Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

תאים כליליים ובסמנים מסיסים בפרוגנוזה לב וכלי דם לאחר אנגיופלסטיקה כלילית

Published: January 28, 2020 doi: 10.3791/60504
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1
1Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory & Regenerative Medicine and Tissue Engineering Laboratory, 2Hemodynamics Unit, Cardiology Department, Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE, 3Laboratorio de Biología del Desarrollo y Teratogénesis Experimental, Hospital Infantil de México Federico Gómez

Summary

פיתוח של אירועים משמעותיים וכלי דם לוואי, אשר השפעה פרוגנוזה לב וכלי דם לאחר הניתוח אנגיוקולרי, מושפעים במידה של נזק כלילית ותיקון כלי דם. השימוש בסמנים מסיסים בעלי כלילית תאית ומסיס, מגיב לנזק ולתיקון כלי דם, שימושיים לניבוי התפתחות של MACEs ופרוגנוזה.

Abstract

מייג אירועים שליליים לב וכלי דם (MACEs) השפעה שלילית על הפרוגנוזה לב וכלי דם של חולים שעברו אנגיופלסטיקה כלילית עקב פציעה איסכמי כלילית. היקף הנזק הכלילי ומנגנוני תיקון כלי הדם הם גורמים המשפיעים על התפתחות עתידית של MACEs. תכונות כלי דם פנימיים כמו מאפייני הפלאק ומורכבות עורק כלילית הפגינו מידע התחזיות של MACEs. עם זאת, השימוש בסמנים מחזורי במחזור תאיים כבר היסוד כשיטה נוחה לזיהוי מוקדם הפרוגנוזה של MACEs, כפי שהם יותר קרוב לשקף מנגנונים דינאמיים מעורבים נזק כלילית ותיקון. קביעת כלילית מחזורי הסמנים במהלך הניתוח אנגיופלסטיקה, כגון מספר אוכלוסיות משנה של בתאי מחולל קדמון (MPCs), כמו גם ריכוז של מולקולות מסיסים המשקף דלקת, הדבקה תא, ותיקון, מאפשר הערכה של ההתפתחויות בעתיד ואת הפרוגנוזה של MACEs 6 חודשים לאחר הניתוח אנגיופלסטיקה. שיטה זו מודגשת על ידי הטבע הטרנסג שלה וביצועים טובים יותר מאשר דם היקפי מחזורי ביואריטים לגבי חיזוי של MACEs ואת השפעתו על פרוגנוזה לב וכלי דם, אשר ניתן להחיל על ריבוד סיכון של חולים עם מחלת עורקים בעורק כלילי.

Introduction

אנגיופלסטיקה כלילית והסטטינג מייצגים הליך הצלה עבור חולים עם מחלת עורקים כלילית (CAD). עם זאת, אירועים משמעותיים וכלי דם שליליים (MACEs), כולל מוות לב וכלי דם, אוטם שריר הלב, היצרות מחדש כלילית, ופרקים של אי ספיקת לב או חוסר התאמה, עלול להתרחש חודשים לאחר התערבות כלילית, הצגת ביקורים לא מתוכננת לבית החולים. מק נפוצים ברחבי העולם והתמותה המורבית שלהם הוא גבוה1.

פגיעה איסכמי כלילית גורמת התגובה כלי דם מוקדם מנגנונים מגיבים מעורבים הגיוס של mpcs בשל יכולת הבידול שלהם ו/או הפוטנציאל מגיב, כמו גם את הייצור של מולקולות מסיסים כמו מולקולות הדבקה התרבות (icams), מטריקס מטלומטיות (mmps), ומינים חמצן תגובתי, המשקף תא ה למרות התכונות הפנימיות כלי דם כמו מאפייני פלאק ומורכבות עורק כלילי שימשו כדי לנבא maces, מחקרים מסוימים הראו כי בסמנים הקשורים מנגנונים של פציעה ותיקון המתרחשים אנדותל כלילית יכול להיות מאוד שימושי לזיהוי מוקדם ופרוגנוזה של אירועי לב וכלי דם בחולים עם CAD נשלח לניתוח כלילית2,

עניין מתמשך של הבנת המנגנונים בבסיס הפציעה CAD ותיקון יש מוטיבציה חוקרים לחקור בסמנים מחזורי במחזור תאיים, כי דגימה כלילית יותר משקף נזק כלי דם ותיקון6. עם זאת, אפיון של סמנים כליליים במחקרים אנושיים כבר נדיר7,8,9. לכן, מטרת המחקר הנוכחי היה לתאר שיטה כדי לקבוע את הכמות של מחזורי כלילית MPCs ו מולקולות מסיסים, המשקף הן פגיעה בכלי הדם ותיקון, כדי להראות אם אלה בסמנים הקשורים MACEs ואת הפרוגנוזה הקלינית של מטופלים CAD שעברו כלילית אנגיופלסטיקה. שיטה זו מבוססת על שימוש בכלי דם הקשורים, מחזורי MPCs ו מולקולות מסיסים שהתקבלו על ידי מיקומים דגימה הקרובה ביותר לנזק כלי. זה עשוי גם להיות שימושי עבור מחקרים קליניים עבור איסכמיה הגפיים התחתונה, שבץ, דלקת כלי דם, פקקת ורידי, ופציעות אחרות הקשורות לפציעה ותיקון של נימי דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עונה על ההנחיות המוסדיים מוועדת האתיקה של המחקר האנושי.

1. אנגיוגרפיה כלילית, אולטרסאונד, ודגימת דם

  1. בקשת מידע קליני ודמוגרפי בסיסי לפני התערבות כלילית. לאסוף את הנתונים של הפרט: גיל, סקס, מצב עישון הנוכחי, מדד מסת הגוף (BMI), לחץ דם גבוה, dyslipidemia, סוכרת, תרופות, ואת האינדיקציה הנוכחית אנגיוגרפיה כלילית.
  2. השתמש בגישה מוקדית כלילית באמצעות צנתור לב. הליך זה צריך להתבצע תחת מדריך fluoroscopy בחדר הומודינמיקה על ידי קרדיולוגים מומחים.
    הערה: לזהות כלי קיבול הניתנים להערכה. עבור המחקר הנוכחי, כלי הערכה הוגדרו כעורקים עם סעיפים גדולים מ 1.5 מ"מ והיצרות לומן של יותר מ 50%.
  3. לקדם את קטטר אולטרסאונד intravascular לאזור הריבית תמונות שיא. השתמש בתוכנה המתאימה כדי לאתר ולמדוד את אזור הלומיאל הקטן ביותר.
  4. השתמש קטטר כלילית לאסוף 10 מ ל של דם מהמיקום הקרוב ביותר ללוח.
  5. לאחר הפרשות המטופל, קבע הערכות רפואיות תקופתיות כדי לעקוב אחר נקודות הלימוד. אם אין אפשרות ליצור קשר טלפוני או שביקור אצל רופא מתעכב במשך יותר מ-2 חודשים, בקש מאדם מורשה (שתוכנן בעבר) לאמת את נקודות הקצה של המחקר.
    הערה: לשקול כל אחד מהבאים: 1) מוות לב וכלי דם, 2) אוטם שריר הלב החדש, 3) אנגינה לא יציבה הצגת ביקור רפואי לא מתוכנן בתוך 24 h, 4) סטנט היצרות מחדש כפי שמתואר על ידי אנגיוגרפיה כלילית, 5) פרקים של פירוק אי ספיקת לב הדורשת. טיפול רפואי

2. קביעת הוראות במחזור (איור 2)

  1. . לעבד את הדם בטווח של 1 מתוך הקולקציה העברה 6 מ ל של הדם שנאסף עד 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו לדלל 1:1 (v/v) עם מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS), pH = 7.4.
  2. הוסף 2 מ ל של צפיפות בינונית מעבר לשלוש שפופרות בדיקה. העבר בזהירות שלוש שוויון עוצמת הקול של דם מדולל לתוך כל צינור בדיקה המכיל את הצפיפות בינונית מעבר הצבע.
    הערה: נפח הגודל הכולל של צפיפות מעבר הצבע והדם המדולל אינו עולה על שלושה רבעים של הקיבולת המקסימלית של צינור הבדיקה.
  3. צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 30 דקות. להעביר את הלהקה בממשק בין השכבות לתוך צינור חדש. הוסף 2 מ ל של PBS ו צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 6 דקות. . הגלולה תכיל את ה-MPCs
  4. רחץ את הגלולה מספר פעמים. מריף את הפתרון הקודם ומחדש בעדינות את הגלולה התא ב-PBS טרי. עבור שוטפים הבאים, צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 2 דקות. חזור על התהליך 6x.
  5. השהה מחדש את הגלולה. בעוד 1 מ ל של הערוץ מערבבים 20 μL של התא השעיה עם 0.4% טריפה כחול, מדולל 1:1 (v/v). למרוח טיפה על המוכציטוטומטר ולספור את התאים הבלתי מוכתמים תחת מיקרוסקופ אור.
  6. המשך לקביעת ההגדרה MPCs. תווית 5 מ ל זרימה cy, לנסות צינורות, סדרת מחלקים out 1 x 106 תאים לכל צינור. הכינו את הנוגדנים המתאימים לסוג isotype. צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 6 דקות ולמחוק את הסופרנטאנט.
  7. להוסיף את הנוגדן העיקרי מדולל ב 100 μL של פתרון דגירה של נוגדן המורכב של 1x PBS (pH = 7.4), 2 מ"מ חומצה ethylenediאצטט (EDTA), ו-0.05% בסרום של פרה (BSA). השעיה מחדש עבור 10 s ו-הדגירה עבור 20 דקות ב 4 ° c, מוגן באור. הפרוטוקול עשוי להיות מושהה בשלב זה על ידי תיקון לימפוציטים ב 4% פאראמפורמלדהיד ב-PBS ואחסון דגימות של עד 24 שעות ב 4 ° c.
    הערה: הריכוזים הסופיים של הנוגדנים העיקריים המשמשים בפרוטוקול הנוכחי היו CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
  8. צנטריפוגה ב 1,800 x g, 4 ° צ' עבור 2 דקות ולהיפטר supernatant. השהה מחדש ב-500 μL של 1x PBS (pH = 7.4), 2 מ"מ EDTA.
  9. ביצוע הניתוח cy, הזרימה. השתמש בנוגדנים בקרה שהותאמו לסוג isotype כדי להגדיר את צביעת הרקע. לאחר מכן, לבחור לימפוציטים להתפשט על העלילה FSC/התחתית, מנסה להוציא גרנולוציטים שיורית, הפסולת התאית, וחלקיקים אחרים, אשר ממוקמים בדרך כלל התחתון, שמאל מופץ בעלילה. התפלגות כזו נחשבת כ-100%.
  10. השתמש בשער המכיל מספר גבוה של תאים עם משותף immunophenotype+ ו CD34+. עבור immunophenotypes כפולים חיוביים, השתמש בשער שמזהה בעבר CD45+, CD34+, עם תוספת של KDR (ווגfr-2)+, CD133+, או CD184+. זיהוי אוכלוסיות המשנה של MPC על-ידי סמני שטח התא הספציפיים שלהם. דווח כאחוז של אירועים מגודרת.
  11. זיהוי אוכלוסיות המשנה הראשיות של MPCs. במחקר הנוכחי הסוגים העיקריים של immunophenotypes היו CD45+CD34+CD133+, CD45+CD34 +CD184+, CD45+CD34+CD133+CD184 +, CD45+ CD34+ kdr+, CD45+CD34+kdr+CD133+, וCD45+CD34+ kdr+ CD184.
    הערה: סמני פני השטח הנמצאים בשימוש היו CD45 (לימפוציטים), CD34 (אנדותל ו/או בתאי כלי דם), KDR (מסמן ממברנה של תאי האנדותל), CD133 (תאי מחולל שורש), ו CD184 (תאי גזע המטבטיים ותאי האנדותל).

3. קביעת ביואריטים מסיסים פלזמה

  1. השתמש ביישום חיסוני מקושר אנזים (אליסה) כדי לקבוע את הריכוז של סיעם-1 ו-MMP-9 (איור 3, השורה העליונה).
    1. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 3,000 x g, טמפרטורת החדר עבור 5 דקות ולאסוף את הפלזמה.
    2. תייג את הסטנדרטים, הצינורות לדוגמה ושפופרות הבקרה. באמצעות כביסה 2x באמצעות מאגר הכביסה המסופק בערכת ה-דיאגנוסטיקה, ניתן להאביק את הבארות הצופות מראש בצלחת המערכת.
    3. העבר את הסטנדרטים, הדגימות והפקדים לבארות. חותם הדגירה ב 37 ° c עבור 90 דקות.
      הערה: אל תתנו לבארות להתייבש לחלוטין.
    4. למחוק את התוכן ולהוסיף את נוגדן זיהוי biotin. חותם הדגירה ב 37 ° c עבור 60 דקות.
    5. למחוק את התוכן ולשטוף 3x. חותם את הפלאק ואת הדגירה ברצף עם פתרון העבודה streptavidine ואחריו המצע טטרמתיבנזיל ב 37 ° c עבור 30 דקות, מוגן באור. שטוף את 3x בין incubations. כשהצבע מתפתח, הוסף את פתרון העצירה וקרא את ספיגת הצפיפות האופטית בקורא מיקרופלייט.
  2. השתמש בקביעה מגנטית אימונוxing כדי לקבוע את הריכוז של נמק הגידול גורם אלפא (tnfα) ו אינטרלויקין 1 בטא (IL-1β) (איור 3, השורה התחתונה).
    1. תייג את הסטנדרטים, הצינורות לדוגמה ושפופרות הבקרה.
    2. . מערבולת החרוזים המגנטיים במשך 30 ס להעביר את ההשעיה חרוז לצינורות בגודל כראוי, ולאחר מכן לבארות בלוח השפורסינג הבסיס. מערבולות תקופתיות מונעת משקעים של החרוזים.
    3. הכנס באופן מאובטח את מכונת הכביסה המגנטית המוחזק ביד. לחכות 2 דקות על החרוזים להצטבר על החלק התחתון של כל טוב ובמהירות להפוך הן את היד החזיק מכונת כביסה ואת הצלחת הרכבה, על כיור או פסולת מכולה. זכור להשתמש ביד מחזיק מכונת כביסה מגנטית לשמור על חרוזים בתוך הבארות.
    4. הוסף 150 μL של לשטוף מאגר לתוך כל באר ולחכות 30 s כדי לאפשר את החרוזים להצטבר בתחתית. מחק את התוכן כמו בשלב 3.2.3. לאחר מכן, הוסף 25 μL של מאגר שיטת הקביעה האוניברסלית (המסופקת בערכה) ואחריו 25 μL של תקנים מוכנים, דגימות ופקדים.
    5. חותם את הצלחת ואת הדגירה לפחות 60 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד. לחילופין, הגנה מפני לילה ב -4 ° c, מוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד במידת האפשר.
    6. שטוף 2x על-ידי הוספת 150 μL של לשטוף את המאגר ולחכות 30 s. למחוק את התוכן על ידי הוספת מנקה החזיק יד מגנטי הלוח. המתן 2 דקות והיפוך על כיור או פסולת מכולה.
    7. דגירה ברצף עם 25 μL של תערובת נוגדן לזיהוי ואחריו 25 μL של פתרון streptavidin-PE בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות, אטום ומוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד. שטוף 2x בין incubations, כפי שמתואר בשלב 3.2.6.
    8. . השג את הקריאות הוסף 120 μL של מאגר קריאה. לאטום את הצלחת ואת הדגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן באור, עם טלטול תמידי ב 500 סל ד. הפעל את הקריאה על-ידי קורא שיטת מריבוב. כוונן את פרמטרי הקריאה בהתאם לאחד מהאנליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כלילית, סינוס ורידי דם היקפי נאספו מ 52 חולים שעברו אנגיוגרפיה כלילית (איור 1) והראה שכיחות גבוהה של יתר לחץ דם, dyslipidemia. במהלך הטיפול הקליני, 11 (21.1%) MACEs התרחשה 6 חודשים לאחר אנגיוגרפיה כלילית: מוות (n = 1), אנגינה הדורשת נוכחות בבית החולים (n = 6), אוטם שריר הלב (n = 2), ו/או ראיות של אי ספיקת לב (n = 4).

ריכוז כלילית בסיסית של רוב MPCs היה נמוך באופן משמעותי בחולים שפיתחו MACEs (איור 4), עם ירידה גדולה יותר ב-mpcs תת אוכלוסיות CD34+CD133+ ו CD45+CD34+CD133 + CD184+. כמו כן, לחולים שפיתחו את MACEs היה קו בסיס מוגבר בכמויות כליליות של סיאם -1 והתחתון MMP-9 (שולחן 1).

כלילית MPCs (אוכלוסיות משנה CD45+CD34+CD133+ CD45+CD34+CD133+CD184+) וסיאם -1 (דיכוטוזציה על-ידי ערכי החציון שלהם) הפגינו יכולת התחזיות של הישרדות ללא מייס (איור 5).

אנו מאופיינים עוד יותר את הדינמיקה של סמנים מסיסים בתנאים שונים, כי יש מעט מאוד מידע בנוגע לקביעת דם כלילית. הביטוי של נמק הגידול גורם אלפא (TNFα) הראה וריאציות על פי זמן מדידה (טרום או פוסט אנגיופלסטיקה) ואת המיקום של דגימה כלילית המבוססת על השוואה של אזורים לומן שונים באותו עורק כלילי באמצעות אולטרסאונד intravascular (איור 6).

Figure 1
איור 1: אנגיוגרפיה כלילית ואיסוף דם. התמונה מציגה צנתור לב באמצעות גישה רדיאלי, ביצע תחת מדריך fluoroscopy בחדר הומודינמיקה. מומחי קרדיולוגיה להעריך את כלי כלילית במהלך האנגיוגרפיה לאסוף דם כלילית מהמיקום הקרוב ביותר לרובד atheroma ו/או דם הסינוס דרך קטטר הלב רק לפני אנגיופלסטיקה בלון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכנה לדגימת דם וקביעת MPCs באמצעות הזרימה cy, try. (A) צפיפות מעבר הצבעלאחר צנטריפוגה דם (חץ כחול = לימפוציטים הלהקה). (ב) אוסף של שלב הימפוציט. (ג) שוטף עם 1X PBS. (ד) צנטריפוגה. (E) גלולה היווצרות בתחתית צינור הבדיקה. (ו) ההשעיה של תא נויבאואר מטען. (G) מונה תאים לימפוציטים באמצעות מיקרוסקופ אור. (ח) קביעת אוכלוסיות משנה של תאים על-ידי זרימה cy, לנסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: החיסוני אומר לקבוע מתווכים מסיסים בדם. שורה עליונה: שיטת חיסוני מקושרת אנזימים (אליסה). התמונה מציגה כיצד מידע מתוך דגימות המפה (מחברת) הועבר לתוכנה כדי להתחיל את הקריאות לאחר הכנה לדוגמה, הדגירה נוגדן, ושוטף. הוא מראה גם פיתוח צבע צהוב, בבארות סטנדרטיות (עמודות שמאל בלוח) או בדגימות הבדיקה (עמודות מימין בלוח). שורה תחתונה: שיטת הריבוב. לאחר ההכנה לדוגמה, הדגירה המגנטית של נוגדן מגנטי, ושוטף, המידע לדוגמה הועבר למערכת החיסונית המתאימה של מגנטי אימונוxing מערכת הקורא, ו עקומת רגיל אופייני מוצג במסך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כלילית במחזור תאי מחולל קדמון (MPCs). האיור מציג אוכלוסיות משנה בסיסיות של% MPCs. (א) קריאות מייצגות מזרם cy,לנסות. (ב) כימות של% mpcs תת אוכלוסיות עם הזרימה cy, מותווים על פי המצגת של maces (*) = הבדל משמעותי, עם p < 0.05. דמות זו שונתה מסוארס-קואנקה ואח '10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: כלילית מחזורי הסלולר (MPCs), בסמנים מסיסים ופרוגנוזה. האיור מציג כמויות דם כליליות בסיסיות של (א)% mpcs שנקבעו על ידי הזרמת cy, ו-(ב) ריכוז פלזמה של סיאם 1 שנקבע על ידי אליסה, הן מותוות על פי המצגת של maces במהלך 6 החודש מעקב. השורה הכחולה מציינת את מספר האנשים עם ערכי סיכון עבור כל אחד מהסמנים, כגון% MPCs נמוכה יותר או כגון סיעד-1. סיעם-1 = מולקולת הדבקה בין-תאית מסיסה 1. דמות זו השתנתה מסוארס-קואנקה, ואח '10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התנאים הקובעות שינויים בסמנים מסיסים בצורת כלילית. הדמות מראה שינויים בריכוז התאיים של נמק הגידול גורם אלפא (TNFα), על פי זמן מדידה (א: לפניאנגיופלסטיקה או B: לאחר אנגיופלסטיה), כמו גם את המיקום של דגימת כלילית (השוואה בין שני לומן כלילית קטרים בתוך 3.5 מ"מ, נמדד על ידי אולטרסאונד intravascular). (*) = p < 0.05 ההפרש של בסמנים שהתקבלו pre-vs. פוסט-אנגיופלסטיקה, והבדל של דגימה במיקומים של לומן כלילית קטרים ≤ 3.5 mm לעומת > 3.5 מ"מ. דמות זו שונתה מסוארס-קואנקה ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
טבלה 1: בסיס בסיסי דם מסיסים. (*) מציין p < 0.05 ביואריטים ההפרש של דם כלילית לעומת מחזור הדם ההיקפי. (* *) מציין p < 0.05, ללא MACEs vs. עם MACEs; מבחן T עצמאי חד-זנבי. קיצורים: סיעד 1 = מולקולת הדבקה בין-תאית מסיסים 1; IL-1β = אינטרלויקין 1 בטא; MMP-9 = מטריקס מטאלופרוטאינטאז 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

איסוף הדם מעורק העורקים המושפע עלול להיות קשה. לפעמים, עורק העורק הראשי. בקושי נגיש במקרה זה, דגימת סינוס של הורידים עשויה להיות חלופה. בוצעו בדיקות אימות השוואת ביורים מחזורי הסמנים בעורק כלילי לעומת הסינוס ורידי, ללא הבדלים משמעותיים. עם זאת, הביצועים של מחזורי הסמנים הבין-מסתובבים אומתו רק בדגימת כלילית. לכן, הביצועים של סמנים ביואריטים שהתקבלו מסינוס הורידים נותר לחקור.

מומלץ לעבד את הדגימות עבור MPCs בתוך 3 h הראשון לאחר איסוף הדם. לכן, יש ליצור תקשורת טובה בין צוות הקרדיולוגיה לחוקרי המעבדה. במהלך בידוד MPCs, יש לנקוט בטיפול בעת הפקדת דגימות דם במהלך הכנה למילוי צפיפות בעת שטיפת הגלולה MPCs. לבסוף, לנוחות, אנחנו תמיד להעביר תאים לתוך צינור cy, להוסיף את הנוגדנים העיקריים, לתקן ולאחסן את התאים לילה ב 4 ° c, ולבצע את הזרימה cy, try לקרוא את היום לאחר. לגבי התפקיד ביוארקר של במחזור MPCs, מאמצים חשובים ננקטו כדי לתקנן את המחלות הקליניות השימושיות ביותר בין תאים מחולל קדמון12, אבל מגבלה אחת של המחקר עשוי להיות העובדה תת אוכלוסיות ספציפיות של במחזור תאים מחולל משנה לא התאפיין לגמרי בתרחישים קליניים בתוך CAD או מחלות כלי דם אחרים. לכן, יש לחקור אוכלוסיות שונות של מבני משנה של תאים במחזור כל מחקר.

במהלך קביעת סמנים מסיסים כמה המלצות כלליות עבור אליסה ו ריבוב מספר כוללים את השימוש בצנרת רב ערוצית, הפקדת פתרונות בתחתית של כל באר בלי לגעת בקירות הצדדיים, והימנעות התייבשות מתוך ה בארות במהלך התהליך. תמיד לבדוק את התפלגות לדוגמה בלוח, במיוחד עבור היציבות ריבוב, כדי למנוע משקעים של חרוזים מגנטיים על ידי vortexing קבוע. כמו כן, הקפד להכניס את הצלחת התחתונה לתוך מכונת כביסה לוחית יד מגנטית לשמור על חרוזים מגנטיים בתוך הבארות, אחרת דגימות יאבדו במהלך שוטף.

מצאנו כי כלילית מחזורי MPCs, בעיקר אלה ממוצא המטכיפת, כמו גם סיאם -1 ו-MMP-9, היו בסמנים יוצאי דופן עבור חיזוי והפרוגנוזה של MACEs. זה מתאים לרעיון כי תגובה דלקתית ו/או נזק כלי דם המגשרים לעורר אותות ביות עבור הגיוס MPC וגיוס, קידום תיקון רקמות מקומיות4. לכן, מצאנו וריאציות בסמנים אלה במספר הגדרות. שינויים ביחס אנגיופלסטיקה ו/או מיקום של דגימה כלילית עשוי להיות מוסבר על ידי השפעת ההשפעה על הפלאק atheroma במהלך אנגיופלסטיקה, גודל הלוח, ושחרורו של מגשרים מסיסים מחולק בתוך הלוח לתוך הזרם הכלילי11. מוגברת IL-1β כבר מעורב בעקביות בפיתוח של פלאק וסיבוכים קליניים13.

לידיעתך, זהו המחקר הראשון בהערכת התפקיד של מחזורי הכליליים MPCs ומגשרים מסיסים של פגיעה בכלי דם ותיקון כמו סמנים התחזיות באוכלוסיה עם CAD שהוגשו לניתוח אנגיופלסטיקה כלילית, כולל אפיון של שינויים הקשורים ל-אנגיופלסטיקה, מיקום דגימת כלילית, והשוואת כלילית לעומת דגימה היקפית. אנו סבורים כי ניתן להקים בקלות את השיטה בכל בית חולים המבצע אנגיוגרפיה כלילית. עם זאת, מגבלה אחת היא שאנו להחיל מתודולוגיה זו בעיקר בחולים עם אנגינה יציבה כרונית שוחרר ממחלקת חדר המיון.

השיטות המסורתיות הנוכחי בשימוש עבור חיזוי MACEs או פרוגנוזה ב-CAD יש יכולת ניבוי מתון. יש כבר כמות גוברת של עניין למצוא בסמנים הרומן מבוסס על מנגנוני פתופסולוגיה אחראי תיקון והתחדשות המתרחשים לאחר CAD ו אנגיופלסטיקה. ביואריטים כאלה הראו ביצועים חזוי דומה או טובה יותר לעומת שיטות מסורתיות3,4,5,14,15. כך, אנו חושבים כי התפקיד של מחזורי כלילית MPCs ו מתווכים מסיסים בחיזוי הסיכון של MACEs יהיה לחקור עוד במחקרים פוטנציאליים עתידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים בתמיכת התוכנית המוסדית E015; וfondo Sectorial-CONACYT, SALUD-2014-1-233947.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Roche 10735086001 Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads Miltenyi Biotec / MACS #130-093-607 MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE Milteny Biotec / MACS #130-080-801 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 Miltenyi Biotec / MACS #130-103-798 Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC Miltenyi Biotec / MACS #130-093-601 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC Miltenyi Biotec / MACS #130-081-001 The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue Miltenyi Biotec / MACS #130-092-880 Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes Thermo SCIENTIFIC #339651 15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes FALCON Corning Brand #352052 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA BIO-RAD #161-0729 Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer Without brand Without catalog number Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes BD Vacutainer #367863 Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep Stemcell Technologies 01-63-12-002-A Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH #SZBF0920V Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL CRM Globe PF1016, PF1015 The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes KIMBLE CHASE 45060 13100 Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cassar, A., Holmes, D. R. Jr, Rihal, C. S., Gersh, B. J. Chronic coronary artery disease: diagnosis and management. Mayo Clinic Proceedings. 84 (12), 1130-1146 (2009).
  2. Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
  3. Sen, S., McDonald, S. P., Coates, P. T., Bonder, C. S. Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease. Clinical Science (Lond). 120 (7), 263-283 (2011).
  4. Samman Tahhan, A., et al. Progenitor Cells and Clinical Outcomes in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation Research. 122 (11), 1565-1575 (2018).
  5. Tomulić, V., Gobić, D., Lulić, D., Židan, D., Zaputović, L. Soluble adhesion molecules in patients with acute coronary syndrome after percutaneous coronary intervention with drug-coated balloon, drug-eluting stent or bare metal stent. Medical Hypotheses. 95, 20-23 (2016).
  6. Jaumdally, R., Varma, C., Macfadyen, R. J., Lip, G. Y. Coronary sinus blood sampling: an insight into local cardiac pathophysiology and treatment? European Heart Journal. 28 (8), 929-940 (2007).
  7. Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
  8. Karube, N., et al. Measurement of cytokine levels by coronary sinus blood sampling during cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. American Society for Artificial Internal Organs Journal. 42 (5), M787-M791 (1996).
  9. Truong, Q. A., et al. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
  10. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
  11. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Relation of Coronary Artery Lumen with Baseline, Post-angioplasty Coronary Circulating Pro-Inflammatory Cytokines in Patients with Coronary Artery Disease. Angiology Open Access. 7, 01 (2019).
  12. Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), e13790 (2010).
  13. Moyer, C. F., Sajuthi, D., Tulli, H., Williams, J. K. Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis. American Journal of Pathology. 138 (4), 951-960 (1991).
  14. Morales-Portano, J. D., et al. Echocardiographic measurements of epicardial adipose tissue and comparative ability to predict adverse cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease. International Journal of Cardiovascular Imaging. 34 (9), 1429-1437 (2018).
  15. Huang, X., et al. Endothelial progenitor cells correlated with oxidative stress after mild traumatic brain injury. Yonsei Medical Journal. 58 (5), 1012-1017 (2017).

Tags

רפואה סוגיה 155 מחזורי כלילית MPCs ביומרים מסיסים סיאם -1 MMP-9 malondialdehyde סוד וכלי דם פרוגנוזה MACEs
תאים כליליים ובסמנים מסיסים בפרוגנוזה לב וכלי דם לאחר אנגיופלסטיקה כלילית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suárez-Cuenca, J. A.,… More

Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter