니다. 전사학, 유전체학 및 프로테오믹스3,4에서광범위한 하류 검소에 대한 관심 있는 세포를 정밀하게 표적화하고 포획할 수 있다. 단리된 RNA, DNA, 또는 단백질의 질은 바이오분석기 또는 동등한 플랫폼으로 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA 품질은 RNA 무결성 번호(RIN)5로표시됩니다.

여기에서, 우리는 신선한 냉동 조직에서 LCM에 의한 연골과 뼈의 신속한 염색 및 격리를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 배아를 사용하여 이 프로토콜이 RNA 시퀀싱(RNA-seq)과 같은 후속 전사분석을 위해 고품질 RNA를 산출한다는 것을 입증합니다.

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Protocol

마우스에서 조직은 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회에 따라 장악되고, 연구 프로토콜은 마운트 시나이에 있는 Icahn 의과 대학에 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 신선한 냉동 표본의 준비

  1. 관심 있는 배아 또는 조직을 해부합니다. 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 일회용 임베딩 금형에 시료를 내장합니다. 팁이나 바늘로 시편의 방향을 조정합니다.
  2. 드라이 아이스/메틸-2-부탄 욕조에서 시료를 빠르게 동결시되십시오. 다음 단계로 계속 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 레이저 캡처 미세 해부를위한 냉동 절제

  1. 저온 유지를 해동하고 70 % 에탄올로 내부 표면을 청소하십시오. 롤 방지 플레이트와 한 쌍의 집게를 RNase 오염 제거제로 처리하십시오. 저온 온도를 원하는 절삭 온도(-18 ~ -22°C)로 설정합니다. 냉동 절제 중에 단면 된 샘플 슬라이드를 임시 보관하기 위해 드라이 아이스에 알루미늄 호일 시트를 놓고 건조 얼음으로 뚜껑이 달린 용기를 준비하십시오.
    주의 사항: 드라이 아이스는 매우 춥습니다. 항상 드라이 아이스를 조심스럽게 다루고 취급할 때마다 절연 장갑을 착용하십시오.
  2. 신선한 냉동 시편을 드라이 아이스 양동이로 옮김으로 옮김. OCT 화합물층을 저온저온시편 홀더에 놓고 즉시 부드러운 압력으로 OCT 위에 시편을 놓습니다. OCT가 완전히 동결되면 시편이 있는 홀더를 저온 극저온 절단 암에 고정합니다.
  3. 시료를 저온온도에 평형화하기 위해 15분 동안 저온상승에 둡니다.
  4. 조직을 단면화하고 12 μm의 두께로 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 멤브레인 슬라이드에 슬라이스를 수집한다. 멤브레인에 연속된 섹션을 정렬합니다. 한 번의 슬라이드가 완료되면, 섹션이 몇 분 동안 건조하고 필요한 모든 슬라이드가 수집 될 때까지 드라이 아이스 용기의 호일에 슬라이드를 전송할 수 있습니다.
  5. 슬라이드를 슬라이드 상자에 -80°C로 보관합니다.
    참고: 단면 두께는 조직의 효율적인 절단을 허용하면서 수집 된 조직의 양을 최대화하기 위해 선택되며, 관심있는 조직에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드를 RNase 오염으로부터 제거하십시오. 온도 변화를 피하십시오. 최대 6개월 동안 저장된 슬라이드의 RNA RIN은 여전히 RNA의 높은 품질을 나타낼 수 있지만 가능한 한 빨리 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다.

3. 레이저 포획 미세 해부를 위한 샘플 준비

  1. 염색 및 탈수에 대한 해결책을 준비하십시오.
    1. 얼음 위에 50 mL 원심 분리튜브 3개각각에 80% 에탄올 45 mL를 놓습니다. #1, #2 및 #3 레이블을 지정합니다. RNase/DNase 자유물로 에탄올을 희석합니다.
    2. 얼음 위에 50 mL 원심 분리튜브에 95% 에탄올 45 mL를 놓습니다.
    3. 얼음 위에 50 mL 원심 분리튜브에 100% 에탄올 45 mL를 놓습니다.
    4. 실온에서 50 mL 원심 분리튜브에 자일렌 45 mL을 놓습니다.
      주의 사항: 자일렌은 연기 후드에 사용해야합니다.
  2. PEN 멤브레인 슬라이드를 장갑을 낀 손에 대고 잠시 해동한 다음, 50 mL 원심분리기 튜브에서 교반하여 80% 에탄올(#1 및 #2)의 45 mL에서 각각 30s씩 2회 세척하여 OCT를 제거합니다.
    참고: 염색 하기 전에 OCT를 제거 하는 것이 중요 하다, 섹션을 가리는 에서 염색 하는 동안 OCT 느슨한 방지. 집게는 교반에 의해 세척되지 않는 OCT의 제거를 용이하게하기 위해 사용될 수있다.
  3. 알루미늄 호일 한 장에 슬라이드를 놓습니다. 피펫 0.8 mL 0.8% 크레실 바이올50% 크레실 바이올을 슬라이드 상에 30초 동안 45 mL의 80% 에탄올(#3)으로 세척한 다음, 각각 30s에서 45mL의 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자실백에 대해 45mL로 탈수시한다.
  4. 자일렌과 건조한 부분을 배출하기 위해 5 분 동안 섬세한 작업 와이퍼에 슬라이드를 서십시오.
    참고: 슬라이드는 LCM 전에 완전히 건조되어야 합니다.

4. 레이저 캡처 미세 해부

참고: LCM을 수행하는 동안 분말 프리 니트릴 장갑을 착용하십시오.

  1. LCM 현미경, 레이저 및 컴퓨터를 켭니다. 컴퓨터에 로그온하고 소프트웨어를 시작합니다. 키를 "켜기" 위치로 돌려 레이저를 시동합니다. 녹색 표시등(레이저)이 켜져 있으면 빨간색 버튼을 눌러 레이저를 활성화한 다음 레이저를 사용할 준비가 되었음을 나타내는 표시등(레이저)이 빨간색으로 바뀝니다.
    참고: 레이저는 워밍업에 약 10분이 필요합니다.
  2. 수집 튜브를 설정합니다.
    1. 0.5 mL 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 튜브의 캡을 컬렉터에 삽입합니다.
      참고: 원하는 PCR 튜브(0.2 또는 0.5mL)에 대한 일치 컬렉터를 선택합니다.
    2. 피펫 50 μL 추출 버퍼 (재료 표에나열된 RNA 절연 키트제공)를 0.5 mL 수집 튜브의 캡에 넣습니다.
    3. 수집 장치를 현미경에 삽입합니다.
    4. 장치 변경 창에서 참조점으로 이동 단추를 클릭하여 수집기를 RP(참조 점)로 이동합니다. 초점을 조정하여 RP를 명확하게 봅니다. 화살표를 클릭하여 RP를 뷰의 가운데로 이동합니다.
  3. 시편 슬라이드를 로드합니다.
    1. 도구 모음의 왼쪽 언로드 버튼을 클릭하여 슬라이드 홀더를 낮춥습니다.
    2. 슬라이드를 홀더에 넣고 티슈 섹션을 아래쪽을 향합니다.
      참고: 이 방향은 캡처 된 조직 섹션이 중력에 의해 수집 튜브의 캡에 빠지도록합니다.
    3. 홀더를 다시 스테이지에 삽입합니다.
  4. 레이저 파라미터를 설정합니다.
    1. 레이저 메뉴의 제어 옵션을 선택하거나 레이저 아이콘을 클릭합니다.
    2. 원하는대로 이러한 매개 변수를 조정 : 전원,레이저의 전력; 조리개,레이저의 폭; 및 속도, 그리기 및 절단 모드에서 절단의 속도.
      참고: 관심 있는 영역에서 레이저를 테스트합니다. 힘이 높거나 조리개가 커서 절단하기가 더 쉬워지지만 세포에 더 많은 손상을 입힙니다. 전력, 조리개 및 속도의 조합을 조정하여 조직의 효율적인 절단 및 손상을 최소화하십시오. 예를 들어, 12 μm 섹션의 연골 조직에 대한 전력 = 40, 조리개 = 5 및 속도 = 7.
  5. 관심 영역을 선택하고 잘라냅니다.
    1. 5x 목표로 시작하여 관심 영역을 찾은 다음 관심 영역을 가장 잘 보여주는 목표(5x, 10x 또는 40x)로 전환합니다.
      참고: 크레실 바이올렛 염색 후, 연골은 마젠타 염색되고 미네랄화 된 조직은 다른 조직과 구별 되는 갈색 또는 검은 색으로 나타납니다. 파일 메뉴에서 이미지 저장 메뉴를 사용하여 이미지를 저장할 수 있습니다.
    2. 컬렉터에서 마크를 클릭하여 컬렉션용 튜브(A, B, C, D)를 선택합니다.
    3. 이동 및 잘라내기 또는 그리기 및 잘라내기를 선택합니다. 이동 및 절단 모드에서는 마우스 또는 터치 스크린 펜을 사용하여 수동으로 표본을 잘라 모양을 자유롭게 그립니다. 그리기 및 잘라내기 모드에서는 후속 절단을 위해 마우스 또는 터치 스크린 펜으로 셰이프를 자유롭게 그릴 수 있습니다. 절단 시작 버튼을 클릭하여 레이저 절단을 시작합니다.
    4. 절단이 완료되면 PEN 멤브레인이있는 표적 조직이 중력에 의해 수집 튜브의 캡에 떨어집니다. 필요한 경우 4.5를 반복하여 여러 관심 영역을 풀합니다.
      참고: 조직이 불완전한 절단으로 인해 수집 튜브의 캡에 떨어지지 않는 경우 반복 컷 또는 증가 전원 또는 조리개가 필요할 수 있습니다. 미네랄화된 뼈(갈색 또는 검은색)는 레이저로 직접 절단할 수 없습니다.
  6. 수집기의 언로드를 조심스럽게 PCR 튜브를 닫습니다. 미세 해부 된 조직을 드라이 아이스에 놓습니다. 다음 단계로 계속 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 다음 샘플에 대해 4.2에서 4.6을 반복합니다.

5. 미세 해부 조직 및 RNA 분리의 Lysis

  1. 실온에서 미세 해부 된 조직을 해동하십시오. 원심분리기를 42°C에서 30분 동안 간략하게 배양한다.
  2. 배양 후, 0.5 mL PCR 튜브로 lysis 버퍼를 회전. 제조업체의 지침에 따라 RNA 절연 키트(재료 표참조)를 사용하여 DNase 처리 및 RNA 추출을 수행합니다.

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Representative Results

E16.5에서 신선한 냉동 마우스 조직의 코로나 섹션은 Meckel의 연골 (MC), condylar 연골 및 LCM에 의한 하악골의 격리 및 수집을 입증하는 데 사용되었습니다. E16.5에서 마우스 배아는 OCT 화합물을 가진 극저온 형에 해부되고 매립되었다. 금형의 시료를 드라이 아이스 및 메틸-2-부탄 배스에서 급속히 동결시키고 -80°C에서 보관하였다.

연골과 뼈의 크레실 바이올렛 염색을 입증하기 위해, 관상 평면에서 냉동 절편을 수행하고 현미경 슬라이드에 샘플을 수집하였다. 섹션은 위의 프로토콜에 따라 세척, 염색 및 탈수되었습니다(단계 3.2-3.4). 슬라이드는 공기 건조및 영구 장착 매체로 장착되었다. 조사된 모든 연골은 염색된 마젠타(MC, condylar 연골, 비강 중격 연골, 코스튬 연골, 프리페노이드 뼈의 연골 프리모르듐, 반경과 척골의 연골 프리모르디아)와 모든 미네랄화된 조직이 갈색 또는 검은색으로 염색되었다(도1A-E). 연골과 뼈는 여러 해부학 사이트에서 다른 조직과 쉽게 구별되었다.

LCM의 경우, E16.5에서 배아의 머리를 12 μm의 두께로 PEN 멤브레인 슬라이드의 관상 평면에서 단면화하고, 6-8 개의 연속 섹션을 슬라이드 당 수집하고 -80 °C에서 저장하였다. OCT를 제거하고 상술한 프로토콜에 따라 크레실 바이올렛으로 염색하고 탈수시켰다(단계 3.2-3.4). MC, 컨딜라 연골, 및 하악골 부위를 LCM에 의해 선택 및 단리하였다(도2). 선택한 영역은 수집 튜브의 캡에서 포해 버퍼로 떨어졌다. 시퀀싱을 위한 충분한 RNA를 얻기 위하여는, 우리는 각각 1개의 견본으로 각 집합 관으로 각 집합 관으로 MC의 10의 지구, condylar 연골의 10 지구 또는 하악골의 4 지구를 풀링했습니다.

RNA는 제조사의 지시에 따라 RNA 절연 키트를 사용하여 추출되었다. 총 RNA를 바이오분석기를 사용하여 분석하였다(도3A-B). RNA의 품질에 크레실 바이올렛 염색의 효과를 테스트하기 위해, 우리는 스테인드없이 크레실 바이올렛과 샘플로 염색 하악 골 샘플에서 RNA를 비교 (미네랄화 된 조직은 얼룩없이 볼 수 있지만, 크레실 보라색 염색은 주변 조직과 뼈를 구별하는 가시성을 향상). 염색된 샘플(n=4)과 염색이 없는 샘플(n=4) 사이에 RNA 무결성에 유의한 차이가 관찰되지 않았으며,이 프로토콜에서 빠른 크레실 바이올렛 염색이 RNA 품질에 미미한 영향을 미친다는 것을 나타낸다(P= 0.858, 2꼬리 웰치t검, 도 3C). 우리는 상이한 발달 단계에서 각종 조직의 LCM를 위한 우리의 프로토콜을 사용하고 Rin는 높은 RNA 질을 나타내는 측정되었습니다(그림 3D). MC, condylar 연골 및 하악골에서 RNA의 평균 수율은 7.50 ± 1.45 ng이었다, 12.55 ±2.75 ng, 및 33.02 ±7.63 ng(그림 3E)및 수율/면적은 19.73±3.82 ng/mm2, 26.70±5.84 ng/mm2,및 17.23±3.98 ng/mm2,각각(그림 3F)P = 0.383; 하악골 대 condylar 연골, P = 0.260; MC 대 하악골, P = 0.674).

라이브러리는 앞서 설명한바와같이 준비되고 순서를 정하였다6,7. 대표적인 cDNA 크기는 약 500bp(도 4A)였다. RNA-seq 데이터는 MultiQC8로분석되었다. 우리는 18 LCM 샘플에서 RNA-seq 데이터를 분석 (MC1-6, 메켈의 연골; C1-6, 컨딜라 연골; M1-6, 하악골). 읽기의 각 기본 위치에 대한 평균 품질 값은 FastQC에 의해 생성되어 매우 우수한 품질 호출을나타냅니다(그림 4B). 읽기 정렬을 피카드(도4C)로분석하였다. 읽기는 높은 정렬 비율을 보였고 정렬된 읽기의 평균 백분율은 75%였습니다. 유전자 커버리지는 피카드(도4D)로분석하였고, 이는 5' 내지 3' 말단으로부터의 전사체를 따라 양호한 표현을 나타냈다.

차등 유전자 발현 분석은6,7. 하악골과 MC 사이에 4,006개의 유전자가 유의하게 분별적으로 발현(P&0.05)하였다(도5A). 골세포 또는 골혈구에 특이적인유전자(Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715,Sparc16)는MC에 비해 하악골에서 더 높게 발현되었다. 동안 연골 세포 특이적 유전자(아칸17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123,Sox524)는하악골에 비해 MC에서 더 높게 발현되었다(도5B 및 표 1). 또한, Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328Oscar29와 같은 파골세포 마커는 또한 MC에 비해 하악골에서 더 높게 발현된 것으로 확인되었다(도5B 및 표 1),표적 조직의 성공적인 분리를 나타낸다.

Figure 1
그림 1: E16.5에서 마우스 배아의 관상 섹션에서 연골과 뼈의 대표적인 크레실 바이올렛 염색. (A)메켈의 연골과 심미성. (B)메켈의 연골, 컨딜라 연골, 및 심미성. (C)비강 중격 및 상악막. (D)프레스페노이드 뼈와 팔라틴 뼈의 연골 프리모르듐. (E)반경의 연골 프리모르듐, 척골의 연골 프리모르듐, 및 늑골 연골. C = 컨딜라 연골; CC = 늑골 연골; CP = 프레스페노이드 뼈의 연골 프리모르듐; M = 헤미만블; MC = 메켈의 연골; MX = 맥실라; NS= 비강 중격; PL = 팔라틴 뼈; R = 반경의 연골 프리모르듐; U = 척골의 연골 프리모르듐. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: LCM에 의해 단리되고 RNA-seq를 위해 수집된 대표적인 영역. (A-C) 대표적인 스테인드MC(A),컨딜라연골(B),및 LCM 전 저온절에서 이미 분리된MC(C)로심미성. (D-F) 표적 조직 후 A, B 및 C의 영역은 LCM에 의해 분리되었다. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: RNA 품질 및 LCM 샘플의 수량. (A-B) 대표적인 전기포로그램(A) 및 하악골 시료에 대한 바이오분석기로부터 의 관련 겔이미지(B). (C)크레실 바이올렛 (n = 4)으로 염색하거나 염색하지 않고 하악골 샘플에서 총 RNA의 RIN (n = 4). (D)LCM에 의해 단리된 상이한 조직으로부터의 총 RNA의 룬. E16.5에서 메켈의 연골 (n = 6); E16.5에서 콘딜라 연골 (n = 6); E16.5에서 하악골 (n = 6); E14.5에서 비강 중격 연골 (n = 6); E14.5에서 뇌 (n = 6); E16.5에서 뇌 (n = 7); E18.5에서 뇌 (n = 4). (E)3개의 조직에서 총 RNA의 수율. 각 MC 또는 condylar 연골 샘플은 연골의 10개의 미세 제분부위의 풀이었고, 하악골의 각 샘플은 4개의 미세 제해부분한 영역의 헤미만블의 풀이었다. (F)각 조직의 단위 면적당 수율(ng/mm2)입니다. 데이터는 평균 ± s.e.m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: LCM 샘플에서 생성된 라이브러리 및 RNA-seq 데이터의 품질. (a)바이오분석기로 결정된 하악골 시료로부터 라이브러리의 대표적인 cDNA 크기. (B-D) 18 LCM 샘플에서 RNA-seq의 품질 관리 분석 (MC1-6, 메켈의 연골; C1-6, 컨딜라 연골; M1-6, 하악골) 멀티QC. (B)판독값의 각 기본 위치에 대한 평균 품질 값은 FastQC에 의해 생성되었습니다. 그래프의 배경은 y축을 매우 좋은 품질 호출(녹색), 합리적인 품질의 호출(주황색) 및 품질 이좋지(빨간색)로 나눕니다. (C)판독의 정렬은 Picard에 의해 분석되었다. 요약은 정렬된 읽기의 백분율로 표시됩니다. (D)피카드로 분석된 정규화된 유전자 커버리지. 플롯은 5' 끝(왼쪽)에서 3' 끝(오른쪽)까지의 성적 증명서를 따라 상대평균 커버리지를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: LCM에 의해 분리된 하악골 및 MC로부터의 RNA-seq 데이터의 차동 발현 분석. (a)하악골과 MC 사이에 4,006개의 유전자를 유의적으로 분별적으로 발현(P< 0.05)의 계층적 군집화. 각 조직에 3개의 생물학적 복제가 사용되었다. M1-3, 하악골; MC1-3, MC.(B)하악골과 MC 사이의 차별적으로 발현된 유전자의 배 변화 및 P-값을 보여주는 화산 플롯. 고도로 분과적으로 발현된 세포 특이적 유전자의 예는 표고: 파골세포 및 골혈구 마커(청색의 골골세포 마커), 녹색의 파골세포 마커, 적색의 연골세포 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 셀 타입 log2FoldChange 평균 표현식 조정된 P 값
콜1a1 골세포/골혈구 2.64 12.94 2.22E-05
콜1a2 골세포/골혈구 3.41 12.87 8.27E-07
Dkk1 골세포/골혈구 7.59 2.01 5.21E-03
Dmp1 골세포/골혈구 9.73 3.42 3.19E-04
Dstn 골세포/골혈구 2.51 6.87 5.73E-07
런스2 골세포/골혈구 1.24 8.62 4.08E-02
Sp7 골세포/골혈구 2.24 6.95 5.81E-03
Sparc 골세포/골혈구 3.40 12.26 5.56E-09
Acp5 시골 골 3.38 5.74 6.46E-06
Csf1r 시골 골 2.01 5.80 1.17E-04
Ctsk 시골 골 3.19 7.56 5.73E-07
Itgb3 시골 골 2.88 5.37 2.43E-04
오스카 시골 골 3.41 2.67 1.63E-04
아칸 (안)(주) 콘드로시테 -5.23 5.01 2.76E-04
콜2a1 콘드로시테 -3.61 9.47 3.29E-03
콜9a1 콘드로시테 -7.01 3.58 5.51E-03
콜9a2 콘드로시테 -5.40 3.76 2.60E-03
콜9a3 콘드로시테 -6.63 3.80 2.90E-02
광고 콘드로시테 -5.86 1.54 7.51E-03
렉트1 콘드로시테 -7.37 1.34 2.35E-02
삭스5 콘드로시테 -2.88 4.43 6.06E-04

표 1: 다양한 세포 유형의 뼈 및 연골에서 알려진 유전자의 차등 발현(하악골 대 MC).

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Discussion

LCM은 이질적인 조직에서 농축되거나 균질한 세포 집단의 분리를 가능하게 한다. 그 장점은 생체 내 컨텍스트에서 세포의 신속하고 정확한 캡처를 포함, 잠재적 인 단점은 시간이 소요되는 것을 포함, 비싼, 지정된 샘플 내에서 뚜렷한 하위 집단을 인식하는 사용자에 대한 필요성에 의해 제한30. 이 프로토콜은 마우스 배아 연골과 뼈의 LCM의 세부 사항을 제공, RNA-seq에 의해 후속 분석을 위한 높은 RNA 무결성을 유지하면서 정확한 조직 수집을 위한 연골과 뼈를 시각화하는 빠른 절차에서 크레실 바이올렛 염색의 사용을 강조. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 여기에 사용되는 LCM 시스템이 광물화된 조직(예를 들어, 도 2C에서검은색하악조직)을 직접 절단할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 전체 뼈 영역을 해부 할 필요가있다. 특히, LCM에 의해 분리된 미세 제해골화 영역은 균질하지 않으며, 적어도 골아세포, 골세포 및 파골세포의 소집단을포함한다(표 1). 그럼에도 불구하고, LCM에 의한 농축은 우리의 이전 연구가 미세 해부된 뼈 조직에서 파골세포와 같은 특정 소집단의 전사 변화가 여전히 RNA-seq6에의해 검출될 수 있음을 보여주었기 때문에 가치가 있다.

유전자 발현 분석을 위해, 우리는 높은 RNA 질 및 수율을 위한 견본 준비 및 LCM 절차를 최적화했습니다. 우리의 프로토콜은 신선한 냉동 조직으로 시작됩니다. 신선한 냉동 조직 섹션은 추출 된 RNA3의우수한 양과 품질을 허용하며, mRNA는 표준 고정 방법31에민감합니다. RNA는 RNase 오염에 의해 빠르게 저하되며, 시료 전처리, LCM 및 RNA 격리 전반에 걸쳐 RNase 가 없는 환경의 유지 관리는 성공적인 적용을 위해 매우 중요합니다. 섹션 처리 중 물에 노출되는 것은 RNA 품질31,32에해롭다. 우리의 프로토콜은 크레실 바이올렛 염색 동안 수성 노출의 가장 높은 수준이 50 %인 이러한 노출을 제한합니다. 우리는 50% 에탄올에 0.1% 크레실 바이올로 빠른 염색(30s)이 연골에 구별 가능한 색상을 제공하고 낮은 입력 RNA-seq와 같은 하류 분석을 위한 RNA 무결성을 저하시키지 않는다는 것을 시험했습니다(그림 3C그림 4). 수율/면적(ng/mm2)은 약 20 ng/mm2(그림3F)이며,이전 최적화 된 방법33과유사하거나 더 높습니다. MC 및 하악골6의세포 밀도에 따르면, 우리는 이 프로토콜을 통해 한 세포로부터의 평균 수율이 세포당 약 5 pg RNA이고, 총 RNA의 1-5 ng가 200-1,000 개의 세포에서 추출될 수 있다고 추정하며, 이는 낮은 입력 RNA-seq6,7,33에사용될 수 있다. 이러한 수율 효율은 확립된 LCM방법(34)보다훨씬 높으며, 또한 최근 최적화된프로토콜(33,35)과유사하거나 우수하다.

조직학 단면도에 있는 다른 세포 모형을 구별하는 기능은 관심있는 특정 조직의 정확한 수집을 위해 필수적입니다. 크레실 바이올렛은 음전하 핵산36에결합하는 친수성, 기본 얼룩이다. 이 속성은 세포 형 선택성37로역염색하는 데 유용하며 뉴런38에대한 표준 조직학적 얼룩입니다. 크레실 바이올렛은 다양한 조직에 대해 LCM에서 사용되어 왔으며, 좋은 조직 형태및 높은 RNA 품질33,36,39,40을제공한다. 다른 염색 방법에 비해 크레실 바이올렛 염색은 세포질 및 핵 세부 사항을 제공하고, 낮은 RNA 분해율32를제공한다. 우리는 크레실 바이올렛 염색이 연골과 뼈를 시각화하는 쉽고 빠른 방법이며이 방법으로 염색 된 조직이 높은 RNA 무결성을 보존한다는 것을 보여줍니다. 자일렌 치료는 일반적으로 LCM35,36,41,42전에 조직의 탈수에 사용된다. 우리는 표적 조직을 구별하는 데 필수적인 조직 형태(35)의 시각화를 향상시키기 위해 자일렌을 사용하며, 특히 일반 유리 슬라이드만큼 광학적으로 명확하지 않은 PEN 멤브레인 슬라이드에서 특히. 우리는 얼룩과 세척 단계 도중 PEN 슬라이드에서 단면도 손실의 중요한 발생을 찾아내지 않았습니다, OCT를 제거하기 위하여 동요와 조차.

미세액투액 또는 미세유체학계 단세포 RNA-seq(scRNA-seq)는 이기종 세포 유형으로 조직의 전사체를 분석하는 고처리량 방법이며 골격생물학(43)에서사용되기 시작했다. LCM에 대조적으로, scRNA-seq는 단일 세포로 조직의 효소 및/또는 기계적 분해를 관련시킵니다. 단세포 준비를 위한 대부분의 프로토콜은 전사체44,45를변경하는 장시간 동안 실온 또는 37°C에서 배양되는 조직을 요구한다. 또한, 연골과 뼈에서 단일 세포의 분리는 골격성 및 광물화의 골격 원소 복잡성에 의해 물리적으로 제한될 수 있다. 생체 내에서 조직의세포 다양성을 정확하게 대표하는 골격 조직으로부터 충분한 수의 생존 세포를 분리하는 것은 여전히 기술적 과제이며, 세포의 불완전한 해리는 세포유형(43)의검출에 편향을 일으킬 수 있다. scRNA-seq는 뚜렷한 세포 유형을 식별할 수 있지만, 시퀀싱 깊이는 낮으며, 일반적인 시퀀싱 접근법은 3' 전사체 끝을 포착하고 대체 접합 분석을 허용하지 않습니다. LCM 유래 조직의 벌크 RNA-seq는 세포 차이를 균질화하지만 포괄적인 전사체 검출 및 대체 접합 분석을 허용한다. LCM은 따라서 주변 조직및 내부적으로 복잡하지 않은 골격 조직에 특히 유용하며, 조직의 신선한 냉동 제제는 전사 분석을 위한 전사 프로파일 및 RNA 무결성을 모두 보존할 수 있다. scRNA-seq의 또 다른 약점은 단세포 제제 후에, 세포의 공간 정보가 손실된다는 것입니다. LCM 및 scRNA-seq의 조합은 정의된 지리적 위치(Geo-seq)46으로부터작은 샘플의 전사체의 연구를 허용하기 위해 개발되었으며, 이는 LCM을 이용하여 지역화된 유전자 발현을 연구하는 또 다른 접근법이다.

요약하면, 이 프로토콜은 연골과 뼈의 최적화된 LCM에 대한 세부 정보를 제공하며, RNA-seq에 의한 후속 분석을 위해 높은 RNA 무결성을 유지하면서 정확한 조직 수집을 위해 연골과 뼈를 시각화하는 빠른 절차에서 크레실 바이올렛 염색의 사용을 강조합니다. 이 프로토콜은 유전자 발현 분석6,7,및 다른 조직에 대해서도 사용될 수 있는 상이한 발달 단계에서 연골 및 뼈의 LCM에 성공적으로 사용되어 왔다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 치과 및 두개안면 연구의 국립 연구소 (R01DE022988)와 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (P01HD078233)에 의해 지원되었다. 저자는 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학에서 라이카 LMD 6500 플랫폼에 액세스 할 생물 rerepository 및 병리학 코어 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736

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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H.,More

Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).

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