Summary
Denne protokollen beskriver laser fangst microdissection for isolering av brusk og bein fra friske frosne deler av musen embryo. Brusk og bein kan raskt visualisere av cresyl fiolett farging og samlet nettopp for å gi høy kvalitet RNA for transcriptomic analyse.
Abstract
Laser Capture microdissection (LCM) er et kraftig verktøy for å isolere bestemte celletyper eller områder av interesse fra heterogene vev. Den cellulære og molekylære kompleksiteten av skjelett elementer øker med utviklingen. Tissue heterogenitet, slik som i grensesnittet av cartilaginous og fluorose elementer med hverandre eller med omkringliggende vev, er en hindring for studiet av å utvikle brusk og bein. Vår protokoll gir en rask metode for vevs behandling og isolering av brusk og bein som gir høy kvalitet RNA for analyse av genuttrykk. Fersk frosset vev av mus embryo er delt og korte cresyl fiolett farging brukes til å visualisere brusk og bein med farger skiller fra omkringliggende vev. Slides blir så raskt dehydrert, og brusk og bein er isolert senere av LCM. Minimering av eksponering for vandige oppløsninger under denne prosessen opprettholder RNA-integriteten. Mouse Horst ' s brusk og søvnapnéskinne bein på E 16.5 ble vellykket samlet og genuttrykk analyse viste differensial uttrykk for markør gener for osteoblaster, osteocytter, osteoklaster, og chondrocytes. Høy kvalitet RNA ble også isolert fra en rekke vev og embryonale aldre. Denne protokoll detaljer prøveforberedelse for LCM inkludert cryoembedding, skjæring, farging og dehydrating friskt frosset vev, og presis isolering av brusk og bein av LCM resulterer i høy kvalitet RNA for transcriptomic analyse.
Introduction
Muskel-og skjelettsystemet er et multikomponent system sammensatt av muskler, bindevev, sene, leddbånd, brusk, og bein, innervated av nerver og vascularized av blodkar1. Den skjelettlidelser vev utvikle med økende cellulære heterogenitet og strukturelle kompleksitet. Brusk og bein utvikler seg fra samme osteochondroprogenitor avstamning og er svært beslektet. Embryonale brusk og bein utvikle i samarbeid med muskler, nerver, blodkar, og udifferensierte mesenchyme. Brusk kan også være omgitt av bein, slik som Horst ' s brusk og kondylære brusk innenfor søvnapnéskinne benet. Disse vev er anatomisk assosiert og samhandle med hverandre gjennom ekstracellulære signaler under utvikling. I studiet av genuttrykk i utviklingen av brusk og bein, er en hindring heterogenitet av skjelett konstruksjoner sammensatt av flere typer vev. Presis isolering av den spesifikke vev av interesse er nøkkelen for vellykket transcriptional analyse.
Laser Capture microdissection (LCM) er et kraftig verktøy for å isolere celletyper eller områder av interesse innenfor heterogene vev, og er reproduserbar og er følsom for enkelt cellenivå2. Det kan presist målrette og fange celler av interesse for et bredt spekter av nedstrøms analyser i transcriptomics, Genomics, og Proteomikk3,4. Kvaliteten på den isolerte RNA, DNA, eller protein kan vurderes med en bioanalyzer eller tilsvarende plattform. RNA-kvalitet indikeres for eksempel med RNA-nummeret (-)5.
Her gir vi en protokoll for den raske farging og isolering av brusk og bein av LCM fra fersk frosset vev. Vi bruker musen embryo å demonstrere at denne protokollen gir høy kvalitet RNA for påfølgende transcriptomic analyse, slik som RNA sekvensering (RNA-SEQ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vev fra mus ble innhentet i samsvar med National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr, og studere protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. tilberedning av fersk frossen prøve
- Analysere embryo eller vev av interesse. Embed prøven i en disponibel embedding mold med optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte. Juster retningen på prøven med et tips eller en nål.
- Raskt fryse prøvene i en tørr Ice/metyl-2-butan bad. Fortsett til neste trinn eller lagre ved-80 ° c.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
2. kryosnitt for laser fange Microdissection
- Tin kryostaten og rengjør innvendige overflater med 70% etanol. Unn stabiliseringsplaten og et par tang med RNase rense middel. Still inn kryostaten til ønsket skjære temperatur (-18 til-22 ° c). Forbered en lidded container med tørr is, plassere et ark av aluminiumsfolie på tørr isen for midlertidig lagring av delt sample lysbilder under kryosnitt.
Forsiktig: Tørr is er ekstremt kaldt. Håndter alltid tørr is med forsiktighet og slitasje isolerte hansker når du håndterer den. - Overfør den ferske frosne prøven inn i en bøtte med tørr is. Plasser et lag av OCT sammensatte på en kryostaten prøve holderen og umiddelbart plassere prøven på toppen av OCT med forsiktig trykk. Når OCT er helt frosset, fest holderen med prøven i kryostaten skjære arm.
- La prøven stå i kryostaten i 15 min for å likevekt til skjære temperaturen.
- § Vevet og samle skiver på polyetylen polyetylennaftalat (PEN) membran lysbilder med en tykkelse på 12 μm. Juster etterfølgende seksjoner på membranen. Når ett lysbilde er fullført, kan du la delene tørke i noen minutter og overføre lysbildet til folien i den tørre is beholderen til alle de nødvendige lysbildene er samlet inn.
- Lagre lysbildene ved-80 ° c i en lysbilde boks.
Merk: § Tykkelse er valgt for å maksimere mengden av vev samlet samtidig som effektiv skjæring av vevet, og kan variere avhengig av vev av interesse. Protokollen kan stanses midlertidig her. Hold lysbildene fri fra RNase-forurensning. Unngå temperaturendringer. Selv om RINs av RNA-bilder fra lysbilder lagret i opptil 6 måneder fortsatt kan indikere høy kvalitet på RNA-en, anbefaler vi at du bruker lysbilder så snart som mulig.
3. sample forberedelse for laser Capture Microdissection
- Forbered løsninger for farging og dehydrering.
- Plasser 45 mL 80% etanol i hvert av de 3 50 mL sentrifuge rørene på is. Merk dem som #1, #2 og #3. Fortynne etanol med RNase/DNase gratis vann.
- Plasser 45 mL 95% etanol i et 50 mL sentrifugerør på is.
- Plasser 45 mL 100% etanol i et 50 mL sentrifugerør på is.
- Plasser 45 mL av xylen i et 50 mL sentrifugerør ved romtemperatur.
Forsiktig: Xylen bør brukes i en avtrekksvifte.
- Tin en PENN membran lysbilde kort ved å plassere den mot en hansker hånd, vask deretter to ganger for 30 s hver i 45 mL 80% etanol (#1 og #2) med agitasjon i 50 mL sentrifugerør for å fjerne OCT.
Merk: Det er viktig å fjerne OCT før farging, for å hindre OCT løsnet under farging fra skjule seksjonene. Tang kan brukes til å forenkle fjerning av OCT som ikke er vasket ut av agitasjon. - Lay Slide på et ark av aluminiumsfolie. Pipetter 0,8 mL 0,1% cresyl fiolett i 50% etanol på lysbildet og beis i 30 s. vask raset i 45 mL av 80% etanol (#3) i 30 s, og deretter tørke ved passering for 30 s hver gjennom 45 mL av 95% etanol, 100% etanol, og xylen i 50 mL sentrifugerør.
- Stativet glir på en delikat oppgave visker i 5 minutter for å drenere xylen og tørre seksjoner.
Merk: Lysbildene må tørkes helt før LCM.
4. laser fange Microdissection
Merk: Bruk pulver fri nitril hansker mens du utfører LCM.
- Slå på LCM-mikroskopet, laseren og datamaskinen. Logg deg på datamaskinen og start programvaren. Vri nøkkelen til "på"-posisjonen for å starte laseren. Når det grønne lyset (laser) er på, trykker du på den røde knappen for å aktivere laseren, og deretter lyser lyset (laser) rødt som indikerer at laseren er klar til bruk.
Merk: Laseren trenger ca. 10 min for å varmes opp. - Sett opp purre rørene.
- Sett hetten på en 0,5 mL polymerase kjedere reaksjon (PCR) inn i samleren.
Merk: Velg den matchende samleren for de ønskede PCR-rørene (0,2 eller 0,5 mL). - Pipetter 50 μL av utvinnings buffer (levert av RNA isolasjons settet som er listet opp i materialfortegnelsen) i hetten på 0,5 ml oppsamlings rør.
- Sett innsamlings enheten inn i mikroskopet.
- I vinduet endre innsamlings enhet klikker du på knappen Flytt til referansepunkt for å flytte kollektoren til referansepunktet (RP). Juster fokus for å tydelig vise RP. Klikk pilene for å flytte RP til midten av visningen.
- Sett hetten på en 0,5 mL polymerase kjedere reaksjon (PCR) inn i samleren.
- Last inn objektglass.
- Klikk den venstre losse knappen på verktøylinjen for å senke lysbildeholderen.
- Sett glidebryteren inn i holderen med vevs delen vendt nedover.
Merk: Denne orienteringen sikrer at fanget vev seksjoner faller i hetten av samlingen røret ved tyngdekraften. - Sett holderen tilbake på scenen.
- Sett opp laser parametrene.
- Velg kontroll alternativet til laser menyen eller klikk på laser ikonet.
- Juster disse parametrene som ønsket: Power, kraften av laseren; Blenderåpning, bredden på laseren; og hastighet, hastigheten på skjæring i Draw og cut -modus.
Merk: Test laseren i et område av interesse. Høyere effekt eller større blenderåpning gjør det enklere å kutte, men forårsaker mer skade på celler. Juster kombinasjonen av kraft, blenderåpning og hastighet for å oppnå effektiv skjæring og minimal skade på vevet. For eksempel, Power = 40, Aperture = 5, og hastighet = 7 for brusk vev på en 12 μm seksjon.
- Velg og klipp ut områder av interesse.
- Start med 5x målsetting og Finn interesseområdene, og bytt deretter til målsettingen (5x, 10x eller 40x) som best viser interesseområdet.
Merk: Etter cresyl fiolett farging, cartilages er farget magenta og mineralisert vev vises brun eller svart, skilles fra andre vev. Bilder kan lagres ved hjelp av Lagre bilde som fra fil- menyen. - Velg røret for oppsamling (A, B, C, D) ved å klikke på merket ved kollektoren.
- Velg Flytt og klipp ut eller tegn og klipp ut. I Flytt-og klipp ut -modus kuttes prøven manuelt ved hjelp av musen eller berøringsskjerm pennen for å tegne figurer på frihånd. I Draw-og cut -modus kan figurer tegnes Frihånd med musen eller berøringsskjerm pennen for senere klipping. Klikk på Start cut -knappen for å starte laserskjæring.
- Når snittet er ferdig, faller målet vev med PEN membran inn i hetten på samlingen røret ved tyngdekraften. Gjenta 4,5 for å gjøre flere områder av interesse utvalg om nødvendig.
Merk: Repeterende kutt eller økende Power eller Aperture kan være nødvendig hvis vevet ikke faller inn i hetten på samlingen røret på grunn av ufullstendig skjæring. Mineralisert bein (brun eller svart) kan ikke kuttes direkte med laser.
- Start med 5x målsetting og Finn interesseområdene, og bytt deretter til målsettingen (5x, 10x eller 40x) som best viser interesseområdet.
- Fjern samleren og Lukk PCR-slangen forsiktig. Plasser microdissected vev i tørr is. Fortsett til neste trinn eller lagre ved-80 ° c.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Gjenta 4,2 til 4,6 for neste prøve.
5. lyse av Microdissected vev og RNA Isolation
- Tin microdissected vev ved romtemperatur. Sentrifuger kort og ruge prøvene i 30 min ved 42 ° c.
- Etter inkubasjons, spinner du lyseringsbufferen ned i 0,5 mL PCR-slangen. Utfør DNase behandling og RNA-ekstraksjon ved hjelp av et RNA isolasjons sett (se tabell materialet) etter produsentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koronale deler av fersk frossen mus vev på E 16.5 ble brukt til å demonstrere isolasjon og samling av Horst ' s brusk (MC), kondylære brusk, og søvnapnéskinne bein av LCM. Mouse embryo på E 16.5 var dissekert og innebygd i kryogene muggsopp med OCT sammensatte. Prøver i muggsopp ble raskt frosset i en tørr is og methyl-2-butan bad og lagret ved-80 ° c.
Å demonstrere cresyl fiolett farging av brusk og bein, kryosnitt i koronale flyet ble utført og prøvene ble samlet på mikroskop lysbilder. Seksjonene ble vasket, farget og dehydrert etter protokollen ovenfor (trinn 3.2 – 3.4). Slides ble luft tørket og montert med permanent montering medium. Alle cartilages undersøkt var farget magenta (MC, kondylære brusk, nasal septum brusk, Costal brusk, brusk primordium av presphenoid bein, brusk Primordia av radius og ulna) og alle mineralisert vev var beiset brun eller svart (figur 1A-E). Både brusk og bein var lett skilles fra andre vev på flere anatomiske områder.
For LCM, hoder av embryo på E 16.5 ble delt i koronale flyet på PEN membran lysbilder med en tykkelse på 12 μm, og 6-8 sammenhengende seksjoner ble samlet inn per lysbilde og lagret ved-80 ° c. OCT ble fjernet og seksjoner ble farget med cresyl fiolett og dehydrert etter protokollen beskrevet ovenfor (trinn 3.2-3.4). MC, kondylære brusk og søvnapnéskinne Ben regioner ble valgt og isolert av LCM (figur 2). De valgte regionene ble utelatt i lyseringsbufferen i hetten på prøvetakingsrøret. For å oppnå tilstrekkelig RNA for sekvensering, samlet vi 10 regioner av MC, 10 regioner av kondylære brusk eller 4 regioner av søvnapnéskinne bein i hver samling rør som ett utvalg, henholdsvis.
RNA ble pakket ut med et RNA isolasjons sett etter produsentens anvisninger. Total RNA ble analysert ved hjelp av en bioanalyzer (Figur 3a – B). For å teste effekten av cresyl fiolett farging på kvaliteten av RNA, sammenlignet vi RNA fra søvnapnéskinne Ben prøver beiset med cresyl fiolett og prøver uten farging (mineralisert vev er synlig uten farging, men cresyl fiolett farging forbedrer synligheten for å skille bein fra omkringliggende vev). Det ble ikke observert signifikant forskjell i RNA-integriteten mellom fargede prøver (n = 4) og prøver uten farging (n = 4), noe som indikerer at hurtig cresyl fiolett farging i denne protokollen har en ubetydelig effekt på RNA-kvalitet (P = 0,858, tosidig Welch t-test, Figur 3C). Vi brukte vår protokoll for LCM av ulike vev på ulike utviklingsmessige stadier og RINs ble målt, indikerer høy RNA kvalitet (Figur 3D). Gjennomsnittlig avkastning på RNA fra MC, kondylære brusk og søvnapnéskinne bein var 7,50 ± 1,45 ng, 12,55 ± 2,75 ng, og 33,02 ± 7,63 NG (Figur 3E) og yield/området var 19,73 ± 3,82 ng/mm2, 26,70 ± 5,84 ng/mm2, og 17,23 ± 3,98 ng/mm2, henholdsvis (Figur 3F), uten signifikant forskjell mellom vev (MC versus kondylære brusk, p = 0,383; kondylære brusk versus søvnapnéskinne bein, p = 0,260; MC versus søvnapnéskinne bein, P = 0,674).
Bibliotekene ble utarbeidet og sekvensert som tidligere beskrevet6,7. En representativ cDNA-størrelse var omtrent 500 BP (Figur 4A). RNA-SEQ-data ble analysert med MultiQC8. Vi analyserte RNA-SEQ data fra 18 LCM prøver (MC1-6, Horst ' s brusk; C1-6, kondylære brusk; M1-6, søvnapnéskinne bein). Gjennomsnittet kvalitet verdier vannrett hver basis holdning inne det leser var utviklet av FastQC, angir meget fint kvalitet telefonsamtalene (skikkelsen 4B). Les justeringen ble analysert med Picard (Figur 4C). De leser viste høy justerte prosenter og gjennomsnittlig prosentandel av justert leser var 75%. Gene dekning ble analysert med Picard (Figur 4D), som indikerte en god representasjon langs transkripsjon fra 5 ' til 3 ' end.
Differensial gen Expression analyse ble utført6,7. Det var 4 006 gener signifikant differensielt uttrykt (P < 0,05) mellom søvnapnéskinne bein og MC (figur 5A). Gener som er spesifikke for osteoblaster eller osteocytter (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, SP715og SPARC16) var mer høyt uttrykt i søvnapnéskinne benet sammenlignet med MC, mens chondrocyte spesifikke gener (Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, comp22, LECT123, og Sox524) var mer høyt uttrykt i MC sammenlignet med søvnapnéskinne benet (figur 5B og tabell 1). I tillegg ble osteoclast markører som Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328og Oscar29 også identifisert som mer høyt uttrykt i søvnapnéskinne benet sammenlignet med MC (figur 5B og tabell 1), noe som indikerer vellykket isolering av målrettede vev.
Figur 1: representative cresyl fiolett farging av brusk og bein i koronale deler av musen embryo på e 16.5. (A) Horst ' s brusk og hemimandible. (B) Horst ' s brusk, kondylære brusk, og hemimandible. (C) nasal septum og overkjeve. (D) brusk primordium av presphenoid bein og Pfalz bein. (E) brusk primordium av radius, brusk primordium av ulna, og Costal brusk. C = kondylære brusk; CC = Costal brusk; CP = brusk primordium av presphenoid bein; M = hemimandible; MC = Horst ' s brusk; MX = maxilla; NS = nasal septum; PL = Pfalz bein; R = brusk primordium av RADIUS; U = brusk primordium av ulna. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative områder isolert av LCM og samlet inn for RNA-SEQ. (A – C) Representative beiset MC (A), kondylære brusk (B), og hemimandible med MC allerede isolert (C) i cryosection før LCM. (D – F) Regionene i A, B og C etter målrettet vev ble isolert av LCM. Scale bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: RNA-kvalitet og-mengde for LCM-prøver. (A – B) Representative elektroferogrammet (A) og det tilhørende gel bildet (B) fra en bioanalyzer for en søvnapnéskinne bein prøve. (C) RINs av total RNA fra søvnapnéskinne bein prøver farget med cresyl fiolett (n = 4) eller uten farging (n = 4). (D) RINs av total RNA fra forskjellige vev ISOLERT av LCM. Horst ' s brusk på E 16.5 (n = 6); Kondylære brusk på E 16.5 (n = 6); Søvnapnéskinne bein på E 16.5 (n = 6); Nasal septum brusk på E 14.5 (n = 6); Brain på E 14.5 (n = 6); Brain på E 16.5 (n = 7); Brain på E 18.5 (n = 4). (E) utbytte av total RNA fra tre vev. Hver MC eller kondylære brusk prøven var en pool av 10 microdissected regioner av brusk og hver prøve av søvnapnéskinne bein var en pool av 4 microdissected regioner av hemimandible. (F) avkastningen per enhet område (ng/mm2) i hvert vev. Data er bety ± s.e.m. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvaliteten på bibliotekene og RNA-SEQ data generert fra LCM prøver. (A) representative cDNA størrelser av et bibliotek fra en søvnapnéskinne bein prøve bestemmes av en bioanalyzer. (B – D) Kvalitetskontroll analyse av RNA-SEQ fra 18 LCM prøver (MC1-6, Horst ' s brusk; C1-6, kondylære brusk; M1-6, søvnapnéskinne bein) av MultiQC. (B) gjennomsnittlig kvalitet verdier på tvers av hver base posisjon i leser ble generert av FastQC. Bakgrunnen av grafen deler y-aksen i svært god kvalitet samtaler (grønn), samtaler av rimelig kvalitet (oransje), og samtaler av dårlig kvalitet (rød). (C) justering av leser ble analysert av Picard. Sammendraget er vist som prosenter av justert leser. (D) normalisert gen dekning analysert med Picard. Plottet indikerer relativ gjennomsnittlig dekning langs transkripsjon fra 5 ' end (venstre) til 3 ' end (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 5: differensial uttrykk analyse av RNA-SEQ data fra søvnapnéskinne bein og MC isolert av LCM. (A) hierarkisk klynging av 4 006 gener signifikant differensielt uttrykt (P < 0,05) mellom søvnapnéskinne bein og MC. Tre biologiske replikerer ble brukt for hvert vev. M1-3, søvnapnéskinne bein; MC1-3, MC. (B) vulkan plott viser fold endringer og P-verdier av differensielt uttrykt gener mellom søvnapnéskinne bein og MC. eksempler på svært differensielt uttrykte celle spesifikke gener vises: osteoblast og osteocyte markører i blått, osteoclast markører i grønt og chondrocyte markører i rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Genet | Celle type | log2FoldChange | Gjennomsnittlig uttrykk | Justert P-verdi |
| Col1a1 | Osteoblast/Osteocyte | 2,64 | 12,94 | 2.22 e-05 |
| Col1a2 | Osteoblast/Osteocyte | 3,41 | 12,87 | 8.27 e-07 |
| Dkk1 | Osteoblast/Osteocyte | 7,59 | 2,01 | 5.21 e-03 |
| Dmp1 | Osteoblast/Osteocyte | 9,73 | 3,42 | 3.19 e-04 |
| Dstn | Osteoblast/Osteocyte | 2,51 | 6,87 | 5.73 e-07 |
| Runx2 | Osteoblast/Osteocyte | 1,24 | 8,62 | 4.08 e-02 |
| SP7 | Osteoblast/Osteocyte | 2,24 | 6,95 | 5.81 e-03 |
| Sparc | Osteoblast/Osteocyte | 3,40 | 12,26 | 5.56 e-09 |
| Acp5 | Osteoclast | 3,38 | 5,74 | 6.46 e-06 |
| Csf1r | Osteoclast | 2,01 | 5,80 | 1.17 e-04 |
| Ctsk | Osteoclast | 3,19 | 7,56 | 5.73 e-07 |
| Itgb3 | Osteoclast | 2,88 | 5,37 | 2.43 e-04 |
| Oscar | Osteoclast | 3,41 | 2,67 | 1.63 e-04 |
| Acan | Chondrocyte | -5,23 til en | 5,01 | 2.76 e-04 |
| Col2a1 | Chondrocyte | -3,61 til en | 9,47 | 3.29 e-03 |
| Col9a1 | Chondrocyte | -7,01 til en | 3,58 | 5.51 e-03 |
| Col9a2 | Chondrocyte | -5,40 til en | 3,76 | 2.60 e-03 |
| Col9a3 | Chondrocyte | -6,63 til en | 3,80 | 2.90 e-02 |
| Comp | Chondrocyte | -5,86 til en | 1,54 | 7.51 e-03 |
| Lect1 | Chondrocyte | -7,37 til en | 1,34 | 2.35 e-02 |
| Sox5 | Chondrocyte | -2,88 til en | 4,43 | 6.06 e-04 |
Tabell 1: differensial uttrykk for kjente gener i ulike celletyper av bein og brusk (søvnapnéskinne bein versus MC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LCM muliggjør isolering av beriket eller homogen celle populasjoner fra heterogene vev. Dens fordeler inkluderer rask og presis fangst av celler i sin in vivo sammenheng, mens potensielle ulemper inkluderer det er tidkrevende, dyrt, og begrenset av behovet for brukeren å gjenkjenne distinkte subpopulasjoner innenfor et spesifisert eksempel30. Denne protokollen gir detaljer om LCM av mus embryonale brusk og bein, fremhever bruken av cresyl fiolett farging i en rask prosedyre for å visualisere brusk og bein for presis vev samlingen samtidig opprettholde høy RNA integritet for senere analyse av RNA-SEQ. En begrensning av denne protokollen er at LCM-systemet som brukes her ikke er i stand til å direkte skjære over mineralisert vev (f. eks, det søvnapnéskinne vevet i svart i figur 2C); som et resultat, må hele bein området skal dissekert. Spesielt er de microdissected ossified regionene isolert av LCM ikke homogene, og inkluderer minst subpopulasjoner av osteoblaster, osteocytter og osteoklaster (tabell 1). Ikke desto mindre, det berikelse av LCM er kostbar idet våre foregående studere har vist det transcriptional endre inne spesifikk subpopulasjoner som osteoklaster inne det microdissected Ben tissue kanne fremdeles være oppdaget av RNA-SEQ6.
For analyse av genuttrykk har vi optimalisert prøve forberedelsene og LCM-prosedyren for høy RNA-kvalitet og-ytelse. Vår protokoll starter med friskt frosset vev. Fersk frosne vev seksjoner gir utmerket kvantitet og kvalitet av utpakkede RNA3, som mRNA er følsom for standard metoder for fiksering31. RNA er raskt degradert av RNase-forurensning, og vedlikehold av et RNase-fritt miljø gjennom prøve forberedelser, LCM og RNA-isolasjon er avgjørende for vellykket påføring. Eksponering for vann undersnitt behandling er skadelig for RNA-kvalitet31,32. Vår protokoll begrenser slik eksponering, med det høyeste nivået av vandig eksponering blir 50% under cresyl fiolett farging. Vi har testet at en rask farging (30 s) med 0,1% cresyl fiolett i 50% etanol gir en gjenkjennelig farge til brusk og senker ikke RNA integritet for nedstrøms analyse som lav inngang RNA-SEQ (Figur 3C og Figur 4). Avkastningen/området (ng/mm2) er ca 20 ng/mm2 (Figur 3F), lik eller høyere enn tidligere optimaliserte metoder33. I henhold til celle tettheten i MC og søvnapnéskinne Ben6, anslår vi at med denne protokollen gjennomsnittlig avkastning fra en celle er ca 5 PG RNA per celle, og 1-5 ng av total RNA kan utvinnes fra 200-1000 celler, som kan brukes for lav-input RNA-SEQ6,33. Dette yield effektivitet er mye høyere enn etablerte LCM metoder34, og også overlegen eller ligner på nyere optimalisert protokoller33,35.
Evnen til å skille forskjellige celletyper i histologiske seksjoner er avgjørende for presis innsamling av bestemte vev av interesse. Cresyl fiolett er en hydrofile, grunnleggende flekk som binder seg til negativt ladet nukleinsyre syrer36. Denne egenskapen gjør det nyttig for counterstaining med celle-type selektivitet37, og det er en standard histologiske flekken for neurons38. Cresyl Violet har blitt brukt i LCM for en rekke vev, gir god vev morfologi og høy RNA kvalitet33,36,39,40. Sammenlignet med andre farge metoder, gir cresyl fiolett farging cytoplasmatiske og kjernefysiske detaljer, og en lav RNA degradering rate32. Vi viser her at cresyl fiolett farging er en enkel og rask metode for å visualisere brusk og bein, og at vevet beiset med denne metoden sparer høy RNA integritet. Xylen behandling brukes vanligvis for dehydrering av vev før LCM35,36,41,42. Vi bruker xylen for å forbedre visualisering av vev morfologi35 som er viktig å skille målrettet vev, spesielt på pen membran lysbilder som ikke er så optisk klar som vanlig glass lysbilder. Vi fant ingen signifikant forekomst av § tap fra PEN lysbilder under farging og vasking trinn, selv med agitasjon for å fjerne OCT.
Microdroplet eller materialer enkelt celle RNA-SEQ (scRNA-SEQ) er en høy gjennomstrømming metode for å analysere transcriptomes av vev med heterogene celletyper og har begynt å bli brukt i skjelett biologi43. I motsetning til LCM, scRNA-SEQ involverer enzymatisk og/eller mekaniske Disaggregation av vev i enkeltceller. De fleste protokollene for enkel celle forberedelse krever at vev skal inkubert ved romtemperatur eller 37 ° c i lengre perioder, noe som endrer transcriptome44,45. I tillegg kan isolering av enkeltceller i brusk og bein være fysisk begrenset av skjelettlidelser element kompleksiteten av trabecularization og mineralisering. Det er fortsatt en teknisk utfordring å isolere et tilstrekkelig antall levedyktige celler fra skjelettlidelser vev som er nøyaktig representative for mobilnettet mangfoldet av vev in vivo, og ufullstendig dissosiasjon av cellene kan føre til skjevhet i deteksjon av celletyper43. Mens scRNA-SEQ tillater identifisering av forskjellige celletyper, sekvensering dybden er lav, og typisk sekvensering tilnærminger fange 3 ' transkripsjon ender og tillater ikke alternative skjøting analyse. Bulk RNA-SEQ av LCM-avledet vev homogeniserer celle forskjeller, men tillater omfattende transkripsjon deteksjon og alternativ skjøting analyse. LCM er derfor spesielt nyttig for skjelettlidelser vev som ikke er lett separable fra omkringliggende vev og internt kompleks, og fersk frossen utarbeidelse av vevet kan bevare både transcriptional profiler og RNA integritet for transcriptional analyse. En annen svakhet av scRNA-SEQ er at etter enkelt celle forberedelse, den romlige informasjonen i cellene er tapt. En kombinasjonen av LCM og scRNA-SEQ er blitt bebygget å skriftlig tillatelse studiet av transcriptome av en liten eksemplar fra definerte geografisk plasseringene (Geo-SEQ)46, hvilke er en annen adgang av bruker LCM å studere regionene gen gjengivelsen.
Oppsummert denne protokollen gir detaljer om optimalisert LCM av brusk og bein, fremhever bruk av cresyl fiolett farging i en rask prosedyre for å visualisere brusk og bein for presis vev samlingen samtidig opprettholde høy RNA integritet for senere analyse av RNA-SEQ. Denne protokollen har vært brukt med hell for LCM av brusk og bein på ulike utviklingsmessige stadier for genuttrykk analyse6,7, og også kan brukes til andre vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Dental and Kraniofacial Research (R01DE022988) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child helse og Human Development (P01HD078233). Forfatterne takker Biorepository og patologi Core for tilgang til Leica LMD 6500-plattformen ved Icahn School of Medicine ved Sinai-fjellet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
References
- Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
- Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
- Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
- De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
- Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
- Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
- Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
- Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
- Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
- Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
- Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
- Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
- Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
- Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
- Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
- Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
- Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
- Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
- Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
- Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
- Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
- Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
- Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17 (2016).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).
