Summary
Lo sviluppo di importanti eventi cardiovascolari avversi, che influenzano la prognosi cardiovascolare dopo l'angioplastica coronarica, sono influenzati dall'entità del danno coronarica e dalla riparazione vascolare. L'uso di nuovi biomarcatori cellulari e solubili, reattivi ai danni vascolari e alla riparazione, sono utili per prevedere lo sviluppo di MACE e prognosi.
Abstract
I principali eventi cardiovascolari avversi (MACE) influiscono negativamente sulla prognosi cardiovascolare dei pazienti sottoposti a angioplastica coronarica a causa di lesioni ischemiche coronariche. L'entità del danno coronario e i meccanismi di riparazione vascolare sono fattori che influenzano il futuro sviluppo dei MACE. Caratteristiche vascolari intrinseche come le caratteristiche della placca e la complessità dell'arteria coronaria hanno dimostrato informazioni prognostiche per i MACE. Tuttavia, l'uso di biomarcatori circolanti intracoronarici è stato postulato come un metodo conveniente per l'identificazione precoce e la prognosi dei MACE, in quanto riflettono più da vicino meccanismi dinamici che coinvolgono danni coronarici e riparazione. La determinazione dei biomarcatori circolanti coronarici durante l'angioplastica, come il numero di sottopopolazioni di cellule progenitrici mononucleari (PPC) e la concentrazione di molecole solubili che riflettono l'infiammazione, l'adesione cellulare e la riparazione, valutazione degli sviluppi futuri e della prognosi dei MACE 6 mesi dopo l'angioplastica coronarica. Questo metodo è evidenziato dalla sua natura traslazionale e dalle migliori prestazioni rispetto ai biomarcatori periferici circolanti sul sangue per quanto riguarda la previsione dei MACE e il suo effetto sulla prognosi cardiovascolare, che possono essere applicati per la stratificazione del rischio dei pazienti con malattia coronarica in fase di angioplastica.
Introduction
L'angioplastica coronarica e lo stenting rappresentano una procedura di recupero per i pazienti con malattia coronarica (CAD). Tuttavia, importanti eventi cardiovascolari avversi (MACE), tra cui la morte cardiovascolare, l'infarto miocardico, la restenosi coronarica e gli episodi di angina o insufficienza cardiaca di scompensare, possono verificarsi mesi dopo l'intervento coronarico, spingendo visite non programmate in ospedale. I MACE sono comuni in tutto il mondo e la loro morbi-mortalità è alta1.
La lesione coronarica ischemica induce la risposta vascolare precoce e meccanismi riparativi che coinvolgono la mobilitazione dei MMP a causa della loro capacità di differenziazione e/o del potenziale angio-reparativo, così come la produzione di molecole solubili come molecole di adesione intercellulare (ICAM), metalloproteine a matrice (MMM), e specie reattive dell'ossigeno, che riflette l'adesione cellulare, la rimodellamento dei tessuti e lo stress ossidativo. Anche se caratteristiche vascolari intrinseche come le caratteristiche della placca e la complessità dell'arteria coronaria sono state utilizzate per prevedere i MACE, alcuni studi hanno suggerito che i biomarcatori correlati ai meccanismi di lesione e riparazione che si verificano nell'endotelio coronario potrebbero essere molto utili per l'identificazione precoce e la prognosi di eventi cardiovascolari in pazienti con CAD sottoposti all'angioplastica coronaria2,3,4,5.
Il continuo interesse per la comprensione dei meccanismi alla base delle lesioni e della riparazione CAD ha motivato gli sperimentatori a studiare i biomarcatori circolanti intracoronari, perché il campionamento coronarica riflette più da vicino i danni vascolari e la riparazione6. Tuttavia, la caratterizzazione dei biomarcatori coronarici negli studi sull'uomo è stata scarsa7,8,9. Pertanto, lo scopo del presente studio era descrivere un metodo per determinare la quantità di MPC circolanti coronarici e molecole solubili, riflettendo sia lesioni vascolari che riparazioni, e per mostrare se questi biomarcatori sono associati ai MACE e alla prognosi clinica dei pazienti CAD che hanno subito un'angioplastica coronarica. Questo metodo si basa sull'uso di MPC vascolari circolanti, circolanti e molecole solubili ottenute campionando posizioni più vicine al danno del vaso. Può anche essere utile per studi clinici per l'ischemia degli arti inferiori, ictus, vavulite, trombosi venosa, e altre lesioni che coinvolgono lesioni vascolari e riparazione.
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Protocol
Questo protocollo soddisfa le linee guida istituzionali del Comitato Etico per la ricerca umana.
1. Angiografia coronaria, ultrasuoni e campionamento del sangue
- Richiedere informazioni cliniche e demografiche di base prima dell'intervento coronarica. Raccogliere i dati dell'individuo: età, sesso, stato di fumo attuale, indice di massa corporea (BMI), alta pressione sanguigna, dilipidemia, diabete mellito, farmaci e l'indicazione per l'attuale angiografia coronarica.
- Eseguire l'angiografia coronarica attraverso la cateterizzazione cardiaca utilizzando un approccio radiale. Questa procedura deve essere eseguita sotto una guida alla fluoroscopia nella stanza dell'emodinamica da cardiologi esperti.
NOTA: Identificare i recipienti valutabili. Per il presente studio, i vasi valutabili sono stati definiti come arterie con sezioni superiori a 1,5 mm e stenosi di lumen di oltre il 50%. - Avanzare il catetere ad ultrasuoni intravascolari nella regione di interesse e registrare le immagini. Utilizzare il software appropriato per individuare e misurare la più piccola area luminale.
- Utilizzare un catetere coronarico per raccogliere 10 mL di sangue dalla posizione più vicina alla placca.
- Dopo la dimissione del paziente, programmare valutazioni mediche periodiche per seguire gli endpoint dello studio. Se il contatto telefonico non è possibile o una visita medica viene ritardata di più di 2 mesi, richiedere a una persona autorizzata (precedentemente progettata) di verificare gli endpoint dello studio.
NOTA: Si consideri uno dei seguenti un MACE: 1) morte cardiovascolare, 2) nuova infarto miocardico, 3) angina instabile che richiede una visita medica non programmata entro 24 h, 4) resienosi stent come dimostrato da angiografia coronarica, 5 episodi) di scompensato insufficienza cardiaca che richiede attenzione clinica.
2. Determinazione dei PMC circolanti (Figura 2)
- Elaborare il sangue entro 1 h dalla raccolta. Trasferire 6 mL del sangue raccolto su un tubo conico da 15 mL e diluire 1:1 (v/v) con 1x fosfato buffered saline (PBS), pH - 7.4.
- Aggiungere 2 mL di grado di pendenza di densità a tre provette. Trasferire con attenzione tre aliquote di uguale volume di sangue diluito in ogni provetta contenente il mezzo di pendenza di densità.
NOTA: Il volume totale del gradiente di densità medio e del sangue diluito non deve superare i tre quarti della capacità massima della provetta. - Centrifuga a 1.800 x g, 4 gradi centigradi per 30 min. Trasferire la banda all'interfaccia tra gli strati in un nuovo tubo. Aggiungere 2 mL di PBS e centrifuga a 1.800 x g, 4 gradi centigradi per 6 min. Il pellet conterrà i MPC.
- Lavare il pellet più volte. Aspirare la soluzione precedente e risospendere delicatamente il pellet cellulare in PBS fresco. Per i furici successivi, centrifugare a 1.800 x g, 4 C per 2 min. Ripetere il processo 6x.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS. Mescolare 20 - L della sospensione cellulare con 0.4% trypan blu, diluito 1:1 (v/v). Applicare una goccia su un emocitometro e contare le cellule non colorate al microscopio luminoso.
- Procedere alla determinazione dei PMC. Etichettare 5 mL tubo di citometria di flusso e fuori aliquota 1 x 106 cellule per tubo. Preparare gli anticorpi di controllo corrispondenti abbinati all'isotipo. Centrifuga a 1.800 x g,4 gradi centigradi per 6 min e scartare il supernatante.
- Aggiungere l'anticorpo primario diluito in 100 gradi di una soluzione di incubazione degli anticorpi costituita da 1x PBS (pH - 7,4), 2 mM di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) e 0,05% albumina del siero bovino (BSA). Risospendere per 10 s e incubare per 20 min a 4 gradi centigradi, protetto dalla luce. Il protocollo può essere sospeso a questo passo fissando i linfociti nel 4% di paraformaldeide in PBS e conservando campioni fino a 24 h a 4 gradi centigradi.
NOTA: le concentrazioni finali degli anticorpi primari utilizzati nel presente protocollo erano CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. - Centrifuga a 1.800 x g,4 gradi centigradi per 2 min e scartare il supernatante. Risospendere in 500 - L di 1x PBS (pH - 7,4), 2 mM EDTA.
- Eseguire l'analisi della citometria di flusso. Utilizzare anticorpi di controllo associati a isotipi per impostare la colorazione dello sfondo. Quindi, selezionare i linfociti sparsi nella trama FSC/SSC, cercando di escludere i granulociti residui, i detriti cellulari e altre particelle, che di solito si trovano nella parte inferiore, distribuita a sinistra nella trama. Tale distribuzione è considerata al 100%.
- Utilizzare un cancello contenente un elevato numero di cellule con immunofenotipo comune CD45 e CD34. Per gli immunofenotipi doppio positivo, utilizzare un cancello che in precedenza identifica CD45,CD34, con l'aggiunta di KDR (VEGFR-2),CD133,o CD184. Identificare le sottopopolazioni MPC in base ai marcatori di superficie cellulare specifici. Segnalare la percentuale di eventi con cancello.
- Identificare le principali sottopopolazioni di MPC. Nel presente studio i principali immunofenotipi sono stati CD45,CD34,CD33,CD45 , CD184 , CD45,CD34 , CD34,CD34 , CD133,CD184,CD45,CD34,KDR,CD45 , CD45 , CD34 , CD34 , CD133 , e CD45 , CD34,CD14 , KDR , CD14 .
NOTA: I marcatori di superficie cellulare utilizzati erano CD45 (linfociti), CD34 (cellule endoteliali e/o vascolari), KDR (VEGFR-2), marcatore di membrana delle cellule endoteliali), CD133 (cellule progenitrici endoteliali) e CD184 (cellule staminali ematopoietiche e cellule endoteliche).
3. Determinazione dei biomarcatori solubili al plasma
- Utilizzare un saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) per determinare la concentrazione di SICAM-1 e MMP-9(Figura 3, fila superiore).
- Centrifugare i campioni di sangue a 3.000 x g, temperatura ambiente per 5 min e raccogliere il plasma.
- Etichettare gli standard, i tubi campione e i tubi di controllo. Egli i pozzi pre-rivestiti nella piastra di prova lavando 2x con il buffer di lavaggio fornito nel kit ELISA.
- Trasferire gli standard, i campioni e i controlli nei pozzi. Sigillare e incubare a 37 gradi centigradi per 90 min.
NOTA: Non lasciare asciugare completamente i pozzi. - Eliminare il contenuto e aggiungere l'anticorpo antibio di biotina-rilevamento. Sigillare e incubare a 37 gradi centigradi per 60 min.
- Scartare il contenuto e lavare 3x. Sigillare la placca e incubare in sequenza con soluzione di lavoro streptavidina seguita da substrato tetramethylbenzidine a 37 gradi centigradi per 30 min, protetto dalla luce. Lavare 3volte tra le incubazioni. Quando il colore si sviluppa, aggiungere la soluzione di arresto e leggere l'assorbimento della densità ottica in un lettore ELISA a microplacca.
- Utilizzare un saggio immunomagnetico multiplexing per determinare la concentrazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) e dell'interleumina 1 beta (IL-1) (Figura 3, riga inferiore).
- Etichettare gli standard, i tubi campione e i tubi di controllo.
- Vorticare le fiale magnetiche per 30 s. Trasferire la sospensione del tallone a tubi di dimensioni appropriate, e quindi ai pozzi nella piastra di assaggio multiplexing. Il vortice periodico evita la precipitazione delle perline.
- Inserire in modo sicuro la lavapiastra magnetica portatile. Attendere 2 min per le perline di accumularsi sul fondo di ogni pozzo e rapidamente invertire sia la lavatrice a lapiastra magnetica a mano e l'assemblaggio della piastra, su un lavandino o contenitore di rifiuti. Ricordarsi di utilizzare la lavatrice a piastra magnetica portatile per mantenere le perline all'interno dei pozzi.
- Aggiungere 150 l di tampone di lavaggio in ogni pozzo e attendere 30 s per consentire alle perline di accumularsi sul fondo. Eliminare il contenuto come nel passaggio 3.2.3. Quindi, aggiungere 25 l di buffer di asino universale (fornito nel kit) seguito da 25 - L di standard, campioni e controlli preparati.
- Sigillare la piastra e incubare per almeno 60 min a temperatura ambiente, leggera, con agitazione costante a 500 giri/m. In alternativa, incubare durante la notte a 4 gradi centigradi, protetti dalla luce, con agitazione costante a 500 giri/min, se possibile.
- Lavare 2x aggiungendo 150 l di tampone di lavaggio e attendere 30 s. Scartare il contenuto inserendo la lavatrice a mano. Attendere 2 min e invertire su un lavandino o contenitore di rifiuti.
- Incubare in sequenza con 25 l di miscela di anticorpi di rilevamento seguita da 25 - L di soluzione streptavidin-PE a temperatura ambiente per 30 min, sigillato e protetto dalla luce, con agitazione costante a 500 rpm. Lavare 2x tra le incubazioni, come descritto al punto 3.2.6.
- Ottenere le letture. Aggiungere 120 l di buffer di lettura. Sigillare la piastra e incubare 5 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce, con agitazione costante a 500 rpm. Eseguire la lettura su un lettore di saggi multiplexing. Regolare i parametri di lettura in base a ciascun analita.
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Representative Results
Coronaria, seno venoso e sangue periferico sono stati raccolti da 52 pazienti sottoposti ad angiografia coronarica (Figura 1) e hanno mostrato un'alta prevalenza di ipertensione e dislipidemia. Al follow-up clinico, 11 (21,1%) I MACE si sono verificati 6 mesi dopo l'angiografia coronarica: morte (n ) e angina che richiedono la frequenza ospedaliera (n . 6), infarto miocardico (n ) e/o prove di insufficienza cardiaca (n . 4).
La concentrazione coronarica di base della maggior parte degli MPC è stata significativamente più bassa nei pazienti che hanno sviluppato MACE (Figura 4), con una diminuzione maggiore delle sottopopolazioni MPC CD34,CD133, e CD45,CD34,CD133,CD184. Allo stesso modo, i pazienti che sviluppavano MACE avevano una linea di base aumentata in quantità coronariche di sICAM-1 e MMP-9 inferiore(tabella 1).
I CMC coronarici (sottopopolazioni CD45,CD34,CD33 , CD43, CD34 , CD133 ) e sICAM-1 (dichotomizzati dai loro valori mediani) dimostravano capacità prognostica per lasopravvivenzasenza MACE ( Figura 5 ).
Abbiamo inoltre caratterizzato la dinamica dei biomarcatori solubili in condizioni diverse, perché ci sono pochissime informazioni per quanto riguarda la determinazione coronarica del sangue. L'espressione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) ha mostrato variazioni a seconda del tempo di misurazione (pre o post-angioplastica) e della posizione del campionamento coronaario sulla base di un confronto di diverse aree di lumen nella stessa arteria coronaria utilizzando ultrasuoni intravascolari (Figura 6).
Figura 1: angiografia coronarica e raccolta del sangue. L'immagine mostra la cateterizzazione del cuore usando un approccio radiale, eseguito sotto una guida fluoroscopia nella stanza dell'emodinamica. Gli esperti di cardiologia valutano i vasi coronarici durante l'angiografia e raccolgono il sangue coronarica dal luogo più vicino alla placca ateroma e/o al sangue del peccato attraverso un catetere cardiaco appena prima dell'angioplastica a palloncino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione del campione di sangue e determinazione dei MPC in base alla citometria di flusso. (A) Sfumatura di densità dopo la centrifugazione del sangue (freccia blu e banda linfociti). (B)Raccolta della fase dei linfociti. (C) Washes con 1x PBS. (D) Centrifugazione. (E) Formazione di Pellet nella parte inferiore della provetta. (F) Carico di sospensione cellulare Neubauer. (G) Conteggio cellule linfociti con microscopia leggera. (H) Determinazione delle sottopopolazioni cellulari per citometria di flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immunoassays per determinare i mediatori solubili nel sangue. Riga superiore: analto immunosorbente legato all'enzima (ELISA). L'immagine mostra come le informazioni provenienti dai campioni di mappa (notebook) sono state trasferite al software per avviare le letture dopo la preparazione del campione, l'incubazione degli anticorpi e i fumi. Mostra anche lo sviluppo del colore giallo, sia nei pozzi standard (colonne a sinistra nella placca) o nei campioni di prova (colonne a destra nella placca). Riga inferiore: analto multiseguito immunomagnetico. Dopo la preparazione del campione, l'incubazione magnetica del perline-anticorpi e i fumi, le informazioni del campione sono state trasferite al software del lettore di analisi immuno-magnetico appropriato e sullo schermo viene mostrata una tipica curva standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cellule progenitrici mononucleari (PMC) circolanti coronarie. La figura mostra le sottopopolazioni di base %MpC. (A) Letture rappresentative dalla citometria di flusso. (B) Quantificazione di %MPC sottopopolazioni con citometria di flusso, tracciata secondo la presentazione di MACE (Sezione ) - differenza significativa, con p < 0,05. Questa cifra è stata modificata da Sorez-Cuenca et al.10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cellulare circolante coronario (MPC), biomarcatori solubili e prognosi. La figura mostra quantità di sangue coronarica di base di sottopopolazioni (A) %MPC determinate dalla citometria di flusso e (B)concentrazione plasmatica di sICAM-1 determinata da ELISA, entrambe tracciate secondo la presentazione di MACE durante il follow-up di 6 mesi. La linea blu indica il numero di individui con valori di rischio per ogni biomarcatore, ad esempio %MPC inferiori o sICAM-1 superiori. sICAM-1 - molecola intercellulare solubile 1. Questa cifra è stata modificata da Sorez-Cuenca, etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Condizioni che determinano la variabilità dei biomarcatori solubili circolanti coronarici. La figura mostra i cambiamenti nella concentrazione intracoronarica del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF), in base al tempo di misurazione (A: Pre-angioplastica o B: Post-angioplastica) così come la posizione del campionamento coronarica (confronto tra due diametri di lume coronarica a un taglio di 3,5 mm, misurato da ultrasuoni intravascolari). P < 0,05 differenza di biomarcatori ottenuta prima rispetto all'angioplastica e differenza di campionamento in posizioni di diametri del lume coronario di 3,5 mm contro >3,5 mm. Questa cifra è stata modificata da Sorez-Cuenca et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Biomarcatori solubili nel sangue al basale. Indica i biomarcatori di differenza p < 0,05 dal sangue coronavo rispetto alla circolazione periferica. Il simbolo di cancelazione indica p < 0,05, senza MACE rispetto ai MACE; test T indipendente a una coda. Abbreviazioni: sICAM-1 - solubile molecola intercellulare 1; IL-1 - interleuchino 1 beta; MMP-9 - matrice metalloproteinasi 9.
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Discussion
La raccolta di sangue dall'arteria coronaria interessata può essere difficile. A volte, l'arteria coronaria è a malapena accessibile. In questo caso, il campionamento dal seno venoso può essere un'alternativa. Abbiamo eseguito test di convalida confrontando biomarcatori circolanti nell'arteria coronaria contro il seno venoso, senza differenze significative. Tuttavia, le prestazioni dei biomarcatori circolanti sono state convalidate solo per il campionamento coronario. Pertanto, le prestazioni dei biomarcatori ottenuti dal seno venoso rimane da esplorare.
E 'meglio elaborare i campioni per MPC entro i primi 3 h dopo la raccolta del sangue. Pertanto, una buona comunicazione dovrebbe essere stabilita tra il team di cardiologia e i ricercatori di laboratorio. Durante l'isolamento delle MPC, occorre prestare attenzione quando si depositano campioni di sangue durante la preparazione del gradiente di densità durante il lavaggio del pellet MPCs. Infine, per comodità, trasferiamo sempre le cellule in un tubo di citometria, aggiungiamo gli anticorpi primari, fissiamo e memorizziamo le cellule durante la notte a 4 gradi centigradi ed eseguiamo la lettura della citometria di flusso il giorno dopo. Per quanto riguarda il ruolo dei biomarcatori degli MPC circolanti, sono stati compiuti importanti sforzi per standardizzare gli immunofenotipi clinicamente più utili tra le cellule progenitrici12, ma una limitazione dello studio può essere il fatto che specifiche sottopopolazioni di cellule progenitrici circolanti non sono state pienamente caratterizzate per tutti gli scenari clinici all'interno della CAD o di altre malattie vascolari. Pertanto, in ogni studio dovrebbero essere esplorate diverse sottopopolazioni di cellule progenitrici circolanti.
Durante la determinazione dei marcatori solubili alcune raccomandazioni generali per ELISA e i saggi di multiplexing includono l'uso di una pipetta multicanale, il deposito di soluzioni nella parte inferiore di ogni pozzo senza toccare le pareti laterali, ed evitando l'essiccazione pozzi durante il saggio. Controllare sempre la distribuzione del campione nella piastra, in particolare per l'analisi multiplexing, per evitare la precipitazione delle perline magnetiche mediante vortice costante. Inoltre, assicurati di inserire la piastra inferiore nella lavapiastra magnetica portatile per mantenere le perline magnetiche all'interno dei pozzi, altrimenti i campioni andranno persi durante i lavamenti.
Abbiamo scoperto che gli MPC circolanti coronarici, principalmente quelli di origine ematopoietica, così come sICAM-1 e MMP-9, erano biomarcatori eccezionali per la previsione e la prognosi dei MACE. Questo è coerente con la nozione che la risposta infiammatoria e/o i mediatori di danni vascolari stimolano i segnali homing per la mobilitazione e il reclutamento di MPC, promuovendo la riparazione dei tessuti locali4. Di conseguenza, abbiamo trovato variazioni in questi biomarcatori in diversi contesti. Le variazioni in relazione all'angioplastica e/o alla posizione del campionamento coronario possono essere spiegate dall'effetto dell'impatto sull'impatto sulla placca dell'atheroma durante l'angioplastica, dalle dimensioni della placca e dal rilascio di mediatori solubili sequestrati all'interno della placca nel flusso coronarica11. L'aumento dell'IL-1 è stato costantemente coinvolto nello sviluppo della placca e delle complicazioni cliniche13.
A nostra conoscenza, questo è il primo studio che valuta prospetticamente il ruolo dei MPC circolanti coronarici e dei mediatori solubili delle lesioni vascolari e della riparazione come biomarcatori prognostici in una popolazione con CAD sottoposto all'angioplastica coronarica, tra cui caratterizzazione dei cambiamenti relativi all'angioplastica, alla posizione del campionamento coronarico e al confronto tra campionamento coronarico e periferica. Pensiamo che il metodo possa essere facilmente stabilito in qualsiasi ospedale che esegue l'angiografia coronarica. Tuttavia, una limitazione è che abbiamo applicato questa metodologia principalmente in pazienti con angina stabile cronica rilasciata da un pronto soccorso.
Gli attuali metodi tradizionali utilizzati per la previsione macE o la prognosi in CAD hanno capacità predittive moderate. C'è stata una crescente quantità di interesse nella ricerca di nuovi biomarcatori basati sui meccanismi di fisiofisiologia responsabili della riparazione e della rigenerazione che si verificano dopo il CAD e l'angioplastica. Tali biomarcatori hanno mostrato prestazioni predittive simili o migliori rispetto ai metodi tradizionali3,4,5,14,15. Pertanto, riteniamo che il ruolo dei MPC circolanti coronarici e dei mediatori solubili nella previsione del rischio per i MACE sarà ulteriormente esplorato nei futuri studi prospettici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il sostegno del Programma Istituzionale E015; e PARTES-CONACYT Sectoria-CONACYT, SALUD-2014-1-233947.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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