Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

خلايا بروجكتور التاجية والمؤشرات الحيوية القابلة للذوبان في تشخيص القلب والأوعية الدموية بعد رأب الأوعية التاجية

Published: January 28, 2020 doi: 10.3791/60504
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1
1Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory & Regenerative Medicine and Tissue Engineering Laboratory, 2Hemodynamics Unit, Cardiology Department, Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE, 3Laboratorio de Biología del Desarrollo y Teratogénesis Experimental, Hospital Infantil de México Federico Gómez

Summary

يتأثر تطور الأحداث القلبية الوعائية السلبية الرئيسية ، والتي تؤثر على تشخيص القلب والأوعية الدموية بعد رأب الأوعية التاجية ، بمدى الضرر التاجي وإصلاح الأوعية الدموية. استخدام المؤشرات الحيوية الخلوية التاجية وقابلة للذوبان جديدة، رد الفعل على تلف الأوعية الدموية وإصلاحها، هي مفيدة للتنبؤ تطور MACEs والتكهن.

Abstract

تؤثر الأحداث القلبية الوعائية السلبية الرئيسية (MACEs) سلبًا على تشخيص القلب والأوعية الدموية للمرضى الذين يخضعون لعملية رأب الأوعية التاجية بسبب الإصابة الإقفارية التاجية. مدى الضرر التاجي وآليات إصلاح الأوعية الدموية هي العوامل التي تؤثر على التنمية المستقبلية للMACEs. وقد أظهرت السمات الوعائية الجوهرية مثل خصائص البلاك وتعقيد الشريان التاجي معلومات التكهن لMACEs. ومع ذلك، فقد افترض أن استخدام المؤشرات الحيوية المتداولة داخل الرسياق ة هو طريقة ملائمة للتحديد المبكر للأجهزة النشطة الماسية وتشخيصها، لأنها تعكس على نحو أوثق الآليات الدينامية التي تنطوي على تلف الشريان التاجي وإصلاحه. تحديد المؤشرات الحيوية المتداولة التاجية أثناء رأب الأوعية ، مثل عدد الفئات السكانية الفرعية من خلايا السلف أحادية النواة (MPCs) ، وكذلك تركيز الجزيئات القابلة للذوبان التي تعكس الالتهاب ، التصاق الخلية ، وإصلاحها ، يسمح تقييم التطورات المستقبلية وتشخيص MACEs 6 أشهر بعد رأب الأوعية التاجية. وتبرز هذه الطريقة من خلال طبيعتها الانتقالية وأداء أفضل من الدم المحيطي المتداول المؤشرات الحيوية فيما يتعلق بالتنبؤ بالمواد الماسية وتأثير ذلك على تشخيص القلب والأوعية الدموية، والتي يمكن تطبيقها على مخاطر تقسيم المرضى مع مرض الشريان التاجي يخضع لعملية رأب الأوعية.

Introduction

تمثل رأب الأوعية التاجية والدعامات إجراء ً إنقاذًا للمرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي (CAD). ومع ذلك، قد تحدث الأحداث القلبية الوعائية السلبية الرئيسية (MACEs)، بما في ذلك موت القلب والأوعية الدموية، واحتشاء عضلة القلب، والإصابة باضطراب الشريان التاجي، ونوبات الذبحة الصدرية أو عدم تعويض فشل القلب، بعد أشهر من التدخل التاجي، مما يؤدي إلى زيارات غير مقررة إلى المستشفى. الـ "مايس" شائعة في جميع أنحاء العالم ومعدل وفياتهم الـ(morbi) مرتفع1.

الإصابة التاجية الدماغية يحفز استجابة الأوعية الدموية في وقت مبكر وآليات التعويض التي تنطوي على تعبئة MPCs بسبب قدرتها التمايز و / أو قدرة الانجيو - الانعكاسي، فضلا عن إنتاج جزيئات قابلة للذوبان مثل جزيئات الالتصاق بين الخلايا (ICAMs)، مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، وأنواع الأكسجين التفاعلية، مما يعكس التصاق الخلية، وإعادة عرض الأنسجة، والإجهاد التأكسدي. على الرغم من أن السمات الوعائية الجوهرية مثل خصائص البلاك وتعقيد الشريان التاجي قد استخدمت للتنبؤ MACEs، وقد اقترحت بعض الدراسات أن المؤشرات الحيوية المتعلقة بآليات الإصابة والإصلاح التي تحدث في بطانة الشريان التاجي يمكن أن تكون مفيدة جدا لتحديد وتشخيص المبكر للأحداث القلب والأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من CAD المقدمة إلى رأب الأوعية التاجية2،3،4،5.

وقد حفز الاهتمام المستمر في فهم الآليات الكامنة وراء إصابة كاد وإصلاح المحققين لدراسة المؤشرات الحيوية تعميم داخل التاجية، وذلك لأن أخذ العينات التاجية أكثر عن كثب يعكس تلف الأوعية الدموية وإصلاح6. ومع ذلك ، فإن توصيف المؤشرات الحيوية التاجية في الدراسات البشرية كان نادرًا7،8،9. ولذلك، كان الغرض من هذه الدراسة لوصف طريقة لتحديد كمية MPCs تعميم التاجية والجزيئات القابلة للذوبان، مما يعكس كل من إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها، وتبين ما إذا كانت هذه المؤشرات الحيوية ترتبط مع MACEs والتشخيص السريري لمرضى CAD التي خضعت لعملية رأب الأوعية التاجية. وتستند هذه الطريقة إلى استخدام مراكز إدارة الأنسجة المتعددة المؤشرات والمواد المتعددة المؤشرات والجزيئات القابلة للذوبان التي يتم الحصول عليها عن طريق مواقع أخذ العينات الأقرب إلى تلف السفينة. قد يكون مفيدًا أيضًا للدراسات السريرية لنقص التروية في الأطراف السفلية ، والسكتة الدماغية ، والتهاب الأوعية الدموية ، والتجلط الوريدي ، وغيرها من الإصابات التي تنطوي على إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويلبي هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية المؤسسية الواردة في لجنة أخلاقيات البحوث البشرية.

1. تصوير الأوعية التاجية، الموجات فوق الصوتية، وأخذ عينات الدم

  1. طلب معلومات سريرية وديموغرافية أساسية قبل التدخل التاجي. جمع بيانات الفرد: العمر والجنس وحالة التدخين الحالية ومؤشر كتلة الجسم (BMI) وارتفاع ضغط الدم وdyslipidemia ومرض السكري والأدوية ، والإشارة إلى تصوير الأوعية التاجية الحالي.
  2. إجراء تصوير الأوعية التاجية من خلال قسطرة القلب باستخدام نهج شعاعي. يجب إجراء هذا الإجراء تحت دليل تنظير الفلور في غرفة الهيموديناميك من قبل أطباء القلب الخبراء.
    ملاحظة: تحديد السفن القيمة. بالنسبة لهذه الدراسة، تم تعريف الأوعية القيّمة على أنها شرايين ذات أقسام أكبر من 1.5 مم وتنسل التجويف أكثر من 50٪.
  3. تقدم القسطرة الموجات فوق الصوتية داخل الأوعية الدموية إلى المنطقة ذات الاهتمام وتسجيل الصور. استخدام البرمجيات المناسبة لتحديد وقياس أصغر منطقة مضيئة.
  4. استخدم قسطرة تاجية لجمع 10 مل من الدم من أقرب موقع إلى البلاك.
  5. بعد خروج المريض، قم بجدولة التقييمات الطبية الدورية لمتابعة نقاط نهاية الدراسة. إذا تعذر الاتصال الهاتفي أو تأخرت زيارة الطبيب لأكثر من شهرين، اطلب من شخص معتمد (تم تصميمه مسبقًا) التحقق من نقاط نهاية الدراسة.
    ملاحظة: النظر في أي من ما يلي MACE: 1) وفاة القلب والأوعية الدموية، 2) احتشاء عضلة القلب جديدة، 3) الذبحة الصدرية غير المستقرة مما دفع زيارة طبية غير مقررة في غضون 24 ساعة، 4) الدعامة كما يتضح من تصوير الأوعية التاجية، 5) حلقات من decompensateed فشل القلب التي تتطلب الاهتمام السريري.

2. تحديد MPCs المتداولة(الشكل 2)

  1. معالجة الدم في غضون 1 ساعة من جمع. نقل 6 مل من الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتمييع 1:1 (v/v) مع 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS)، درجة الحموضة = 7.4.
  2. أضف 2 مل من متوسط تدرج الكثافة إلى ثلاثة أنابيب اختبار. نقل بعناية ثلاثة aliquots حجم متساو من الدم المخفف في كل أنبوب اختبار يحتوي على متوسط التدرج الكثافة.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي للكثافة المتوسطة التدرج ية والدم المخفف ثلاثة أرباع القدرة القصوى لأنبوب الاختبار.
  3. الطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة نقل الفرقة في واجهة بين الطبقات إلى أنبوب جديد. إضافة 2 مل من PBS والطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 6 دقيقة. سوف بيليه تحتوي على MPCs.
  4. غسل بيليه عدة مرات. استشير قبالة الحل السابق وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني جديد. بالنسبة للعمليات اللاحقة، جهاز الطرد المركزي عند 1800 × ز، 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. كرر العملية 6x.
  5. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني. مزيج 20 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 0.4٪ trypan الأزرق، مخففة 1:1 (v/v). تطبيق قطرة على مقياس الهيموكيتومتر وحساب الخلايا غير الملطخة تحت المجهر الخفيف.
  6. انتقل إلى تحديد MPCs. تسمية 5 مل تدفق أنابيب القياس الخلايا وaliquot من 1 × 106 خلايا لكل أنبوب. إعداد الأجسام المضادة للتحكم المطابق للتحكم المتطابقة مع isotype. الطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 6 دقيقة وتجاهل supernatant.
  7. أضف الجسم المضاد الأولي المخفف في 100 ميكرولتر من محلول حضانة الأجسام المضادة يتكون من 1x PBS (درجة الحموضة = 7.4) ، 2 mM حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ، و0.05٪ من الزلال المصل البقري (BSA). إعادة تعليق لمدة 10 ق واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية، وخفيفة المحمية. قد يكون البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة عن طريق تحديد الخلايا الليمفاوية في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني وتخزين عينات تصل إلى 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: كانت التركيزات النهائية للأجسام المضادة الأولية المستخدمة في البروتوكول الحالي CD45 1:50، CD34 1:20، KDR 1:50، CD184 1:20، CD133 1:50.
  8. الطرد المركزي في 1800 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة والتخلص من supernatant. إعادة تعليق في 500 ميكرولتر من 1x PBS (درجة الحموضة = 7.4)، 2 MM EDTA.
  9. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. استخدم الأجسام المضادة للتحكم المتطابقة مع المطابقة مع isotype لإعداد تلطيخ الخلفية. ثم، حدد الخلايا الليمفاوية تنتشر في مؤامرة FSC / SSC، في محاولة لاستبعاد الحبيبات المتبقية، والحطام الخلوي، والجسيمات الأخرى، والتي تقع عادة في الأسفل، اليسار وزعت في المؤامرة. ويعتبر هذا التوزيع بنسبة 100 في المائة.
  10. استخدام بوابة تحتوي على عدد كبير من الخلايا مع النمط المناعي المشترك CD45+ و CD34+. لأنماط المناعة الإيجابية المزدوجة، استخدم بوابة تحدد سابقا CD45+، CD34+، مع إضافة إما KDR (VEGFR-2)+، CD133+، أو CD184+. تحديد التجمعات الفرعية للجنة السياسة النقدية من خلال علامات سطح الخلية المحددة الخاصة بها. الإبلاغ عن النسبة المئوية للأحداث المسورة.
  11. تحديد الفئات السكانية الفرعية الرئيسية للمراكز الاستراتيجية. في هذه الدراسة كانت أنواع المناعة الرئيسية CD45+CD34+CD133+، CD45+CD34+CD184+CD45+CD34+CD133+CD184+، CD45+CD34 +CD34+CD34 + CD34 + CD34+CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CD34 + CDDR + CD184.
    ملاحظة: كانت علامات سطح الخلية المستخدمة CD45 (الخلايا الليمفاوية)، CD34 (الخلايا البطانة و/أو الأوعية الدموية)، KDR (VEGFR-2، علامة غشاء الخلايا البطانة)، CD133 (الخلايا السلف البطانة)، وCD184 (الخلايا الجذعية الدموية والخلايا البطانة).

3. تحديد المؤشرات الحيوية للذوبان البلازما

  1. استخدم جهاز ًا مناعيًا مرتبطًا بالإنزيم (ELISA) لتحديد تركيز SICAM-1 و MMP-9(الشكل 3، الصف العلوي).
    1. الطرد المركزي عينات الدم في 3000 × ز، ودرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة وجمع البلازما.
    2. تسمية المعايير، وأنابيب العينة، وأنابيب التحكم. اربط الآبار المغلفة مسبقًا في لوحة العرافة عن طريق غسل 2x مع مخزن الغسيل المنصوص عليه في مجموعة ELISA.
    3. نقل المعايير والعينات والضوابط إلى الآبار. ختم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: لا تدع الآبار تجف تماما.
    4. تجاهل المحتويات وإضافة الأجسام المضادة للكشف عن البيوتين. ختم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. تجاهل المحتويات وغسل 3x. ختم البلاك واحتضان بالتتابع مع حل العمل ستربتافيدين تليها الركيزة tetramethylbenzidine في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والضوء المحمية. غسل 3x بين الحاضنات. عندما يتطور اللون، أضف حل الإيقاف، واقرأ امتصاص الكثافة البصرية في قارئ ELISA بلوحة دقيقة.
  2. استخدم مُقايسة متعددة المكونات المغناطيسية للتحديد على تركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) وinterleukin 1 بيتا (IL-1β)(الشكل 3،الصف السفلي).
    1. تسمية المعايير، وأنابيب العينة، وأنابيب التحكم.
    2. دوامة قوارير الخرز المغناطيسي لمدة 30 s. نقل تعليق حبة إلى أنابيب الحجم المناسب، ومن ثم إلى الآبار في لوحة اختبار متعددة. دوامة دورية يتجنب هطول الأمطار من الخرز.
    3. أدخل بشكل آمن المعقم المغناطيسي للصفيحة اليدوية. الانتظار 2 دقيقة للحبات تتراكم على الجزء السفلي من كل بئر وقلب بسرعة كل من الغسيل لوحة المغناطيسي باليد والتجميع لوحة، على بالوعة أو حاوية النفايات. تذكر استخدام الصحن المغناطيسي باليد السّاكر داخل الآبار.
    4. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة غسل في كل بئر وانتظر 30 ق للسماح للحبات تتراكم في الجزء السفلي. تجاهل المحتويات كما في الخطوة 3.2.3. ثم أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص العالمي (المنصوص عليه في المجموعة) متبوعاً بـ 25 ميكرولتر من المعايير المعدة والعينات والضوابط.
    5. ختم لوحة واحتضان لمدة 60 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، والضوء المحمية، مع اهتزاز مستمر في 500 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك، احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، والضوء المحمية، مع اهتزاز مستمر في 500 دورة في الدقيقة إذا كان ذلك ممكنا.
    6. غسل 2x عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من العازلة غسل وانتظر 30 s. تجاهل محتويات عن طريق إدراج غسالة لوحة مغناطيسية باليد. الانتظار 2 دقيقة وعكس أكثر من بالوعة أو حاوية النفايات.
    7. احتضان بالتتابع مع 25 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة للكشف متبوعاً بـ 25 ميكرولتر من محلول ستريبتفيفيالدين-PE في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، مختومة ومحمية بالضوء، مع اهتزاز مستمر عند 500 دورة في الدقيقة. غسل 2x بين الحاضنات، كما هو موضح في الخطوة 3.2.6.
    8. الحصول على القراءات. إضافة 120 ميكرولتر من ذاكرة القراءة المؤقتة. ختم لوحة واحتضان 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والضوء المحمية، مع اهتزاز مستمر في 500 دورة في الدقيقة. تشغيل القراءة على قارئ معين متعدد الإرسال. ضبط معلمات القراءة وفقا لكل analyte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم جمع الشريان التاجي والجيوب الأنفية والوريد والدم المحيطي من 52 مريضًا خضعوا لتصوير الأوعية التاجية(الشكل 1)وأظهر وارتفعت نسبة انتشار ارتفاع ضغط الدم وdyslipidemia. في المتابعة السريرية، 11 (21.1%) حدث MACEs بعد 6 أشهر من تصوير الأوعية التاجية: الوفاة (n = 1) ، والذبحة الصدرية التي تتطلب حضور المستشفى (n = 6) ، واحتشاء عضلة القلب (n = 2) ، و / أو دليل على فشل القلب (n = 4).

وكان تركيز الشريان التاجي الأساسي لمعظم MPCs أقل بكثير في المرضى الذين طوروا MACEs(الشكل 4)، مع انخفاض أكبر في السكان الفرعيين للجنة السياسة النقدية والنقدية CD34+CD133+ وCD45+CD34+CD133+CD184+. وبالمثل ، كان المرضى الذين طوروا MACEs خط أساس متزايد في كميات الشريان التاجي من sICAM-1 وانخفاض MMP-9(الجدول 1).

MPCs التاجية (subpopulations CD45+CD34+CD133+ وCD45+CD34+CD133+CD184+)وsICAM-1 (ثنائي من قيمها الوسيطة) أظهرت القدرة التكهنية للبقاء على قيد الحياة خالية من MACE(الشكل 5).

كما تميزنا ديناميات المؤشرات الحيوية القابلة للذوبان في ظل ظروف مختلفة، لأن هناك القليل جدا من المعلومات المتعلقة بتحديد الدم التاجي. أظهر تعبير عامل نخر الورم ألفا (TNFα) اختلافات وفقًا لوقت القياس (ما قبل أو بعد رأب الأوعية) وموقع أخذ العينات التاجية استنادًا إلى مقارنة مناطق التجويف المختلفة في نفس الشريان التاجي باستخدام الموجات فوق الصوتية داخل الأوعية الدموية(الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: تصوير الأوعية التاجية وجمع الدم. تُظهر الصورة قسطرة القلب باستخدام نهج شعاعي، يتم إجراؤه تحت دليل تنظير الفلور في غرفة الهيموديناميك. يقوم خبراء أمراض القلب بتقييم الأوعية التاجية أثناء تصوير الأوعية ويجمعون الدم التاجي من أقرب موقع إلى البلاك الأذيروما و / أو دم الجيوب الأنفية من خلال قسطرة القلب قبل رأب الأوعية بالمنطاد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد عينة الدم وتحديد MPCs عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ)تدرج الكثافة بعد الطرد المركزي للدم (السهم الأزرق = الفرقة اللمفاوية). (ب)جمع مرحلة الخلايا اللمفاوية. (ج)يُسَسَل َبَلَمَ1x PBS. (د)الطرد المركزي. (E)تشكيل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الاختبار. (واو)Neubauer تحميل تعليق الخلية. (G)عدد خلايا الخلايا اللمفاوية باستخدام المجهر الخفيف. (H)تحديد الفئات السكانية الفرعية للخلايا حسب قياس التدفق الخلوي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المناعة لتحديد الوسطاء القابلة للذوبان في الدم. الصف العلوي: الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). توضح الصورة كيفية نقل المعلومات من عينات الخريطة (دفتر الملاحظات) إلى البرنامج لبدء القراءات بعد إعداد العينة ، واحتضان الأجسام المضادة ، والسُمع. كما يظهر تطور اللون الأصفر ، إما في الآبار القياسية (الأعمدة اليسرى في اللوحة) أو في عينات الاختبار (الأعمدة اليمنى في اللوحة). الصف السفلي: اختبار متعدد المناعة المغناطيسي. بعد إعداد العينة ، واحتضان الأجسام المضادة للعنابة المغناطيسية ، والسُل ، تم نقل معلومات العينة إلى برنامج قارئ نظام القياس المغناطيسي المتعدد المناسب ، ويظهر منحنى قياسي نموذجي في الشاشة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خلايا السلف أحادية النواة المتداولة في الشريان التاجي. ويبين الشكل الفئات السكانية الفرعية لـ %MPCs الأساسية. (أ)قراءات تمثيلية من قياس التدفق الخلوي. (ب)القياس الكمي للمجموعات الفرعية من MPCs %مع قياس التدفق الخلوي ، المرسوم وفقًا لعرض MACEs (*) = فرق كبير ، مع p < 0.05. وقد عُدل هذا الرقم من سواريز - كوينكاوآخرين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الشريان التاجي تعميم الخلوية (MPCs)، والمؤشرات الحيوية القابلة للذوبان والتكهن. ويبين الشكل كميات الدم التاجية الأساسية من(A)%MPCs الفئات السكانية الفرعية التي يحددها قياس التدفق الخلوي و(B)تركيز البلازما من sICAM-1 التي تحددها ELISA، وكلاهما رسم وفقا لعرض MACEs خلال 6 أشهر المتابعة. يشير الخط الأزرق إلى عدد الأفراد الذين يعانون من قيم مخاطر لكل علامة بيولوجية، مثل %MPCs الأقل أو أعلى sICAM-1. sICAM-1 = الالتصاق القابلة للذوبان بين الخلايا جزيء 1. وقد عُدل هذا الرقم من سواريز - كوينكا، وآخرون10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الظروف التي تحدد تقلب المؤشرات الحيوية القابلة للذوبان المتداولة في الشريان التاجي. يوضح الشكل التغيرات في التركيز داخل التاجية لعامل نخر الورم ألفا (TNFα) ، وفقًا لوقت القياس(A: Pre-angiolasty أو B: ما بعد رأب الأوعية) وكذلك موقع أخذ العينات التاجية (المقارنة بين أقطار تجويف الشريان التاجي عند قطع 3.5 مم ، يقاس بالموجات فوق الصوتية داخل الأوعية الدموية). (*) = p < 0.05 الفرق بين المؤشرات الحيوية التي تم الحصول عليها قبل مقابل ما بعد رأب الأوعية، وفرق أخذ العينات في مواقع أقطار التجويف التاجي ≤ 3.5 مم مقابل أكثر من 3.5 مم. وقد عُدل هذا الرقم من سواريز -كوينكا وآخرين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Table 1
الجدول 1: المؤشرات الحيوية الأساسية القابلة للذوبان في الدم. (*) يشير إلى p < 0.05 المؤشرات الحيوية الفرق من الدم التاجي مقابل الدورة الدموية الطرفية. (**) يشير إلى p < 0.05، دون MACEs مقابل مع MACEs؛ واحد الذيل المستقل تي اختبار. الاختصارات: sICAM-1 = الالتصاق البيني القابل للذوبان جزيء 1; IL-1α = إنترلوكين 1 بيتا; MMP-9 = مصفوفة metalloproteinasase 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قد يكون جمع الدم من الشريان التاجي المصاب أمرًا صعبًا. في بعض الأحيان، الشريان التاجي بالكاد يمكن الوصول إليها. في هذه الحالة ، قد يكون أخذ العينات من الجيوب الأنفية الوفيدية بديلاً. قمنا بإجراء اختبارات التحقق من الصحة مقارنة المؤشرات الحيوية المتداولة في الشريان التاجي مقابل الجيوب الأنفية الوفية، مع عدم وجود اختلافات كبيرة. ومع ذلك، تم التحقق من أداء المؤشرات الحيوية المتداولة فقط لأخذ العينات التاجية. لذلك ، لا يزال يتعين استكشاف أداء المؤشرات الحيوية التي تم الحصول عليها من الجيوب الأنفية الوفيدية.

فمن الأفضل لمعالجة العينات لMPCs ضمن أول 3 ساعة بعد جمع الدم. لذلك ، يجب إقامة اتصال جيد بين فريق أمراض القلب والباحثين في المختبر. أثناء عزل MPCs ، يجب توخي الحذر عند إيداع عينات الدم أثناء إعداد تدرج الكثافة عند غسل بيليه MPCs. وأخيرا، للراحة، ونحن دائما نقل الخلايا إلى أنبوب القياس الخلوي، إضافة الأجسام المضادة الأولية، وإصلاح وتخزين الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، وتنفيذ تدفق القراءة الخلوي في اليوم التالي. فيما يتعلق بدور المؤشرات الحيوية لMPCs المتداولة ، تم بذل جهود مهمة لتوحيد أكثر أنواع المناعة فائدة سريرياً بين خلايا السلف12، ولكن قد يكون أحد قيود الدراسة هو حقيقة أن مجموعات فرعية محددة من خلايا السلف المتداولة لم يتم توصيفها بشكل كامل لجميع السيناريوهات السريرية داخل CAD أو أمراض الأوعية الدموية الأخرى. لذلك ، يجب استكشاف مختلف الفئات الفرعية لخلايا السلف المتداولة في كل دراسة.

خلال تحديد علامات قابلة للذوبان بعض التوصيات العامة لELISA ومتعددة المقالات تشمل استخدام ماصة متعددة القنوات، وإيداع الحلول في الجزء السفلي من كل بئر دون لمس الجدران الجانبية، وتجنب تجفيف من الآبار خلال فترة الاسبلي. تحقق دائمًا من توزيع العينة في اللوحة ، خاصة بالنسبة للفحص المتعدد ، لتجنب هطول الأمطار للحبات المغناطيسية عن طريق الدوامة المستمرة. أيضا، تأكد من إدراج لوحة أسفل في السبال لوحة المغناطيسي باليد للحفاظ على الخرز المغناطيسي داخل الآبار، وإلا سيتم فقدان العينات أثناء السهو.

وجدنا أن MPCs تعميم الشريان التاجي، وأساسا تلك من أصل الهيماتوبويتي، وكذلك sICAM-1 وMMP-9، كانت المؤشرات الحيوية المعلقة للتنبؤ والتكهن من MACEs. وهذا يتسق مع فكرة أن الاستجابة الالتهابية و / أو وسطاء تلف الأوعية الدموية يحفزون إشارات التوجيه لتعبئة لجنة السياسة النقدية والتجنيد ، وتعزيز إصلاح الأنسجة المحلية4. وبناء على ذلك، وجدنا اختلافات في هذه المؤشرات الحيوية في العديد من الإعدادات. يمكن تفسير التغيرات المتعلقة برأب الأوعية و / أو موقع أخذ العينات التاجية بتأثير التأثير على البلاك الأرروما أثناء رأب الأوعية ، وحجم البلاك ، وإطلاق الوسطاء القابلين للذوبان المعزولين داخل البلاك في التدفق التاجي11. وقد زادت IL-1β تشارك باستمرار في تطوير البلاك والمضاعفات السريرية13.

على حد علمنا، هذه هي الدراسة الأولى التي تقيّم في المستقبل دور MPCs تعميم التاجية والوسطاء القابلة للذوبان من إصابات الأوعية الدموية وإصلاحك المؤشرات الحيوية التنبؤية في السكان مع CAD المقدمة إلى رأب الأوعية التاجية، بما في ذلك توصيف التغيرات المتعلقة برأب الأوعية، وموقع أخذ العينات التاجية، ومقارنة أخذ العينات التاجية مقابل الطرفية. ونحن نعتقد أن الطريقة يمكن أن تنشأ بسهولة في أي مستشفى إجراء تصوير الأوعية التاجية. ومع ذلك ، فإن أحد القيود هو أننا طبقنا هذه المنهجية بشكل رئيسي في المرضى الذين يعانون من الذبحة الصدرية المستقرة المزمنة الصادرة من قسم غرفة الطوارئ.

الأساليب التقليدية الحالية المستخدمة للتنبؤ MACEs أو التكهن في كندي لديها قدرة تنبؤية معتدلة. كان هناك قدر متزايد من الاهتمام في العثور على المؤشرات الحيوية الجديدة على أساس آليات الفيزيولوجيا المرضية المسؤولة عن الإصلاح والتجدد التي تحدث بعد CAD ورأب الأوعية. وقد أظهرت هذه المؤشرات الحيوية أداء تنبؤي مماثل أو أفضل بالمقارنة مع الأساليب التقليدية3،4،5،14،15. وبالتالي، نعتقد أن دور الشركات المساهمة في الشرايين التاجية ووسطاء قابلين للذوبان في التنبؤ بالمخاطر التي تتعرض لها هذه المراكز سيتم استكشافه في الدراسات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون دعم البرنامج المؤسسي E015؛ وفوندو قطاعي FOSSIS-CONACYT، SALUD-2014-1-233947.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Roche 10735086001 Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads Miltenyi Biotec / MACS #130-093-607 MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE Milteny Biotec / MACS #130-080-801 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 Miltenyi Biotec / MACS #130-103-798 Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC Miltenyi Biotec / MACS #130-093-601 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC Miltenyi Biotec / MACS #130-081-001 The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue Miltenyi Biotec / MACS #130-092-880 Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes Thermo SCIENTIFIC #339651 15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes FALCON Corning Brand #352052 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA BIO-RAD #161-0729 Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer Without brand Without catalog number Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes BD Vacutainer #367863 Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep Stemcell Technologies 01-63-12-002-A Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH #SZBF0920V Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL CRM Globe PF1016, PF1015 The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes KIMBLE CHASE 45060 13100 Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cassar, A., Holmes, D. R. Jr, Rihal, C. S., Gersh, B. J. Chronic coronary artery disease: diagnosis and management. Mayo Clinic Proceedings. 84 (12), 1130-1146 (2009).
  2. Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
  3. Sen, S., McDonald, S. P., Coates, P. T., Bonder, C. S. Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease. Clinical Science (Lond). 120 (7), 263-283 (2011).
  4. Samman Tahhan, A., et al. Progenitor Cells and Clinical Outcomes in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation Research. 122 (11), 1565-1575 (2018).
  5. Tomulić, V., Gobić, D., Lulić, D., Židan, D., Zaputović, L. Soluble adhesion molecules in patients with acute coronary syndrome after percutaneous coronary intervention with drug-coated balloon, drug-eluting stent or bare metal stent. Medical Hypotheses. 95, 20-23 (2016).
  6. Jaumdally, R., Varma, C., Macfadyen, R. J., Lip, G. Y. Coronary sinus blood sampling: an insight into local cardiac pathophysiology and treatment? European Heart Journal. 28 (8), 929-940 (2007).
  7. Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
  8. Karube, N., et al. Measurement of cytokine levels by coronary sinus blood sampling during cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. American Society for Artificial Internal Organs Journal. 42 (5), M787-M791 (1996).
  9. Truong, Q. A., et al. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
  10. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
  11. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Relation of Coronary Artery Lumen with Baseline, Post-angioplasty Coronary Circulating Pro-Inflammatory Cytokines in Patients with Coronary Artery Disease. Angiology Open Access. 7, 01 (2019).
  12. Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), e13790 (2010).
  13. Moyer, C. F., Sajuthi, D., Tulli, H., Williams, J. K. Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis. American Journal of Pathology. 138 (4), 951-960 (1991).
  14. Morales-Portano, J. D., et al. Echocardiographic measurements of epicardial adipose tissue and comparative ability to predict adverse cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease. International Journal of Cardiovascular Imaging. 34 (9), 1429-1437 (2018).
  15. Huang, X., et al. Endothelial progenitor cells correlated with oxidative stress after mild traumatic brain injury. Yonsei Medical Journal. 58 (5), 1012-1017 (2017).

Tags

الطب، العدد 155، MPCs تعميم الشريان التاجي، المؤشرات الحيوية القابلة للذوبان، sICAM-1، MMP-9، malondialdehyde، SOD، تشخيص القلب والأوعية الدموية، MACEs
خلايا بروجكتور التاجية والمؤشرات الحيوية القابلة للذوبان في تشخيص القلب والأوعية الدموية بعد رأب الأوعية التاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suárez-Cuenca, J. A.,… More

Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter