Summary
Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.
Abstract
La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células específicas o regiones de interés de tejidos heterogéneos. La complejidad celular y molecular de los elementos esqueléticos aumenta con el desarrollo. La heterogeneidad tisular, como en la interfaz de elementos cartilaginosos y óseos entre sí o con los tejidos circundantes, es un obstáculo para el estudio del desarrollo del cartílago y el hueso. Nuestro protocolo proporciona un método rápido de procesamiento de tejidos y aislamiento de cartílago y hueso que produce ARN de alta calidad para el análisis de expresión génica. Los tejidos congelados frescos de embriones de ratón se seccionan y la breve tinción violeta de cresilo se utiliza para visualizar el cartílago y el hueso con colores distintos de los tejidos circundantes. Los deslizamientos se deshidratan rápidamente, y el cartílago y el hueso se aíslan posteriormente por LCM. La minimización de la exposición a soluciones acuosas durante este proceso mantiene la integridad del ARN. El cartílago de Mouse Meckel y el hueso mandibular en E16.5 se recopilaron con éxito y el análisis de la expresión génica mostró la expresión diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteocitos, osteoclastos y condrocitos. Arna de alta calidad también se aisló de una gama de tejidos y edades embrionarias. Este protocolo detalla la preparación de muestras para LCM, incluyendo crioema, seccionamiento, tinción y deshidratación de tejidos congelados frescos, y aislamiento preciso de cartílago y hueso por LCM, lo que resulta en ARN de alta calidad para análisis transcriptomic.
Introduction
El sistema musculoesquelético es un sistema multicomponente compuesto por músculo, tejido conectivo, tendón, ligamento, cartílago y hueso, invadido por los nervios y vascularizado por los vasos sanguíneos1. Los tejidos esqueléticos se desarrollan con el aumento de la heterogeneidad celular y la complejidad estructural. El cartílago y el hueso se desarrollan a partir del mismo linaje osteocondrónrogenitor y están altamente relacionados. El cartílago embrionario y el hueso se desarrollan en asociación con músculos, nervios, vasos sanguíneos y mesenquime indiferenciado. El cartílago también puede estar rodeado de hueso, como el cartílago de Meckel y el cartílago condilar dentro del hueso mandibular. Estos tejidos están anatómicamente asociados e interactúan entre sí a través de señales extracelulares durante el desarrollo. En el estudio de la expresión génica en el desarrollo de cartílago y hueso, un obstáculo es la heterogeneidad de las estructuras esqueléticas compuestas de múltiples tipos de tejido. El aislamiento preciso del tejido específico de interés es clave para un análisis transcripcional exitoso.
La microdisección de captura láser (LCM) es una poderosa herramienta para aislar tipos de células o regiones de interés dentro de tejidos heterogéneos, y es reproducible y es sensible al nivel de una sola célula2. Puede apuntar y capturar con precisión células de interés para una amplia gama de ensayos aguas abajo en transcriptomica, genómica y proteómica3,4. La calidad del ARN, ADN o proteína aisladose se puede evaluar con un bioanalizador o plataforma equivalente. Por ejemplo, la calidad del ARN se indica mediante el número de integridad del ARN (RIN)5.
Aquí, proporcionamos un protocolo para la rápida tinción y aislamiento de cartílago y hueso por LCM de los tejidos congelados frescos. Utilizamos el embrión de ratón para demostrar que este protocolo produce ARN de alta calidad para análisis transcriptomáticos posteriores, como la secuenciación de ARN (RNA-seq).
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Protocol
Los tejidos de ratones se obtuvieron de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.
1. Preparación de especímenes congelados frescos
- Diseccionar el embrión o tejido de interés. Incruste la muestra en un molde de incrustación desechable con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Ajuste la orientación de la muestra con una punta o aguja.
- Congele rápidamente las muestras en un baño de hielo seco/metil-2 butano. Continúe con el siguiente paso o almacene a -80 oC.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Criosección para microdisección de captura láser
- Descongelar el criostato y limpiar las superficies internas con 70% de etanol. Trate la placa antivuelco y un par de fórceps con el agente de descontaminación RNase. Ajuste el criostato a la temperatura de corte deseada (-18 a -22 oC). Preparar un recipiente tapado con hielo seco, colocando una lámina de papel de aluminio en el hielo seco para el almacenamiento temporal de los portaobjetos de muestra seccionados durante la criosección.
PRECAUCION: El hielo seco es extremadamente frío. Siempre manipule el hielo seco con cuidado y use guantes aislados siempre que lo manipule. - Transfiera el espécimen fresco congelado en un cubo de hielo seco. Coloque una capa de compuesto OCT sobre un soporte de muestra criostato e coloque inmediatamente la muestra encima del PTU con una presión suave. Cuando los OCT estén completamente congelados, apriete el soporte con la muestra en el brazo de corte del criostato.
- Deje la muestra en el criostato durante 15 minutos para equilibrar la temperatura de corte.
- Seccionar el tejido y recoger las rodajas de las guías de membrana de polietilenano naftala (PEN) a un espesor de 12 m. Alinee secciones consecutivas en la membrana. Una vez que se haya completado una diapositiva, deje que las secciones se sequen durante unos minutos y transfiera la diapositiva a la lámina en el recipiente de hielo seco hasta que se recojan todos los portaobjetos necesarios.
- Almacene las diapositivas a -80 oC en una caja de diapositivas.
NOTA: El espesor de la sección se elige para maximizar la cantidad de tejido recogido mientras permite un corte eficiente del tejido, y puede variar dependiendo del tejido de interés. El protocolo se puede pausar aquí. Mantenga las diapositivas libres de contaminación por RNase. Evite los cambios de temperatura. Aunque los RIN de ARN de las diapositivas almacenadas hasta 6 meses todavía pueden indicar una alta calidad del ARN, recomendamos el uso de diapositivas tan pronto como sea posible.
3. Preparación de muestras para la microdisección de captura láser
- Preparar soluciones para la tinción y la deshidratación.
- Colocar 45 ml de 80% de etanol en cada uno de los tres tubos centrífugos de 50 ml sobre hielo. Etiquételos como #1, #2 y #3. Diluir el etanol con agua libre de RNase/DNase.
- Colocar 45 ml de etanol al 95% en un tubo centrífugo de 50 ml sobre hielo.
- Colocar 45 ml de etanol 100% en un tubo centrífugo de 50 ml sobre hielo.
- Colocar 45 ml de xileno en un tubo centrífugo de 50 ml a temperatura ambiente.
PRECAUCION: El xileno debe utilizarse en una campana de humo.
- Descongelar una membrana PEN se desliza brevemente colocándola contra una mano enguantada, luego lavar dos veces durante 30 s cada una en 45 ml de etanol 80% (#1 y #2) con agitación en tubos centrífugos de 50 ml para extraer el PTU.
NOTA: Es importante eliminar los PTU antes de la tinción, para evitar que los PTU se aflojen durante la tinción oscurezen las secciones. Los fórceps se pueden utilizar para facilitar la eliminación de LOS PTU que no se lavan por agitación. - Poner el dedo sobre una hoja de papel de aluminio. Pipeta 0,8 ml de 0,1% de cresilo violeta en 50% etanol sobre el portaobjetos y mancha durante 30 s. Lavar el portaobjetos en 45 ml de etanol 80% (#3) para 30 s, y luego deshidratar por paso durante 30 s cada uno a través de 45 ml de etanol 95%, 100% etanol y xileno en tubos centrígenos de 50 ml.
- Depie los portaobjetos sobre un limpiaparabrisas de tarea delicada durante 5 minutos para drenar las secciones de xileno y secas.
NOTA: Las diapositivas deben secarse completamente antes de LCM.
4. Microdisección de captura láser
NOTA: Use guantes de nitrilo sin polvo mientras realiza LCM.
- Encienda el microscopio, el láser y la computadora LCM. Inicie sesión en el ordenador e inicie el software. Gire la tecla a la posición "On" para poner en marcha el láser. Cuando la luz verde (Láser) está encendida, presione el botón rojo para activar el láser, y luego la luz (Láser) se vuelve roja indicando que el láser está listo para usar.
NOTA: El láser necesita aproximadamente 10 minutos para calentarse. - Configure los tubos de recogida.
- Inserte la tapa de un tubo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,5 ml en el colector.
NOTA: Elija el colector correspondiente para los tubos PCR deseados (0,2 o 0,5 ml). - Pipeta de 50 l de tampón de extracción (proporcionado por el kit de aislamiento de ARN incluido en la Tabla de Materiales)en la tapa del tubo de recogida de 0,5 ml.
- Inserte el dispositivo de recogida en el microscopio.
- En la ventana Cambiar dispositivo recopilador, haga clic en el botón Mover al punto de referencia para mover el selector al punto de referencia (RP). Ajuste el enfoque para ver claramente el RP. Haga clic en las flechas para mover el RP al centro de la vista.
- Inserte la tapa de un tubo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,5 ml en el colector.
- Cargue los portaobjetos.
- Haga clic en el botón Descargar izquierdo de la barra de herramientas para bajar el portaobjetos.
- Coloque la corredera en el soporte, con la sección de tejido hacia abajo.
NOTA: Esta orientación asegura que las secciones de tejido capturadas caigan en la tapa del tubo de recolección por gravedad. - Vuelva a insertar el soporte en el escenario.
- Configure los parámetros del láser.
- Seleccione la opción Control del menú Láser o haga clic en el icono Láser.
- Ajuste estos parámetros como desee: Potencia,la potencia del láser; Apertura, la anchura del láser; y Velocidad, la velocidad de corte en el modo Dibujar y Cortar.
NOTA: Pruebe el láser en un área fuera de interés. Una mayor potencia o una apertura más grande hace que sea más fácil de cortar, pero causa más daño a las células. Ajuste la combinación de potencia, apertura y velocidad para obtener un corte eficiente y un daño mínimo del tejido. Por ejemplo, Potencia 40, Apertura 5 y Velocidad 7 para el tejido del cartílago en una sección de 12 m.
- Seleccione y corte áreas de interés.
- Comience con el objetivo 5x y encuentre las áreas de interés, y luego cambie al objetivo (5x, 10x, o 40x) que mejor muestre el área de interés.
NOTA: Después de la tinción violeta cresilo, los cartílagos son magenta manchados y los tejidos mineralizados aparecen marrones o negros, distinguibles de otros tejidos. Las imágenes se pueden guardar mediante Guardar imagen como en el menú Archivo. - Elija el tubo para la colección (A, B, C, D) haciendo clic en la marca en el colector.
- Seleccione Mover y cortar o Cortar y cortar. En el modo Mover y cortar, la muestra se corta manualmente, utilizando el ratón o el lápiz de pantalla táctil para dibujar formas a mano alzada. En el modo Dibujar y Cortar, las formas se pueden dibujar a mano alzada con el ratón o el lápiz de pantalla táctil para el corte posterior. Haga clic en el botón Iniciar corte para iniciar el corte por láser.
- Una vez completado el corte, el tejido diana con membrana PEN cae en la tapa del tubo de recolección por gravedad. Repita 4.5 para agrupar varias áreas de interés si es necesario.
NOTA: Puede ser necesario repetir cortes o aumentar la potencia o la apertura si el tejido no cae en la tapa del tubo de recogida debido al corte incompleto. El hueso mineralizado (marrón o negro) no se puede cortar directamente con láser.
- Comience con el objetivo 5x y encuentre las áreas de interés, y luego cambie al objetivo (5x, 10x, o 40x) que mejor muestre el área de interés.
- Descargue el colector y cierre cuidadosamente el tubo PCR. Coloque los tejidos microdiseccionados en hielo seco. Continúe con el siguiente paso o almacene a -80 oC.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Repita 4.2 a 4.6 para la siguiente muestra.
5. Lisis de los tejidos microdiseccionados y el aislamiento del ARN
- Descongelar los tejidos microdiseccionados a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente e incubar las muestras durante 30 min a 42oC.
- Después de la incubación, gire el tampón de lisis hacia abajo en el tubo PCR de 0,5 ml. Realice el tratamiento con DNase y la extracción de ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Se utilizaron secciones coronales de tejidos frescos congelados de ratón en E16.5 para demostrar el aislamiento y la recolección del cartílago de Meckel (MC), cartílago cario y hueso mandibular por LCM. Los embriones de ratón en E16.5 fueron diseccionados e incrustados en moldes criogénicos con compuesto OCT. Las muestras en moldes se congelaron rápidamente en un baño de hielo seco y metil-2-butano y se almacenaron a -80 oC.
Para demostrar la tinción violeta cresilo de cartílago y hueso, se realizó criosección en el plano coronal y se recogieron muestras en diapositivas de microscopio. Las secciones fueron lavadas, manchadas y deshidratadas siguiendo el protocolo anterior (paso 3.2–3.4). Los portaobjetos se secaron al aire y se montaron con un medio de montaje permanente. Todos los cartílagos examinados fueron magenta manchados (MC, cartílago condilar, cartílago del tabique nasal, cartílago costal, primordio del cartílago del hueso preesfensofoides, primordia de cartílago de radio y cúbito) y todos los tejidos mineralizados se tiñieron de color marrón o negro(Figura 1A–E). Tanto el cartílago como el hueso se distinguieron fácilmente de otros tejidos en múltiples sitios anatómicos.
En el caso de LCM, las cabezas de embriones en E16.5 se seccionaron en el plano coronal en los portaobjetos de membrana PEN a un espesor de 12 m, y se recogieron de 6 a 8 secciones consecutivas por diapositiva y se almacenaron a -80 oC. Se eliminaron los PTU y se teñieron las secciones con cresyl violeta y se deshidrataron siguiendo el protocolo descrito anteriormente (paso 3.2–3.4). MC, cartílago condylar, y las regiones óseas mandibulares fueron seleccionados y aislados por LCM (Figura 2). Las regiones seleccionadas cayeron en el tampón de lisis en la tapa del tubo de recogida. Para obtener suficiente ARN para la secuenciación, agrupamos 10 regiones de MC, 10 regiones de cartílago condylar o 4 regiones de hueso mandibular en cada tubo de recolección como una muestra, respectivamente.
El ARN se extrajo utilizando un kit de aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se analizó utilizando un bioanalizador(Figura 3A–B). Para probar el efecto de la tinción violeta de cresilo en la calidad del ARN, comparamos el ARN a partir de muestras óseas mandibulares teñidas con violeta cresílo y muestras sin tinción (el tejido mineralizado es visible sin tinción, pero la tinción violeta de cresíl mejora la visibilidad para distinguir el hueso de los tejidos circundantes). No se observó ninguna diferencia significativa en la integridad del ARN entre las muestras manchadas (n x 4) y las muestras sin tinción (n x 4), lo que indica que la rápida tinción violeta de cresilo en este protocolo tiene un efecto insignificante en la calidad del ARN (P a 0,858, prueba t de Welch de dos colas, Figura 3C). Utilizamos nuestro protocolo para LCM de diversos tejidos en diferentes etapas de desarrollo y se midieron los RIN, lo que indica una alta calidad de ARN(Figura 3D). Los rendimientos medios de ARN de MC, cartílago condylar y hueso mandibular fueron de 7,50 a 1,45 ng, 12,55 a 2,75 ng y 33,02 a 7,63 ng(Figura 3E)y el rendimiento/área fue de 19,73 a 3,82 ng/mm2, 26,70 a 5,84 ng/mm2y 17,23 a 3,98 ng/mm2, respectivamente(Figura 3F),sin diferencia significativa entre los tejidos (MC frente a los cartílagos condy, P a 0,383; cartílago condylar frente a hueso mandibular, P a 0,260; MC versus hueso mandibular, P a 0,674).
Las bibliotecas se prepararon y secuenciaron como se describió anteriormente6,7. Un tamaño representativo de ADNc fue de aproximadamente 500 bp(Figura 4A). Los datos de ARN-seq se analizaron con MultiQC8. Analizamos los datos de ARN-seq de 18 muestras de LCM (MC1-6, cartílago de Meckel; C1-6, cartílago condilar; M1-6, hueso mandibular). Los valores de calidad media en cada posición base en las lecturas fueron generados por FastQC, lo que indica llamadas de muy buena calidad(Figura 4B). La alineación de lectura se analizó con Picard(Figura 4C). Las lecturas mostraron porcentajes alineados altos y el porcentaje promedio de lecturas alineadas fue del 75%. La cobertura genética se analizó con Picard(Figura 4D),que indicaba una buena representación a lo largo de la transcripción del extremo de 5' a 3'.
El análisis diferencial de la expresión génica se realizó6,7. Había 4.006 genes significativamente expresados diferencialmente (P < 0.05) entre el hueso mandibular y MC(Figura 5A). Genes específicos de osteoblastos u osteocitos (Col1a19, Col1a210, Dkk111, Dmp112, Dstn13, Runx214, Sp715, y Sparc16) fueron más altamente expresados en el hueso mandibular en comparación con MC, mientras que los genes específicos de chondrocitos (Acan17, Col2a118, Col9a119, Col9a220, Col9a321, Comp22, Lect123y Sox524) fueron más expresados en MC en comparación con el hueso mandibular(Figura 5B y Tabla 1). Además, los marcadores osteoclast como Acp525, Csf1r26, Ctsk27, Itgb328y Oscar29 también fueron identificados como más expresados en el hueso mandibular en comparación con MC(Figura 5B y Tabla 1), lo que indica el aislamiento exitoso de los tejidos dirigidos.
Figura 1: Tinción violeta de cresilo representativo de cartílago y hueso en secciones coronales del embrión del ratón en E16.5. (A) El cartílago y la hemimandible de Meckel. (B) Cartílago de Meckel, cartílago condilar y hemimandible. (C) Tabique nasal y maxilar. (D) Cartílago primordio de hueso preesfenoides y hueso palatino. (E) Cartílago primordio de radio, cartílago primordio de cúbito, y cartílago costal. C - cartílago condylar; CC - cartílago costal; CP - cartílago primordium de hueso presfenofenoides; M - hemimandible; MC - Cartílago de Meckel; MX - maxilar; NS - tabique nasal; PL - hueso palatino; R - cartílago primordium de radio; U - cartílago primordium de cúbito. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Regiones representativas aisladas por LCM y recogidas para ARN-seq. (A–C) Representante manchado MC (A), cartílago condylar (B), y hemimandible con MC ya aislado (C) en criosección antes de LCM. (D–F) Las regiones en A, B y C después de los tejidos dirigidos fueron aisladas por LCM. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Calidad del ARN y cantidad de muestras de LCM. (A–B) Electroferograma representativo (A) y la imagen de gel asociada (B) de un bioanalizador para una muestra de hueso mandibular. (C) RIN de ARN total a partir de muestras óseas mandibulares teñidas con violeta cresílo (n x 4) o sin tinción (n x 4). (D) RIN de ARN total de diferentes tejidos aislados por LCM. Cartílago de Meckel en E16.5 (n x 6); Cartílago condylar en E16.5 (n.o 6); Hueso mandibular en E16.5 (n a 6); Cartílago del tabique nasal en E14.5 (n a 6); Cerebro en E14.5 (n a 6); Cerebro en E16.5 (n a 7); Cerebro en E18.5 (n.o 4). (E) Rendimiento del ARN total de tres tejidos. Cada muestra de cartílago MC o condylar era un grupo de 10 regiones microdiseccionadas de cartílago y cada muestra de hueso mandibular era un grupo de 4 regiones microdiseccionadas de hemimandible. (F) El rendimiento por unidad de área (ng/mm2) en cada tejido. Los datos son medios: s.e.m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La calidad de las bibliotecas y los datos de ARN-seq generados a partir de muestras LCM. (A) Tamaños representativos del ADNc de una biblioteca a partir de una muestra ósea mandibular determinada por un bioanalizador. (B–D) Análisis de control de calidad de ARN-seq a partir de 18 muestras de LCM (MC1-6, cartílago de Meckel; C1-6, cartílago condilar; M1-6, hueso mandibular) de MultiQC. (B) FastQC generó los valores de calidad medios en cada posición base de las lecturas. El fondo del gráfico divide el eje y en llamadas de muy buena calidad (verde), llamadas de calidad razonable (naranja) y llamadas de mala calidad (rojo). (C) Picard analizó la alineación de las lecturas. El resumen se muestra como los porcentajes de lecturas alineadas. (D) Cobertura genética normalizada analizada con Picard. La gráfica indica la cobertura media relativa a lo largo de la transcripción de 5' extremo (izquierda) a 3' extremo (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de expresión diferencial de datos RNA-seq del hueso mandibular y MC aislado por LCM. (A) Agrupación jerárquica de 4.006 genes significativamente expresados diferencialmente (P < 0.05) entre el hueso mandibular y MC. Se utilizaron tres réplicas biológicas para cada tejido. M1-3, hueso mandibular; MC1-3, MC. (B) Gráfica volcánica que muestra los cambios de pliegue y los valores P de los genes expresados diferencialmente entre el hueso mandibular y MC. Se muestran ejemplos de genes específicos de células altamente expresados diferencialmente: marcadores osteoblastos y osteocitos en azul, marcadores osteoclast en verde y marcadores de condrocitos en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gene | Tipo de celda | log2FoldChange | Expresión media | Valor P ajustado |
| Col1a1 | Osteoblasto/Ostecito | 2.64 | 12.94 | 2.22E-05 |
| Col1a2 | Osteoblasto/Ostecito | 3.41 | 12.87 | 8.27E-07 |
| Dkk1 | Osteoblasto/Ostecito | 7.59 | 2.01 | 5.21E-03 |
| Dmp1 | Osteoblasto/Ostecito | 9.73 | 3.42 | 3.19E-04 |
| Dstn | Osteoblasto/Ostecito | 2.51 | 6.87 | 5.73E-07 |
| Runx2 | Osteoblasto/Ostecito | 1.24 | 8.62 | 4.08E-02 |
| Sp7 | Osteoblasto/Ostecito | 2.24 | 6.95 | 5.81E-03 |
| Sparc | Osteoblasto/Ostecito | 3.40 | 12.26 | 5.56E-09 |
| Acp5 | Osteoclasta | 3.38 | 5.74 | 6.46E-06 |
| Csf1r | Osteoclasta | 2.01 | 5.80 | 1.17E-04 |
| Ctsk | Osteoclasta | 3.19 | 7.56 | 5.73E-07 |
| Itgb3 | Osteoclasta | 2.88 | 5.37 | 2.43E-04 |
| Oscar | Osteoclasta | 3.41 | 2.67 | 1.63E-04 |
| Acan | Condrocitos | -5.23 | 5.01 | 2.76E-04 |
| Col2a1 | Condrocitos | -3.61 | 9.47 | 3.29E-03 |
| Col9a1 | Condrocitos | -7.01 | 3.58 | 5.51E-03 |
| Col9a2 | Condrocitos | -5.40 | 3.76 | 2.60E-03 |
| Col9a3 | Condrocitos | -6.63 | 3.80 | 2.90E-02 |
| Comp | Condrocitos | -5.86 | 1.54 | 7.51E-03 |
| Lect1 | Condrocitos | -7.37 | 1.34 | 2.35E-02 |
| Sox5 | Condrocitos | -2.88 | 4.43 | 6.06E-04 |
Tabla 1: Expresión diferencial de genes conocidos en varios tipos celulares de hueso y cartílago (hueso mandibular versus MC).
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Discussion
LCM permite el aislamiento de poblaciones celulares enriquecidas u homogéneas de tejidos heterogéneos. Sus ventajas incluyen la captura rápida y precisa de las células en su contexto in vivo, mientras que las desventajas potenciales incluyen que sea lento, costosa y limitada por la necesidad de que el usuario reconozca subpoblaciones distintas dentro de una muestra especificada30. Este protocolo proporciona detalles de LCM de cartílago embrionario de ratón y hueso, destacando el uso de la tinción violeta cresilo en un procedimiento rápido para visualizar el cartílago y el hueso para la recolección precisa de tejido sin dejar de mantener una alta integridad de ARN para su posterior análisis por ARN-seq. Una limitación de este protocolo es que el sistema LCM utilizado aquí no es capaz de cortar directamente a través de los tejidos mineralizados (por ejemplo, el tejido mandibular en negro en la Figura 2C); como resultado, toda el área ósea necesita ser diseccionada. En particular, las regiones osificadas microdiseccionadas aisladas por LCM no son homogéneas e incluyen al menos las subpoblaciones de osteoblastos, osteocitos y osteoclastos (Tabla 1). Sin embargo, el enriquecimiento por LCM es valioso ya que nuestro estudio anterior ha demostrado que los cambios transcripcionales en subpoblaciones específicas como los osteoclastos en el tejido óseo microdiseccionado todavía pueden ser detectados por ARN-seq6.
Para el análisis de la expresión génica, hemos optimizado la preparación de muestras y el procedimiento de LCM para una alta calidad y rendimiento de ARN. Nuestro protocolo comienza con tejidos congelados frescos. Las secciones de tejido congelado fresco permiten una excelente cantidad y calidad de ARN extraído3,ya que el ARNm es sensible a los métodos estándar de fijación31. El ARN se degrada rápidamente por la contaminación de RNase, y el mantenimiento de un entorno libre de RNase a lo largo de la preparación de muestras, el LCM y el aislamiento de ARN es fundamental para una aplicación exitosa. La exposición al agua durante el procesamiento de la sección es perjudicial para la calidad del ARN31,32. Nuestro protocolo limita dicha exposición, con el nivel más alto de exposición acuosa siendo 50% durante la tinción violeta cresíl. Hemos probado que una tinción rápida (30 s) con 0.1% de violeta cresilo en etanol 50% da un color distinguible al cartílago y no reduce la integridad del ARN para el análisis aguas abajo como ARN-seq de baja entrada(Figura 3C y Figura 4). El rendimiento/área (ng/mm2) es de aproximadamente 20 ng/mm2 (Figura 3F),similar o superior a los métodos optimizados anteriores33. De acuerdo con las densidades celulares en MC y hueso mandibular6,estimamos que con este protocolo el rendimiento promedio de una célula es de aproximadamente 5 pg de ARN por célula, y 1–5 ng de ARN total se puede extraer de 200–1,000 células, que se pueden utilizar para ARN de baja entrada-seq6,7,33. Esta eficiencia de rendimiento es mucho mayor que los métodos de LCM establecidos34,y también superior o similar a los protocolos optimizados recientes33,35.
La capacidad de distinguir diferentes tipos de células en secciones histológicas es esencial para la recolección precisa de tejidos específicos de interés. Cresyl violeta es una mancha hidrofílica, básica que se une a los ácidos nucleicos cargados negativamente36. Esta propiedad hace que sea útil para contramanchar con selectividad de tipo celular37, y es una mancha histológica estándar para las neuronas38. Cresyl violeta se ha utilizado en LCM para una variedad de tejidos, proporcionando buena morfología tisular y alta calidad de ARN33,36,39,40. En comparación con otros métodos de tinción, la tinción violeta cresyl proporciona detalles citoplasma y nuclear, y una baja tasa de degradación del ARN32. Aquí demostramos que la tinción violeta cresíl es un método fácil y rápido para visualizar el cartílago y el hueso y que el tejido manchado con este método conserva una alta integridad del ARN. El tratamiento con xileno se utiliza comúnmente para la deshidratación de los tejidos antes de LCM35,36,41,42. Utilizamos xileno para mejorar la visualización de la morfología de los tejidos35, que es esencial para distinguir los tejidos dirigidos, especialmente en las diapositivas de membrana PEN que no son tan claras ópticamente como los portaobjetos de vidrio liso. No encontramos ninguna ocurrencia significativa de la pérdida de sección de las diapositivas PEN durante los pasos de tinción y lavado, incluso con agitación para eliminar los PTU.
El ARN-seq de una sola célula basado en microgotas o microfluídicos (scRNA-seq) es un método de alto rendimiento para analizar transcriptomos de tejidos con tipos de células heterogéneas y ha comenzado a utilizarse en la biología esquelética43. A diferencia de la LCM, el scRNA-seq implica desagregación enzimática y/o mecánica del tejido en células individuales. La mayoría de los protocolos para la preparación de una sola célula requieren la incubación de tejidos a temperatura ambiente o 37 oC durante períodos prolongados, lo que altera el transcriptoma44,45. Además, el aislamiento de células individuales en el cartílago y el hueso puede estar físicamente limitado por la complejidad del elemento esquelético de la trabecularización y la mineralización. Sigue siendo un desafío técnico aislar un número suficiente de células viables de los tejidos esqueléticos que son exactamente representativos de la diversidad celular de los tejidos in vivo,y la disociación incompleta de las células puede causar sesgo en la detección de los tipos celulares43. Mientras que scRNA-seq permite la identificación de tipos de celda distintos, la profundidad de secuenciación es baja, y los enfoques de secuenciación típicos capturan extremos de transcripción de 3' y no permiten el análisis de empalme alternativo. El ARN-seq a granel del tejido derivado de LCM homogeneiza las diferencias celulares, pero permite la detección completa de transcripciones y el análisis de empalme alternativo. Por lo tanto, el LCM es especialmente útil para los tejidos esqueléticos que no son fácilmente separables de los tejidos circundantes y complejos internamente, y la preparación congelada fresca del tejido puede preservar tanto los perfiles transcripcionales como la integridad del ARN para el análisis transcripcional. Otra debilidad de scRNA-seq es que después de la preparación de una sola célula, la información espacial de las células se pierde. Se ha desarrollado una combinación de LCM y scRNA-seq para permitir el estudio del transcriptoma de una pequeña muestra de ubicaciones geográficas definidas (Geo-seq)46,que es otro enfoque de la utilización de LCM para estudiar la expresión génica regionalizada.
En resumen, este protocolo proporciona detalles de LCM optimizado de cartílago y hueso, destacando el uso de la tinción violeta cresil en un procedimiento rápido para visualizar el cartílago y el hueso para la recolección precisa de tejido mientras se mantiene una alta integridad de ARN para el análisis posterior por ARN-seq. Este protocolo se ha utilizado con éxito para LCM de cartílago y hueso en diferentes etapas de desarrollo para el análisis de expresión génica6,7, y también se puede utilizar para otros tejidos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (R01DE022988) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver (P01HD078233). Los autores agradecen al Biorepositorio y Al Núcleo de Patología por el acceso a la plataforma Leica LMD 6500 en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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