Summary
严重不良心血管事件的发展，影响冠状血管后心血管预后，受冠状动脉损伤和血管修复程度的影响。使用新型冠状细胞和可溶性生物标志物，对血管损伤和修复反应，有助于预测MACEs的发展和预后。
Abstract
重大心血管不良事件 （MACEs） 对冠状血管化患者的心血管预后产生负面影响，因为冠状缺血损伤。冠状动脉损伤的程度和血管修复机制是影响MACEs未来发展的因素。内血管特征，如斑块特征和冠状动脉复杂性已证明MACEs的预后信息。然而，冠状动脉内循环生物标志物的使用已被假定为早期识别和预后MACE的一种方便方法，因为它们更密切地反映了涉及冠状动脉损伤和修复的动态机制。血管成形术期间冠状循环生物标志物的测定，如单核祖细胞（MPCs）的亚种群数量，以及反映炎症、细胞粘附和修复的可溶性分子的浓度，允许评估未来的发展和MACEs的预后6个月冠状血管性血管性。该方法的转化性与外周血液循环生物标志物相比，在预测MACEs方面性能更好，对心血管预后的影响，可应用于患者的风险分层冠状动脉疾病经历血管性。
Introduction
冠状血管化和支架是冠状动脉疾病 （CAD） 患者的抢救程序。然而，重大心血管不良事件（MACEs），包括心血管死亡、心肌梗死、冠状动脉恢复症和心绞痛发作或心力衰竭，可能在冠状动脉介入后数月发生，导致不定期到医院就诊。MACEs在全世界很普遍，其死亡率很高。
冠状缺血损伤诱导早期血管反应和重组机制，涉及动员MPC由于其分化能力和/或血管抑制电位，以及可溶性分子，如细胞间粘附分子（ICAM），基质金属蛋白酶（MMPs）和反应氧物种，反映细胞粘附，组织重塑和氧化应激。虽然内在血管特征，如斑块特征和冠状动脉复杂性已经被用来预测MACEs，一些研究表明，与冠状内皮发生损伤和修复机制相关的生物标志物对于CAD提交冠状血管成形的2、3、4、5患者的心血管事件的早期识别和预后非常有用。
持续的兴趣，了解CAD损伤和修复背后的机制，促使研究者研究冠状循环生物标志物，因为冠状动脉取样更密切地反映血管损伤和修复6。然而，在人类研究中，冠状生物标志物的表征一直很少，7、8、9。因此，本研究的目的是描述一种确定冠状循环MPC和可溶性分子的量的方法，反映血管损伤和修复，并表明这些生物标志物是否与MACE和接受冠状血管化的CAD患者的临床预后有关。该方法基于使用血管相关、循环的MpCs和可溶性分子，通过采样最接近血管损伤的位置获得。对于下肢缺血、中风、血管炎、静脉血栓和其他涉及血管损伤和修复的损伤的临床研究，它也可能有用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该协议符合人类研究伦理委员会的体制准则。
1. 冠状血管造影、超声和血液取样
- 在冠状动脉介入之前，请求基线临床和人口统计信息。收集个人数据：年龄、性别、当前吸烟状态、体重指数（BMI）、高血压、血脂异常、糖尿病、药物和当前冠状血管造影指标。
- 使用径向方法通过心脏导管进行冠状血管造影。此程序应在由专家心脏病学家在血管动力学室的荧光镜指导下进行。
注：识别有价值的容器。在本研究中，可评价的血管被定义为截面大于1.5毫米和流明狭窄超过50%的动脉。 - 将血管内超声导管推进到感兴趣的区域并记录图像。使用适当的软件定位和测量最小的发光区域。
- 使用冠状导管从离斑块最近的位置收集10 mL的血液。
- 患者出院后，定期安排医学评估，跟踪研究终点。如果无法进行电话联系或医生访问延迟超过 2 个月，请请求授权人员（以前设计）验证研究端点。
注：考虑以下任何一个MACE：1）心血管死亡，2）新的心肌梗死，3）不稳定的心绞痛促使在24小时内进行计划外的医疗访问，4）支架恢复性，如冠状血管造影所示，5）脱损发作心力衰竭需要临床关注。
2. 循环MpC的确定（图2）
- 从采集到1小时内处理血液。将采集的血液6 mL转移到15 mL锥形管中，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释1：1（v/v），pH = 7.4。
- 将2 mL的密度梯度介质添加到三个试管中。小心地将稀释血液的三个等量等分分转移到每个含有密度梯度介质的试管中。
注：密度梯度介质和稀释血液的总体积不应超过试管最大容量的四分之三。 - 在1，800 x g，4°C下离心30分钟。将层之间的界面上的带子转移到新管中。在1，800 x g下加入2 mL的PBS和离心机，4°C6分钟。颗粒将包含 MpC。
- 洗过几次小球。吸出以前的溶液，在新鲜的PBS中轻轻重新悬浮细胞颗粒。对于后续的施水，在1，800 x g，4°C下离心2分钟。 重复这个过程6倍。
- 在PBS的1mL中重新悬浮细胞颗粒。将细胞悬浮液的20 μL与0.4%试盘蓝色混合，稀释1：1（v/v）。在光显微镜下将滴片涂在血细胞仪上，并计算未染色的细胞。
- 继续确定 MpC。标记 5 mL 流式细胞测定管，每管 1 x 106个细胞分分。准备相应的等型匹配对照抗体。在1，800 x g，4°C下离心6分钟，并丢弃上清液。
- 加入在100μL中稀释的抗体孵育溶液中的初级抗体，包括1xPBS（pH = 7.4）、2 mM乙烯二甲酸乙酸（EDTA）和0.05%牛血清白蛋白（BSA）。重新悬浮10秒，在4°C下孵育20分钟，防光。该协议可以在此步骤中暂停，将淋巴细胞固定在PBS中的4%甲醛中，并在4°C下储存至24小时的样品。
注：本协议中使用的主要抗体的最终浓度为CD45 1：50、CD34 1：20、KDR 1：50、CD184 1：20、CD133 1：50。 - 在1，800 x g，4°C下离心2分钟，并丢弃上清液。在 500 μL 的 1x PBS （pH = 7.4），2 mM EDTA 中重新悬浮。
- 执行流式细胞测定分析。使用等型匹配控制抗体设置背景染色。然后，选择在 FSC/SSC 图处传播的淋巴细胞，试图排除残留的粒细胞、细胞碎片和其他颗粒，这些颗粒通常位于图中左下分布的较低位置。这种分布被视为 100%。
- 使用包含大量具有常见免疫表型 CD45+和 CD34+的细胞的门。对于双阳性免疫表型，使用以前识别 CD45 的门[， CD34]， 并添加 KDR （VEGFR-2）+CD133+或 CD184+.通过特定的细胞表面标记识别 MPC 子群体。以封闭事件的百分比进行报告。
- 确定 MpC 的主要子群体。在本研究中，主要免疫机型是CD45+CD34+CD133+CD45+CD34+CD34+CD44 + CD34+ CD133+CD134 + CD45+CD34+CD44+CD44 + CD184。
注：使用的细胞表面标记物为CD45（淋巴细胞）、CD34（内皮和/或血管细胞）、KDR（VEGFR-2、内皮细胞膜标记）、CD133（内皮祖细胞）和CD184（造血干细胞和内皮细胞）。
3. 等离子体可溶性生物标志物的测定
- 使用酶连结免疫吸附测定（ELISA）确定SICAM-1和MMP-9的浓度（图3，上行）。
- 在3000 x g下将血液样本离心，室温5分钟，并收集血浆。
- 标记标准、样品管和控制管。使用 ELISA 套件中提供的洗涤缓冲液将预涂孔与洗涤板中的预涂孔进行平衡。
- 将标准、样品和控制转移到井中。密封并在37°C孵育90分钟。
注意：不要让井完全干燥。 - 丢弃内容物并添加生物锡检测抗体。密封并在37°C孵育60分钟。
- 丢弃内容物并洗 3x。用链球菌工作溶液密封斑块并按顺序孵育，随后在37°C下使用四甲基苯丙胺基质30分钟，防光。在孵育之间洗涤3倍。当颜色发展时，添加停止溶液，并在微孔板 ELISA 读取器中读取光学密度吸收。
- 使用免疫磁多路复用测定确定肿瘤坏死因子α（TNF+）和白细胞介素1β（IL-1+）的浓度（图3，下行）。
- 标记标准、样品管和控制管。
- 将磁珠小瓶涡流30s.将珠子悬浮液转移到适当尺寸的管子上，然后转移到多路复用检测板中的孔。周期性涡旋可避免珠子的沉淀。
- 牢固地插入手持磁性板垫片。等待 2 分钟，让珠子积聚在每个井的底部，并迅速将手持磁板处理器和板组件倒置，放在水槽或废物容器上。切记使用手持磁板器维护井内的珠子。
- 将150 μL的洗涤缓冲液加入每个井中，等待30s，让珠子在底部积聚。如步骤 3.2.3 中的内容的那样丢弃。然后，加入25μL的通用测定缓冲液（在试剂盒中提供），然后加入25μL的制备标准、样品和控制。
- 密封板并在室温下孵育至少 60 分钟，防光，在 500 rpm 时持续摇动。或者，在4°C下孵育过夜，防光，如果可能，在500rpm下持续摇动。
- 加入150μL的洗涤缓冲液洗涤2次，等待30s。通过插入手持磁盘清洗器丢弃内容物。等待 2 分钟，在水槽或废物容器上反转。
- 在室温下连续孵育25μL检测抗体混合物，然后25μL的链球菌-PE溶液在室温下孵育30分钟，密封和防光，在500rpm时持续摇动。如步骤 3.2.6 所述，在孵育之间洗涤 2 倍。
- 获取读数。添加 120 μL 的读取缓冲液。密封板并在室温下孵育 5 分钟，防光，在 500 rpm 时持续摇动。在多路复用测定读取器上运行读数。根据每个解毒剂调整读数参数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
从52名接受冠状血管造影的患者中采集冠状、静脉坐宗和外周血（图1），显示高血压和血脂异常的高患病率。在临床随访中，11 （21.1%）在冠状血管造影术发生6个月后，MACEs：死亡（n = 1），需要住院治疗的心绞痛（n = 6），心肌梗死（n = 2），和/或心力衰竭的证据（n = 4）。
大多数MPC的基线冠状动脉浓度在开发MACEs的患者中显著较低（图4），MPC亚群CD34+ CD133+和CD45+CD34+CD133+CD184+较大下降。同样，开发 MACEs 的患者在冠状动脉量 sICAM-1 和较低 MMP-9 （表 1 ）的基线增加。
冠状MpC（亚群CD45+ CD34+CD133+和CD45+CD34+CD133 + CD133+CD184+） 和sICAM-1（按其中值计算）显示了无 MACE 生存的预后能力（图 5）。
我们进一步描述了不同条件下可溶性生物标志物的动态，因为关于冠状血液测定的信息很少。肿瘤坏死因子α（TNF+）的表达根据测量时间（血管前或血管后分形术）和冠状动脉取样的位置变化，基于使用血管内超声对同一冠状动脉不同流明区域的比较（图6）。
图1：冠状血管造影和血液采集。该图显示了在流体动力学室的荧光镜导引指导下使用径向方法进行的心脏导管插入。心脏病专家评估血管血管血管血管血管血管血管血管，并在气球血管化前通过心脏导管从最接近的动脉瘤斑块和/或正心血收集冠状动脉血液。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：血液样本制备和通过流动细胞测定的MpCs。（A） 血液离心后的密度梯度（蓝色箭头 = 淋巴细胞带）。（B） 淋巴细胞阶段的收集。（C） 用 1x PBS 进行处理。（D） 离心。（E） 试管底部的球形形成.（F） 诺伊鲍尔细胞悬架负载.（G） 使用光显微镜计算淋巴细胞细胞计数。（H） 通过流动细胞测定测定细胞亚群。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：免疫测定以确定血液可溶性介质。上行：酶相关免疫吸附测定（ELISA）。该图显示了地图样本（笔记本）中的信息如何传输到软件，以在样品制备、抗体孵化和沐瓦后开始读取读数。它还在标准井（斑块中的左柱）或测试样品（斑块中的右柱）中显示黄色发展。下排：免疫磁多路复用测定。样品制备、磁珠抗体孵育和处理后，将样品信息传输到相应的免疫磁多路复用检测系统读取器软件，屏幕中显示典型的标准曲线。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：冠状循环单核祖细胞（MpCs）。下图显示了基线 %MpC 子种群。（A） 流式细胞仪的代表性读数.（B） %MpCs 亚群的定量与流式细胞测定，根据 MACEs 的表示 （*） = 显著差异绘制，p < 0.05。这一数字已由苏亚雷斯-昆卡等人10日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：冠状循环细胞（MPCs）、可溶性生物标志物和预后。图中显示了由流细胞测定和（B）血浆浓度由ELISA测定的（A）%MPCs亚群的基线冠状血量，这两种血量均根据6个月随访中的MACE的呈现绘制。蓝线指示每个生物标志物具有风险值的个体数量，例如较低的 %MPC 或更高的 sICAM-1。sICAM-1 = 可溶性细胞间粘附分子1。这一数字已由苏亚雷斯-昆卡等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：确定冠状循环可溶性生物标志物变异性的条件。图中显示了肿瘤坏死因子α（TNF®）冠状体内浓度的变化，根据测量时间（A：血管前成形术或B：血管成形后）以及冠状动脉取样的位置（在3.5mm截止处比较两个冠状流明直径，由血管内超声测量）。（*） = p < 0.05 获得的生物标志物在血管后分形后，以及冠状流明直径位置的采样差异 ±3.5 mm 与 >3.5 mm。这一数字已由苏亚雷斯-昆卡等人第11条修改。请点击此处查看此图的较大版本。
表1：基线血液可溶性生物标志物。（*） 表示 p < 0.05 来自冠状动脉血液的生物标志物与外周循环。（*） 表示 p < 0.05，没有 MACEs 与 MACEs;单尾独立T测试。缩写：sICAM-1 = 可溶性细胞间粘附分子1;IL-1+= 白细胞介素 1 贝塔;MMP-9 = 基质金属蛋白酶 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从受影响的冠状动脉采集血液可能很困难。有时，冠状动脉几乎无法到达。在这种情况下，从静脉主塞采样可能是一种选择。我们进行了验证测试，比较冠状动脉中的循环生物标志物与静脉阴热，没有显著差异。然而，循环生物标志物的性能只用于冠状动脉取样。因此，从静脉主塞获得的生物标志物的性能仍有待探索。
最好在采血后的前 3 小时内处理 MpC 的样本。因此，心脏病学团队和实验室研究人员之间应该建立良好的沟通。在 MpC 隔离期间，在清洗 MpC 颗粒时，在密度梯度制备过程中沉积血液样本时应小心谨慎。最后，为了方便起见，我们总是将细胞转移到细胞测定管中，添加原抗体，在4°C处整夜固定和储存细胞，并在第二天进行流式细胞测量读数。关于循环MBC的生物标志物作用，已作出重要努力，以规范祖细胞12之间临床上最有用的免疫表型，但研究的一个局限可能是，循环祖细胞的特定亚群尚未在CAD或其他血管疾病的所有临床情景中完全具有特征。因此，应在每项研究中探讨不同的循环祖细胞亚群。
在确定可溶性标记时，ELISA 和多路复用检测的一些一般建议包括使用多通道移液器，将溶液沉积在每个井的底部而不接触侧壁，以及避免干燥。在测定过程中井。始终检查板材中的样品分布，尤其是多路复用测定，以避免磁珠通过恒定涡流沉淀。此外，请确保将底板插入手持磁板垫片，以保持井内的磁珠，否则在打磨过程中样品会丢失。
我们发现，冠状循环MPC，主要是来自造血源的，以及sICAM-1和MMP-9，是预测和预后MACE的优秀生物标志物。这与炎症反应和/或血管损伤中介刺激MPC动员和招募的归能信号，促进局部组织修复4的概念是一致的。因此，我们发现这些生物标志物在几个环境中的变化。与血管成采和/或冠状动脉取样位置有关的变化，可解释为血管成采期间对动脉瘤斑块的影响、斑块的大小以及冠状菌斑内隔离到冠状动脉流动中的可溶性介质的释放。增加IL-1+一直参与斑块和临床并发症的发展13。
据我们所知，这是第一次前瞻性地评估冠状循环MPC和血管损伤的可溶性中介的作用，并作为CAD提交冠状血管成形的人群中的预后生物标志物，包括与血管化、冠状动脉取样位置以及冠状动脉与外周抽样的比较相关的变化特征。我们认为，在进行冠状血管造影的任何医院都可以轻松建立该方法。然而，一个限制是，我们应用这种方法主要在慢性稳定心绞痛患者从急诊室释放。
目前在CAD中用于MACEs预测或预后的传统方法具有适度的预测能力。人们越来越有兴趣根据CAD和血管化后负责修复和再生的病理生理学机制来寻找新的生物标志物。与传统方法3、4、5、14、15相比，这些生物标志物具有相似或更好的预测性能。因此，我们认为，冠状循环MpCs和可溶性介质在预测MACEs风险方面的作用将在未来的前瞻性研究中进一步探讨。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢机构计划E015的支持;和Fondo部门FOSSIS-CONACYT，SALUD-2014-1-233947。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Cassar, A., Holmes, D. R. Jr, Rihal, C. S., Gersh, B. J. Chronic coronary artery disease: diagnosis and management. Mayo Clinic Proceedings. 84 (12), 1130-1146 (2009).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
- Sen, S., McDonald, S. P., Coates, P. T., Bonder, C. S. Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease. Clinical Science (Lond). 120 (7), 263-283 (2011).
- Samman Tahhan, A., et al. Progenitor Cells and Clinical Outcomes in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation Research. 122 (11), 1565-1575 (2018).
- Tomulić, V., Gobić, D., Lulić, D., Židan, D., Zaputović, L. Soluble adhesion molecules in patients with acute coronary syndrome after percutaneous coronary intervention with drug-coated balloon, drug-eluting stent or bare metal stent. Medical Hypotheses. 95, 20-23 (2016).
- Jaumdally, R., Varma, C., Macfadyen, R. J., Lip, G. Y. Coronary sinus blood sampling: an insight into local cardiac pathophysiology and treatment? European Heart Journal. 28 (8), 929-940 (2007).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Karube, N., et al. Measurement of cytokine levels by coronary sinus blood sampling during cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. American Society for Artificial Internal Organs Journal. 42 (5), M787-M791 (1996).
- Truong, Q. A., et al. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Relation of Coronary Artery Lumen with Baseline, Post-angioplasty Coronary Circulating Pro-Inflammatory Cytokines in Patients with Coronary Artery Disease. Angiology Open Access. 7, 01 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), e13790 (2010).
- Moyer, C. F., Sajuthi, D., Tulli, H., Williams, J. K. Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis. American Journal of Pathology. 138 (4), 951-960 (1991).
- Morales-Portano, J. D., et al. Echocardiographic measurements of epicardial adipose tissue and comparative ability to predict adverse cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease. International Journal of Cardiovascular Imaging. 34 (9), 1429-1437 (2018).
- Huang, X., et al. Endothelial progenitor cells correlated with oxidative stress after mild traumatic brain injury. Yonsei Medical Journal. 58 (5), 1012-1017 (2017).
