Summary
여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.
Abstract
간세포는 대사 기능을 담당하는 간장의 중심 세포입니다. 이와 같이, 그들은 두 개 이상의 간세포가 담즙이 분비되는 담즙 캐날레 네트워크를 형성하기 위해 정점 막을 기여하는 독특한 편광 상피를 형성합니다. 간세포 분극은 올바른 혈관 형성에 필수적이며 간세포 세포 골격, 세포 세포 접촉 및 세포 외 기종 간의 상호 작용에 달려 있습니다. 간세포 세포골격의 생체 외 연구는 카날리큘리 형성과 병리학 적 상황에 대한 반응에 대한 생체 외 에서 의학적 배양이 부족하여 생체 내 canaliculi 네트워크 구조와 밀접하게 유사합니다. 여기서 기재된 프로토콜은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 설명된 것은 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 배양물의 생산이며, 이는 담즙 담낭 형성및 시험관 내 치료에 대한 반응을 연구하기 위해 세포골격 구성 요소의 면역 라벨링에 사용됩니다. 간세포 3D 콜라겐 샌드위치 배양은 독소 (에탄올) 또는 액틴 세포 골격 변경 약물 (예 : blebbistatin)으로 치료에 반응하고 담즙 카날리큘리 형성 및 기능의 시험관 내 연구를위한 귀중한 도구역할을하는 것으로 나타났습니다.
Introduction
간세포, 그것의 신진 대사 기능에 책임 있는 간장의 중앙 세포 구조물은, 유일하게 편광한 상피 세포입니다. 출생 직후 포유류에서 나타나는 그들의 편광은 담즙 혈관 네트워크의 형성을 초래하고 적절한 담즙 분비에 필수적입니다. 간세포의 단피 막은 총칭하여 담즙 카나큘리를 형성하는 반면, 기저 막은 정현파의 내피와 접촉합니다. 간세포 편광의 손실은 담즙 수송기의 재분배로 이끌어 내고 간에서 담즙 보존과 연결된 병리학 적 과정 (즉, 담즙 정체)을 초래합니다.
간세포 편광의 설립 및 유지 보수및 담즙 canaliculi의 발달은 복잡한 메커니즘을 수반합니다. 근본적인 프로세스는 간세포 세포 골격, 세포 세포 접촉 및 세포 외 매트릭스와의 상호 작용 사이 집합적인 상호 작용에 달려있습니다 1. 간세포 세포골격은 모든 세 필라멘트 네트워크, 액틴 세포 골격, 미세 소관 및 중간 필라멘트로 구성되며, 이는 캐닐큘러 형성을 위한 구조적 지원을 제공합니다. 담즙 카나리아 네트워크의 재생 및 유지에서 세포골격 성분의 차동 역할은 이전에 3D 콜라겐-샌드위치 간세포배양물2에서 시험관 내에서 예시되었다.
액틴 미세필라멘트 및 미세소관은2세대의 부위에서 간세포막 편광의 초기 단계에서 중요하다. 액틴 세포 골격은 담즙 카나리아의 구조와 기능을 확립하여 막 관련 미세 필라멘트와 원주 링을 형성하여 카날링 아키텍처를 지원하고 협착 된 세포 골격을 접합부3에삽입합니다. 액틴 세포골격 외부의 각질 중간 필라멘트의 고리는 캐날링 구조를 더욱 안정화시킵니다3.
담즙 canaliculi 건축의 조직에서 간세포 접합 복합체에 있는 단백질의 중요성은 단단히 및/또는 접합단백질을모두 결여된 마우스에 있는 왜곡된 canaliculi를 보여주는 몇몇 녹아웃 마우스 모형에서 잘 문서화되었습니다 접합 단백질4,5,6. 접착접점 단백질 α-카테닌의 결실은 간세포 액틴 세포골격의 해체, 담즙 담낭 루멘의 팽창, 새는 단단한 접합부, 및 담즙정체 표현형4에효과적으로 유도하는 것으로 나타났다. 더욱이, 시험관내 연구는 간세포 정점 루멘 및 단백질 인신매매의 리모델링에서 접합 성분 인E-카데린 및 β-카테닌의 중요성을 보여주었다7.
놀랍게도, 주요 각질 조직자인 세포골격 가교 단백질 plectin의 절제는, actin 세포골격에 연결된 것과 비교되는 표현형을밝혀냈습니다 8. 이것은 캐날링 구조물의 지원에 있는 각질 중간 필라멘트의 중요한 역할을 건의합니다. 3D 간세포 콜라겐 샌드위치를 이용한 시험관내 연구는 또한 담즙 카나리아 네트워크 형성에서 AMP 활성화 단백질 키나아제 및 그의 상류 활성제 LKB1의 중요성을 보여주었다9. 이러한 발견은 그 후 의 생체 내 연구10,11에의해 추가로 확인되었다. 따라서, 체외 연구는 간세포 편광의 확립에 관여하는 신호 과정의 이해를 더 필요하게되었다, 적절한 canalicular 네트워크 형성, 및 담즙 분비.
담즙 카나이큘라 형성과 연결된 과정을 연구하는 데 큰 도전과 시험관 내 병리학적 상황에 대한 반응은 생체 내 상황과 밀접하게 유사한 세포 배양 조건을 사용하는것이다 12. 갓 분리 된 1 차 간세포는 편광되지 않습니다. 따라서, 그들은 2D 배양 조건에서 그들의 기능, 형태, 및 기능성 담즙 카나리아를 잃는다 (예를 들어, 유전자 조절의 변화, 편광, 및 탈분화13,14,15). 이러한 사실에도 불구하고, 갓 단리된 간세포는 간 유래세포주(16)와는 달리 생체 내에서 간체의 성질을 가장 밀접하게 반영한다. 그들은 과거에 사용되었지만, 불멸의 세포주는 간세포의 상피와 같은 특징적인 형태를 발휘하지 않으며, 이들 세포에 의해 형성된 담즙 혈관 루멘은 간 카나큘리와 잘 어우러진다7. 최근, 1차 간세포의 3D 배양물, 마우스 및 쥐 둘 다에서, 시험관내 담즙 관상 네트워크 형성에 관여하는 프로세스를 조사하는 유용한 도구가 되었다9. 콜라겐의 두 층 사이에서 배양된 1차 간세포(3D 콜라겐 샌드위치 문화라고함)는 며칠 만에 재분극화될 수 있습니다. 3D 콜라겐 샌드위치에서 마우스 간세포를 배양할 때 요구되는 높은 기술적 요구로 인해 담즙 카나리아 형성 시 세포골격 구성 요소의 개입을 특성화하기 위해 3D 콜라겐 샌드위치에 내장 된 면역 라벨 마우스 간세포분리, 재배 및 면역 라벨을 지정하는 복잡한 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
모든 동물 실험은 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 체코 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 재료
- 일반 차우와 식수에 무료로 액세스 할 수있는 실험실 동물 과학 협회 연맹의 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건하에서 동물을 수용하십시오. 12 h/12 h/12 h의 어두운/빛 주기 하에 동물을 하우스합니다. 간세포의 고립과 문화를 위해 8-12주된 동물을 사용하십시오.
- 재고 솔루션 A 및 B
- 표 1과 표 2에따라 재고 솔루션 A와 재고 솔루션 B를 각각 사전에 준비합니다. 증류된 H 2 O(dH2O)의1L에 모든성분을용해시.
- 솔루션의 pH를 7.2로 조정하고 0.2 μm 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. 두 솔루션 모두 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 재고 솔루션 C
- 1 차 간세포 격리 당일 용액 C를 준비하십시오.
- 표 3에 따라 모든 구성 요소를 추가하고 dH2O로 총 부피를 50mL로 채우고 용해하십시오. pH를 7.3으로 조정합니다.
- 50 mL 튜브에서 용액의 50 mL. 동물 당 하나의 튜브를 사용하십시오. 필요한 모든 알리쿼트들을 예열된 수조(37°C)에 놓습니다.
- 재고 솔루션 D
- 1 차 간세포 격리 당일 용액 D를 준비하십시오.
- 표 4에따라 모든 구성 요소를 추가하고 dH2O로 30 mL 총 부피를 채우고 용해하십시오. pH를 7.3으로 조정합니다.
- 50 mL 튜브에서 용액의 30 mL. 콜라게나제 I(5 mg/30 mL)을 용액 D. 동물당 1개의 알리쿼트(aliquot)를 사용하십시오. 모든 알리쿼트(aliquots)를 예열된 수조(37°C)에 놓습니다.
- 재고 솔루션 E
- 1차 간세포 격리 당일 용액 E를 준비합니다.
- 표 5에 따라 모든 구성 요소를 추가하고 dH2O로 총 부피를 50mL로 채우고 용해하십시오. pH를 7.3으로 조정합니다.
- 50 mL 튜브에서 용액의 50 mL. 알부민 V(0.65 g/50 mL)를 용액 E. 동물당 하나의 알리쿼트(aliquot)에 추가합니다. 모든 알리쿼트(aliquots)를 예열된 수조(37°C)에 놓습니다.
2. 콜라겐 샌드위치 준비
- 1 차 간세포 분리 전에 하루, 콜라겐 I 샌드위치의 첫 번째 층을 준비합니다.
참고: 얼음을 바르고 미리 차갑게 한 용액, 팁, 플레이트, 튜브를 사용하여 콜라겐 I의 원치 않는 겔화를 최소화하십시오. - 제조업체의 프로토콜에 따라 필요한 양의 콜라겐 I(쥐 꼬리에서)을 중화시다. 실험 샘플(3.5 cm 접시)당 중화 콜라겐(1.5 mg/mL)의 부피가 필요합니다. 중화 콜라겐 1 mL(1.5 mg/mL)을 준비하려면 100 μL의 DMEM 100μL, 1M NaOH의 1.5 μL, 48.5 μL의 dH2O를 콜라겐 500 μL(재고 농도 = 3 mg/mL)을 추가합니다. 리트머스 종이로 중화 콜라겐의 pH를 확인하십시오 (pH는 ~ 7.5여야합니다).
- 얼음 위에 놓인 3.5cm 접시의 표면에 미리 차가운 200 μL 팁을 사용하여 중화 콜라겐 용액 100 μL을 고르게 분산시.
- 표준 배양 조건하에서 하룻밤 동안 배양하십시오 (37 °C에서 5 %CO2가있는 인큐베이터). 1차 간세포 분리의 날에, 첫 번째 콜라겐 층에 미리 온난(37°C) PBS 1 mL을 추가합니다. 콜라겐이 37°C에서 2-3시간 동안 수분을 보충합니다.
3. 장비 설정
- 그림 1과같이 재료 표에 나열된 대로 모든 장비를 준비하고 설정합니다.
4. 외과 적 수술
- 타일타민 (체중 60 mg/kg), 졸라제팜 (60 mg /kg), 자일라진 (4.5 mg /kg)의 근육 주사로 마우스를 마취시. 몇 분 후, 발가락 핀치에 의해 적절한 마취를 확인하십시오. 동물이 핀치에 반응하지 않으면 4.2로 진행하십시오.
- 마취된 마우스를 해부 매트 위에 놓고 아래쪽및 상지의 테이프를 붙이고 마우스를 척추 위치에 고정시다. 70 % 에탄올로 복부를 면봉하고 음모 부위에서 앞다리까지 V 자형 절개로 복부를 엽니다. 복강을 밝히기 위해 가슴에 피부를 접습니다. 해부 매트를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
- 인슐린 주사기 바늘(30G)을 45° 각도로 구부립니다. 꼬리 방향으로 장과 결장이동하여 열등한 정맥(IVC)을 노출시다.
- 2.5 mL의 미리 온난(37°C) 용액 C를 캐뉼라로 2 mL 주사기에 채웁니다. 캐뉼라 나 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.
- IVC의 통조림 전에 젖은 (PBS) 면봉으로 횡격막까지 눌러 간 엽을 재배치하십시오. 간 바로 아래에 IVC 주위에 실크 봉합사를 놓습니다(그림 2A,B).
- 45° 각도로 구부러진 30G 바늘로 인슐린 주사기를 사용하여 10 μL의 헤파린 (5000 U/mL)을 문맥에 주입하십시오(그림 2C).
- 간을 담조로이하려면, 간 바로 옆에 IVC에 미세 수술 가위로 작은 절개를 (봉합사 아래; 도 2D)는캐뉼라를 삽입할 수 있을 만큼 충분히 크다. 봉합사와 두 개의 수술 매듭을 사용하여 위치에 캐뉼라를 고정하십시오(그림 2E).
- 관류 완충제가 간에서 흘러 나와 간이 팽창하는 것을 방지할 수 있도록 문맥(그림2F)을잘라낸다.
- 캐뉼라에 연결된 주사기를 천천히 눌러 미리 데운 용액 C의 1.5 mL로 간을 수동으로 침전시하십시오 (이것은 ~ 15 s가 소요됩니다). 간변색에 의한 간에서 혈액을 제거하는 것을 이제 관찰 할 수 있습니다.
- 연동 펌프를 미리 데운(37°C) 용액C. 관류 장치를 확인하고 시스템에 기포가 없는지 확인합니다.
- 조심스럽게 주사기에서 캐뉼라를 분리하고 2.5 mL / min의 유량속도로 작동하는 연동 펌프의 튜브에 연결하십시오.
- 2 분 동안 용액 C (용액 C의 5 mL)로 간을 침전시하십시오. 용액 D로 변경하고 추가로 10 분 동안 관류를 계속 (용액 D의 25 mL).
- 간이 침투되면 복강에서 제거하십시오. 간은 이제 매우 깨지기 쉽고 창백한 색이 될 것입니다(그림 3).
5. 1 차 간세포의 격리
- 마우스에서 간을 제거합니다. 캐뉼라는 여전히 간과 연결되어 있으므로 집게를 사용하여 간으로 캐뉼라를 들어 올리고 모든 근막 연결을 조심스럽게 차단하십시오. 미리 온난한 용액 E의 20 mL를 포함하는 50 mL 관에 간을 전송합니다.
- 집게를 사용하여 간과 캐뉼라를 잡고 분리 된 간을 완충물로 옮기기 위해 튜브 벽 주위에 간을 문질러 조직을 분리하십시오. 얼음에 고립 된 세포를 유지합니다.
참고 : 고립 된 기본 간세포는 얼음에 보관하는 동안 몇 시간 동안 실행 가능합니다. 사용자는 4.1~5.2단계의 1차 간세포를 다른 기증자 마우스로부터 분리하거나, 필요한 경우, 또는 다음 단계로 진행할 수 있다. - 70 μm 나일론 세포 스트레이너를 50 mL 튜브 위에 놓고 분리 된 세포를 필터링하십시오.
- 튜브를 50 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 죽은 세포를 제거하고 생존 세포의 비율을 증가시키기 위해, DMEM에 있는 40% 퍼콜의 20 mL에 있는 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 튜브를 50 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 죽은 세포를 함유하는 상월체를 흡인하고 용액 E의 20 mL에서 펠릿을 다시 중단한다.
- 원심분리기 튜브를 50 x g 및 4°C에서 5분 동안 흡인하고 용액 E의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 트라이판 블루 염색을 사용하여 기본 간세포 수율과 생존가능성을 확인하십시오. Neubauer 세포 카운팅 챔버를 사용하여 세포 수를 계산하고 세포 농도를 3.75 x 105 생존 세포/mL로 조정합니다. 얼음에 세포를 유지합니다.
6. 3D 콜라겐 샌드위치로 1차 간세포 재배
- 간세포 배양 배지(HCM)를 준비합니다. 완전한 배지(DMEM, 고당포도, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 글루카곤 15μL(1 mg/mL), 하이드로코르티손 15μl(50 mg/mL), 인슐린 40 μL(10 mg/mL)을 추가합니다.
- 미리 코팅된 3.5cm 접시에 2 mL(5 x 105 세포/mL)의 생존 가능한 1차 간세포를 고르게 분산시다. 37 °C에서 5%CO2로 세포를 배양하는 것이 중요합니다.
- 중화 콜라겐 I (100 μL / 3.5 cm 접시, 즉, [단계 2.1]에 설명 된 모든 요리에 대한 충분한 볼륨을 준비합니다. 사용 전까지 얼음을 유지하십시오.
- 3 시간 후, 조심스럽게 배지와 부착되지 않은 세포를 제거하고 각 3.5 cm 접시에 중화 콜라겐 I 100 μL을 추가하여 세포에 콜라겐 샌드위치의 최상층을 형성합니다. 콜라겐 샌드위치를 표준 세포 배양 조건(37°C에서 5%CO2)에서 1시간 동안 배양합니다. 1 시간 배양 후, 조심스럽게 HCM 2 mL을 추가하십시오.
- 배양 24시간 후, HCM 배지를 변경하여 신선한 배지로 바꿉니다.
- 담즙 카날리큘리의 형성에 따라 3-8 일 동안 배양하십시오. 현미경으로 매일 배양을 확인한다(그림4). 두 번째 날마다 HCM을 변경합니다.
7. 3D 콜라겐 샌드위치의 1 차 간세포의 면역 라벨링
- 간세포 샌드위치에서 미디어를 제거한 다음 미리 데운 PBS로 조심스럽게 씻으하십시오. 샌드위치 배양액을 PBS에서 4% 파라포름알데히드 1mL로 실온(RT)에서 30분 동안 고정합니다.
- 고정 후, 샌드위치를 3x 10분 동안 PBS 2 mL + 0.1% 트웬 20(PBS-T)으로 세척합니다.
- 0.1 M 글리신의 1 mL, 0.2 % 트리톤 X-100을 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 10 분 동안 3x 씻어 내다.
- 충분한 항체 침투를 보장하기 위해 진공 흡인에 연결된 10 μL 로딩 팁을 사용하여 콜라겐의 상부 층을 부드럽게 방해합니다.
- PBS-T(즉, 차단 용액)에서 1 mL의 BSA를 2시간 동안 차단하여 1차 항체를 밤새 37°C에서 차단용액으로 희석한 1차 항체로 인큐베이팅한다. PBS-T에서 15분 동안 3x를 씻으소서.
- 세척 후, 이차 항체를 37°C에서 5h. PBS-T에서 15분 동안 3x 세척한 다음 증류된H2O로 1x 세척한 후 배양합니다.
- 현미경 검사용 안티 페이드 장착 용지(재료 표참조)로 마운트합니다.
Representative Results
마우스 1차 간세포는 3D 콜라겐 샌드위치로 분리하고 씨를 뿌렸다. 두 개의 인접한 세포 사이 담 즙 canaliculi 파종 후 몇 시간 이내에 형성 하기 시작. 세포는 1 일 이내에 담즙 canaliculi의 대략 정규 네트워크에서 클러스터를 형성하고 자기 조직화했습니다(그림 4). 3-6 일 안에, 5-10 세포의 클러스터는 일반적으로 관찰되었다, 완전히 편광 된 간세포는 캐날리 네트워크를 형성(그림 4).
독소 (에탄올) 또는 세포 골격 변경 약물 (예를 들어, 3D 콜라겐 샌드위치에서 기본 마우스 간세포의 치료 블레비스타틴, 오카다산)은 간세포 세포골격, 카날리큘리 폭, 모양 및 면역표지에 의해 예시된 담즙 카날리큘리의 수(간세포에서 가장 풍부한 케라틴), 팔로이드(F-액틴 시각화), 및 항체에 대한 단백질 1개(가시화 F-액틴) 및 항체의 변화를 초래하였다. 그림 5).
에탄올 치료는 각질 8의 조직에 가벼운 영향을 미쳤다; 그러나, 그것은 비틀거림을 증가 (F-액틴 염색에서 볼 수 있듯이) 담즙 캐날링 폭의 분포(그림 5). ZO-1 염색의 신호 강도는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 에탄올 처리 된 담즙 카날리큘리에서 감소하였고, 에탄올 처리 후 단단한 접합의 손실을 시사한다. 블레비스타틴과 아토미오신 수축성의 억제는 담즙 카날리큘리의 모양과 수에 크게 영향을 미쳤다. 일반 검석 네트워크는 치료되지 않은 간세포에 비해, 무질서하게 모양의 담즙 canaliculi로 재구성되었습니다 대신 얇은 긴 것 (캐내큘러 폭의 히스토그램에서 볼 수 있듯이)의 두꺼운 둥근 담즙 canaliculi의 증가된 부각.
또한, 오카다산(OA)을 억제하는 인산염을 억제하는 치료는 앞서 나타낸바와같이 케라틴의 물성에 강하게 영향을미쳤다. OA는 각질 필라멘트의 용해도를 변경; 따라서, 처리는 큰 perinuclear 골체로 붕괴된 각질 메쉬워크의 심오한 개편 귀착되었습니다. F-액틴과 단단한 접합 단백질 ZO-1은 조직된 담즙 카날리큘리의 거의 완전한 실종과 간세포 극성의 완전한 손실을 시사하는 어떤 특정 구조물로 국한되지 않았습니다. 나머지 담즙 카날리큘리는 카날레 폭 히스토그램에서 볼 수 있듯이 치료되지 않은 대조군과 비교하여 유의하게 좁혀졌다(그림5).
치료에 대한 간세포 세포골격의 변화에 대한 현미경 관찰과 치료에 대한 종세포 성화학반응의 현미경 관찰을 상호 연관시키기 위해, 이 프로토콜은 또한 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)와 아스파르타테 트랜스아미나제(AST)의 수준을 3D 에서 상층부에서 6D 로 하여세포 손상 마커로 일반적으로 사용되는 두 개의 간효소(2개의간 효소)를 측정했습니다. 에탄올 치료는 ALT와 AST 의 수준을 크게 상승시켰으며, 이는 심각한 간세포 손상을 시사합니다. Blebbistatin 처리는 ALT의 증가한 수준으로 온화한 생화확적인 변경을 시작한 오카다산 처리에 비교된 ALT와 AST 수준 둘 다에 있는 어떤 중요한 변경으로 이끌어 내주지 않았습니다, 그러나 AST의 수준에 있는 아무 변경도 없습니다. 따라서, 간세포 상판으로부터 시험관내에서 측정된 간세포 손상의 생화학적 마커는 면역 염색에 의해 관찰된 세포골격 변화와 상관관계가 있다.
그림 1: 실험 설정. (a)마우스를 척추 위치에 고정시키고, 수술 전에 해부 현미경 아래에 놓는다. 필요한 모든 수술 기구는 트레이에 놓입니다. (B)마우스 간 관류 시 관류는 저수지와 따뜻한 완충제 및 퍼퓨징된 마우스를 연결하는 실리콘 튜브를 보여주는 것이다. (C)B. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 복강의 개통 및 IVC의 통조림. 복부는 음모 부위에서 앞다리까지 V자 절개로 열립니다. 피부는 복강을 드러내고 확대하기 위하여 가슴 위로 접혀있습니다. IVC를 노출하기 위해 창자와 결장은 조심스럽게 움직입니다. (A, B) IVC의 통조림 전에, 간 엽은 PBS 젖은 면봉으로 격막에 위쪽으로 눌러 재배치되어야합니다. IVC는 조심스럽게 주변 조직에서 분리되고, 실크 봉합사는 간 에서 가까운 거리에 있는 IVC 의 주위에 배치됩니다. 패널 B는 패널 A에 표시된 복강의 회로도를 나타낸다. 간 엽, 창자, 열등한 정맥 카바 (IVC, 빨간색) 및 봉합사가 표시됩니다. (C)헤파린은 인슐린 주사기 (45 ° 각도로 구부러진 30G 바늘)로 포털 정맥 (PV, 화살표)에 주입됩니다. (D)간을 통조기로 하여, IVC는 간(봉합사 아래) 바로 옆에 절개됩니다. (E)캐뉼라를 삽입하고 두 개의 수술 매듭을 묶어 봉합사로 고정합니다. (F)문맥이 완전히 절단되어 완충액이 유출되어 간 팽창을 방지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 관류 전후의 대표적인 간 이미지. (A, B) 통조인 간을 절제하고 2.5 mL/min의 유량으로 12분 동안 관류(B)를 새로 절제한 간(A)에 비해 크게 변색된 간을 주목합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 1차 마우스 간세포의 3D 콜라겐 샌드위치 배양. 마우스 1차 간세포의 대표적인 밝은 필드 이미지는 3D 조건에서 1, 2 및 3일 동안 배양되었다. 고도로 조직 된 세포의 큰 클러스터는 배양 3 일 후에 형성된다는 점에 유의해야합니다. 박스 영역은 ~ 3배 확대된 이미지를 표시합니다. 화살촉은 담즙 카나리아를 나타냅니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 면역형광 현미경검사법에 의한 독성 스트레스에 대한 형태학적 반응의 평가. 3D 콜라겐 샌드위치로 배양된 원발성 마우스 간세포는 배양 3일째에 독소(에탄올, 블레비스타틴 또는 오카다산)로 처리하였다. 고정 세포는 세포골격 성분을 시각화하기 위해 염색하였다: 면역형광에 의해 케라틴 8(녹색), F-액틴(적색), 및 조눌라 옥루덴스-1(ZO-1, 마젠타). 독성 치료는 시각화 된 세포골격 성분의 해체로 이어졌으며 담즙 카날리큘리의 비틀거림을 감소시켰습니다. 캐눈환 폭은 처리되지 않은 간세포 와 처리된 간세포 모두에서 측정되었고 폭 분포의 히스토그램으로 묘사됩니다. 화살촉은 담즙 카나리아를 나타냅니다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 시험관 내 독성 상해에 대한 3D 간세포 콜라겐 샌드위치의 반응에 대한 생화학적 분석. ALT 및 AST, 간세포 손상의 잘 확립 된 마커, 독소 (에탄올, 블레비 스타틴, 및 오카다산)로 처리 3D 간세포 콜라겐 샌드위치에서 상층으로 측정되었다. ALT 및 AST는 처리되지 않은 세포에 비해 처리된 세포에서 상승하였다. 데이터는 산술 수단 ± SEM으로 보고됩니다.
| 스톡 솔루션 A(10x) | |
| 시약 | 최종 농도(g/리터) |
| Nacl | 80 |
| KCl | 4 |
| MgSO4·7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4·2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
표 1: 재고 솔루션 레시피.
| 스톡 솔루션 B(10x) | |
| 시약 | 최종 농도(g/리터) |
| Nacl | 69 |
| KCl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4·7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
표 2: 스톡 솔루션 B 레시피.
| 솔루션 C | |
| 시약 | |
| 스톡 솔루션 A(10x) | 5 mL |
| 나코3 | 0.1094 g |
| EGTA | 0.0095 g |
| dH2O | 50 mL |
표 3: 스톡 솔루션 C 레시피.
| 솔루션 D | |
| 시약 | |
| 스톡 솔루션 A(10x) | 3 mL |
| 나코3 | 0.065 g |
| CaCl2 | 0.0125 g |
| dH2O | 30 mL |
표 4: 스톡 솔루션 D 레시피.
| 솔루션 E | |
| 시약 | |
| 재고 용액 B(10x) | 5 mL |
| 나코3 | 0.1 g |
| 포도 당 | 0.045 g |
| dH2O | 50 mL |
표 5: 스톡 솔루션 E 레시피.
Discussion
마우스 1 차 간세포 배양의 사용은 간세포 편광, 적당한 관상 구조 대형 및 담즙 분비의 설치에 관련시킨 신호 과정을 더 잘 이해하기 위하여 시험관 내 연구 결과를 위해 중요합니다. 2D 배양에서 마우스 1차 간세포의 고립 및 장기 배양에 대한 과제는 각각 여러 가지 장점을 갖는 분리 효과 및 수명을 증가시고 여러 기술적 접근법의 발명을 주도하고 있다. 단점. 1 차적인 간세포의 2D 문화가 짧은 기간 동안 간 생물학의 속성의 제한된 수만 모방한다는 것은 지금 널리 받아들여집니다. 따라서, 콜라겐 샌드위치 배열에서3D 재배는 2D 조건을 광범위하게 대체하며, 특히 간 생물학에서 세포골격의 기능에 초점을 맞출 때(예를 들어, 담즙 수송의 독성 약물 효과 또는 공간 조직).
1980 년대 이후, 다양한 수정과 마우스 간세포의 격리를위한 몇 가지 프로토콜이 설명되었다. 2 단계 콜라게나아제 관류 접근법은 많은 실험실에서 널리 사용되고 있습니다. 격리 프로토콜에 그라데이션 원심분리를 첨가하면 죽은 세포19,20을 제거하고 생존 가능한 세포의 수를 크게 증가시킵니다 (여기서 는 일상적으로 ~ 93 %). 이 단계는 세포의 처리 시간을 연장하고 감소된 세포수(21)를초래하더라도, 이 단계는 적절한 담즙 캐날링 네트워크 형성을 위한 3D 콜라겐 샌드위치 배양에서 필요하다고 여겨진다. 또한 관류 단계에서 신속하고 정확하게 진행하는 것이 더 중요하므로 세포가 처리되는 시간이 단축됩니다.
세포의 생존력을 증가시키고 3D로 혈관 네트워크를 형성하는 능력을 증가시키는 다른 중요한 요인은 새로 준비된 용액의 사용과 관류 중 기포의 회피입니다. 따라서, 솔루션은 마우스 간세포 격리의 날에 준비되어야하며, 솔루션을 변경할 때 연동 펌프와 튜브를 확인해야합니다. 프로토콜이 밀접하게 따르는 경우에, 1 차 적인 간세포의 격리는 실행 가능한 세포의 높은 수율로 성공해야 합니다.
장기 3D 간세포 배양에 있는 또 다른 중요한 요인은 이용되는 1 차적인 간세포의 초기 근원입니다. 간세포의 최적 기증자역할을 하는 8-12주 된 동물을 사용하는 것이 중요합니다. 오래된 동물에게서 간세포의 사용은 장기 적인 문화에서 성공적이지 않았습니다, 이 간세포는 그들의 형태를 더 자주 바꾸고, 탈분극하고, 캐날큘러 네트워크를 형성하는 것을 중단했기 때문에. 또한, 비교적 고농축 용액으로 형성된 적당히 중화된 콜라겐 겔상에 간세포가 도금되는 것은 매우 중요한 단계이다. 대부분의 프로토콜에서 약 1 mg/mL의 농도가 사용됩니다. 많은 최적화 후, 1.5 mg/mL의 농도는 장기 간세포 재배에 최적이며 형성된 담즙 카날리큘리와 함께 고도로 조직된 간세포를 제공합니다.
이 따라하기 쉬운 프로토콜은 기본 마우스 간세포의 장기 재배를 허용합니다. 대표적인 결과는 담즙 카날리큘리 형성에서 세포골격 구성 요소의 역할을 연구할 때 3D 배양 된 1 차 마우스 간세포에 대한 광범위한 사용 스펙트럼을 보여줍니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 체코 공화국의 보조금 기관 (18-02699S)에 의해 지원되었다; 체코 공화국 보건부 의 보조금 기관 (17-31538A); 체코 과학 아카데미의 기관 연구 프로젝트 (RVO 68378050) 및 MEYS CR 프로젝트 (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 및 OP RDE CZ.02.01/0.0/16_013/0001775); 찰스 대학 (K.K.에 개인 급여), 및 운영 프로그램 프라하 - 경쟁력 프로젝트 (CZ.2.16/ 3.1.00/21547). 우리는 제시된 현미경 화상 진찰을 가진 지원을 위한 빛 현미경 검사법 코어 시설, IMG CAS, 프라하, 체코 공화국 (지원된 MEYS CR 프로젝트 LM2015062 및 LO1419)를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
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