Summary
Presentert her er en protokoll for isolering av musen hepatocytter fra voksen mus lever ved hjelp av en modifisert kollagenase-teknikk. Likeledes beskrevet er det lang-frist kulturen av hepatocytter inne en 3D kollagen sandwich innfatning likeledes idet immunolabeling av det cytoskjelettkomponenter komponentene å studere galle canalicular formasjon og dens svaret å handling.
Abstract
Hepatocytter er de sentrale cellene i leveren ansvarlig for sin metabolske funksjon. Som sådan danner de et unikt polarisert epitel, der to eller flere hepatocytter bidrar apikale membraner til å danne en galle canalicular nettverk gjennom hvilken galle utskilles. Hepatocytter polarisering er avgjørende for riktig canalicular formasjon og avhenger av interaksjoner mellom hepatocytter cytoskeleton, celle-celle kontakter, og ekstracellulære matrise. In vitro studier av hepatocytter cytoskeleton involvering i canaliculi formasjon og dens reaksjon på patologiske situasjoner er handikappet ved mangelen på cellekultur, som ville likne nøye den canaliculi nettverksstrukturen in vivo. Beskrevet her er en protokoll for isolering av mus hepatocytter fra voksen mus leveren ved hjelp av en modifisert kollagenase. Også beskrevet er produksjon av kultur i en 3D kollagen sandwich innstilling, som brukes for immunolabeling av cytoskjelettkomponenter komponenter for å studere galle canalicular formasjon og dens reaksjon på behandlinger in vitro. Det er vist at hepatocytter 3D kollagen sandwich kulturer svare på behandlinger med toksiner (etanol) eller utgangen cytoskeleton endre narkotika (f. eks blebbistatin) og tjene som et verdifullt verktøy for in vitro studier av galle canaliculi formasjon og funksjon.
Introduction
Hepatocytter, den sentrale cellulære strukturer i leveren som er ansvarlig for sine metabolske funksjoner, er unikt polarisert epitelceller. Deres polarisering, som vises i pattedyr kort tid etter fødselen, resulterer i dannelse av galle canalicular nettverk og er avgjørende for riktig galle sekresjon. Apikale membraner av hepatocytter kollektivt form galle canaliculi, mens basal membraner forbli i kontakt med endotelet av sinusoids. Tapet av hepatocytter polarisering fører til omfordeling av galle transportører og resultater i patologiske prosesser forbundet med galle oppbevaring i leveren (dvs. kolestase).
Etablering og vedlikehold av hepatocytter polarisering og utvikling av galle canaliculi innebære komplekse mekanismer. De underliggende prosessene avhenger av kollektivt samspill mellom hepatocytter cytoskeleton, celle celle kontakter og interaksjoner med ekstracellulære matrise1. Den hepatocytter cytoskeleton består av alle tre filament nettverk, den utgangen cytoskeleton, mikrotubuli, og mellomliggende filamenter, som gir strukturell støtte for canalicular dannelse. Differensial rollen av cytoskjelettkomponenter komponenter i regenerering og vedlikehold av galle canalicular nettverk har tidligere blitt illustrert in vitro i 3D kollagen-sandwich hepatocytter kulturer2.
Utgangen microfilaments og mikrotubuli er viktig i de innledende stadier av hepatocytter membran polarisering på steder av canaliculus generasjon2. Den utgangen cytoskeleton etablerer struktur og funksjon av galle canaliculi, forming membran-assosiert microfilaments og circumferential ringen, og dermed støtte canalicular arkitektur og sette inn utgangen cytoskeleton i stramme og adherens kryss3. Ringen av keratin mellomliggende filamenter utenfor utgangen cytoskeleton ytterligere stabiliserer canalicular struktur3.
Betydningen av proteiner i hepatocytter junctional komplekser i organiseringen av galle canaliculi arkitektur har vært godt dokumentert i flere Knock-Out musemodeller, som viser forvrengt canaliculi hos mus mangler både stramt og/eller adherens junctional proteiner4,5,6. Slettingen av det adherens krysset protein α-catenin har vist å føre til disorganization av hepatocytter utgangen cytoskeleton, dilatasjon av galle canalicular lumen, lekk trange veikryss, og effektivt til en kolestatisk fenotype4. Videre har in vitro studier vist viktigheten av adherens Junction komponenter E-cadherin og β-catenin i ombygging av lever apikale lumen og protein smugling7.
Påfallende, ablasjon av det cytoskeleton Cross Linking protein plectin, hvilke er det større keratin organisator, har avsløre fenotyper sammenlignbare å dem sammenkoblet å det utgangen cytoskeleton8. Dette antyder en kritisk rolle av keratin mellomliggende filamenter i støtte av canalicular struktur. In vitro studier utnytte 3D hepatocytter kollagen smørbrød har også vist viktigheten av AMP-aktivert protein kinase og oppstrøms aktivator LKB1 i galle canalicular nettverk formasjon9. Disse funnene ble deretter ytterligere bekreftet av senere in vivo studier10,11. Dermed har det blitt klart at in vitro studier er nødvendig for å fremme forståelsen av signalering prosesser involvert i etableringen av hepatocytter polarisering, riktig canalicular nettverk formasjon, og galle sekresjon.
En stor utfordring i å studere prosesser knyttet til galle canalicular formasjon og dens reaksjon på patologiske situasjoner in vitro bruker en cellekultur forhold som ligner situasjonen i vivo12. Nylig isolerte primære hepatocytter er ikke polarisert; dermed mister de sin funksjon, morfologi, og funksjonell galle canaliculi i 2D kultur forhold (f. eks, endringer i gen regulering, polarisering, og de-differensiering13,14,15). Til tross for dette faktum, fersk isolert hepatocytter nærmest reflekterer natur leveren in vivo, i motsetning til lever-avledet cellelinjer16. Selv om de har vært brukt i det siste, udødeliggjort cellelinjer ikke utøve epitel-lignende karakteristiske morfologi av hepatocytter, og galle canalicular lumen dannet av disse cellene ligne leveren canaliculi dårlig7. I den seneste tid, 3D kulturen av primære hepatocytter, fra begge to mus og rotter, ha bli en nyttig verktøyet å etterforske prosesser involvert inne galle canalicular nettverk formasjon inne vitro9. Primær hepatocytter kultivert mellom to lag av kollagen (referert til som en 3D-kollagen sandwich kultur) kan repolarize i flere dager. På grunn av høye tekniske krav som kreves når dyrking mus hepatocytter i 3D kollagen smørbrød, her presenterer vi en kompleks protokoll for å isolere, å dyrke, og å immunolabel mus hepatocytter innebygd i 3D kollagen smørbrød for å karakterisere involvering av cytoskjelettkomponenter komponenter under galle canalicular formasjon.
Protocol
Alle dyre eksperimenter ble utført i samsvar med EU-direktiv 2010/63/EU, og de ble godkjent av den tsjekkiske sentral Kommisjonen for dyrevelferd.
1. materialer
- Husdyr under spesifikke patogen-frie forhold i henhold til retningslinjene i Federation for Laboratory Animal Science foreninger med fri tilgang til vanlig Chow og drikkevann. Husdyr under en 12 h/12 h mørk/lys syklus. For hepatocytter isolasjon og kultur, bruk 8-12 uke gamle dyr.
- Stock-løsninger A og B
- Forbered lagerløsning A og lagerløsning B i henhold til henholdsvis tabell 1 og tabell 2på forhånd. Oppløse alle komponenter i 1 L av destillert H2o (dH2o).
- Juster pH-verdien i løsninger til 7,2 og Filtrer løsningene gjennom et 0,2 μm-filter. Begge løsninger kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 6 måneder.
- Lagerløsning C
- Forbered løsning C på dagen for primær hepatocytter isolasjon.
- Legg til alle komponenter i henhold til tabell 3, fyll til et 50 ml totalt volum med dH2O, og løs opp. Juster pH til 7,3.
- Alikvot 50 mL oppløsning i 50 mL rør. Bruk ett rør per dyr. Plasser alle nødvendige alikvoter i et forvarmet vannbad (37 ° c).
- Stock-løsning D
- Klargjør løsning D på dagen for primær hepatocytter isolasjon.
- Legg til alle komponenter i henhold til Tabell 4, fyll til 30 ml totalt volum med dH2O, og løs opp. Juster pH til 7,3.
- Alikvot 30 mL oppløsning i 50 mL rør. Tilsett kollagenase i (5 mg/30 mL) i løsning D. Bruk en alikvot per dyr. Plasser alle alikvoter i et forvarmet vannbad (37 ° c).
- Stock løsning E
- Forbered løsning E på dagen for primær hepatocytter isolasjon.
- Legg til alle komponenter i henhold til tabell 5, fyll til et 50 ml totalt volum med dH2O, og løs opp. Juster pH til 7,3.
- Alikvot 50 mL oppløsning i 50 mL rør. Tilsett albumin V (0,65 g/50 mL) i løsning E. Bruk en alikvot per dyr. Plasser alle alikvoter i et forvarmet vannbad (37 ° c).
2. utarbeidelse av kollagen smørbrød
- En dag før primær hepatocytter isolasjon, forberede det første laget av kollagen jeg sandwich.
Merk: arbeid på isen og bruke pre-kjølt løsninger, tips, tallerkener og rør for å minimere uønskede gelation av kollagen I. - Nøytralisere den nødvendige mengden av kollagen I (fra rotte hale) i henhold til produsentens protokoll. Det kreves et volum på 100 μL av nøytralisert kollagen (1,5 mg/mL) per eksperimentell prøve (3,5 cm rett). For å klargjøre 1 mL av nøytralisert kollagen (1,5 mg/mL), tilsett 100 μL av 10x DMEM, 1,5 μL av 1M NaOH og 48,5 μL av dH2O til 500 μL av kollagen (lager konsentrasjon = 3 mg/ml). Sjekk pH av nøytralisert kollagen med Litmus papir (pH bør være ~ 7,5).
- Spre 100 μL av nøytralisert kollagen løsning jevnt ved hjelp av en pre-kjølt 200 μL spissen over overflaten av en 3,5 cm parabol satt på isen.
- Ruge overnatter under standard kultur forhold (inkubator med 5% CO2 ved 37 ° c). På dagen for primær hepatocytter isolasjon, tilsett 1 mL pre-varmet (37 ° c) PBS til det første kollagen laget. La kollagen til rehydrate for 2-3 h ved 37 ° c.
3. utstyr satt opp
- Klargjør alt utstyr som er listet opp i materialfortegnelsen , og sett opp som vist i figur 1.
4. kirurgisk prosedyre
- Bedøve musen ved intramuskulær injeksjon av tiletamine (60 mg/kg kroppsvekt), zolazepam (60 mg/kg) og xylazine (4,5 mg/kg). Etter flere minutter, bekrefter riktig bedøvelsen av toe klype. Hvis dyret ikke reagerer på knipe, Fortsett til 4,2.
- Plasser anesthetized musen på en disseksjon matte og tape nedre og øvre ekstremiteter å feste musen i en liggende posisjon. Serviett magen med 70% etanol og åpne magen med en V-form snitt fra kjønnshår området til fremre ben. Brett huden over brystet for å avdekke bukhulen. Plasser den dissekere matten under et dissekere mikroskop.
- Bøy en insulinsprøyte nål (30 G) til en 45 ° vinkel. Utsett den underlegne vena cava (IVC) ved å flytte tarmen og kolon i caudal retning.
- Fyll 2,5 mL pre-varmet (37 ° c) oppløsning C i en 2 mL sprøyte med kanyle. Sørg for at det ikke er luftbobler i kanyle eller sprøyten.
- Før kanyleringen av IVC, omplassere leveren fliker ved å trykke dem opp til membranen med en våt (PBS) bomullsdott. Plasser en silke Sutur rundt IVC rett under leveren (figur 2a, B).
- Injiser 10 μL av heparin (5000 U/mL) i Portal venen ved hjelp av en insulinsprøyte med en 30 G nål bøyd i en 45 ° vinkel (figur 2C).
- For å kannelerer leveren, lage et lite snitt med mikrokirurgisk saks til IVC direkte ved siden av leveren (under Sutur; Figur 2D) som er stor nok til å sette inn kanyle. Fest kanyle i stillingen med sting og to kirurgiske knuter (figur 2E).
- Skjær portalen vene (figur 2F) for å tillate at luft buffere strømmer ut fra leveren for å hindre ekspansjon av leveren.
- Manuelt perfuse leveren med 1,5 mL pre-varmet løsning C ved langsomt å trykke på sprøyten koblet til kanyle (dette bør ta ~ 15 s). Fjerning av blod fra leveren ved misfarging av leveren kan nå observeres.
- Pre-fylle en peristaltisk pumpe med pre-varmet (37 ° c) løsning C. Kontroller at det ikke er luftbobler i systemet.
- Koble forsiktig kanyle fra sprøyten og koble den til slangen på den peristaltisk pumpen med strømningshastighet på 2,5 mL/min. arbeid raskt, men forsiktig og sikre at kanyle forblir i posisjon og at ingen bobler inn i slangen eller kanyle.
- Perfuse leveren med løsning C i 2 min (5 mL oppløsning C). Bytt til løsning D og fortsett med en ekstra 10 min (25 mL oppløsning D).
- Når leveren er perfusert, fjerne den fra bukhulen. Leveren vil nå være svært skjør og blek i fargen (Figur 3).
5. isolering av primær hepatocytter
- Fjern leveren fra musen. Kanyle vil fortsatt være knyttet til leveren, så bruk tang for å løfte kanyle med leveren, og nøye avskåret alle bånd tilkoblinger. Overfør leveren til en 50 mL rør som inneholder 20 mL pre-varmet løsning E.
- Hold kanyle med leveren ved hjelp av pinsett og fjerne tilknytningen til vevet ved å gni leveren rundt veggen av røret for å overføre den isolerte hepatocytter til buffer. Hold de isolerte cellene på isen.
Merk: isolerte primære hepatocytter er levedyktig i flere timer mens holdt på isen. Brukernes kanne gjentagelse skritt 4,1 igjennom 5,2 isolere primære hepatocytter fra en annen donor musen, dersom det er nødvendig, eller gå videre å morgendagen steg. - Plasser en 70 μm nylon celle sil på toppen av en 50 mL rør og filtrere de isolerte cellene.
- Sentrifuger røret ved 50 x g og 4 ° c i 5 min. aspirer supernatanten. For å fjerne døde celler og øke prosentandelen av levedyktige celler, resuspend pellet i 20 mL 40% percol i DMEM.
- Sentrifuger røret ved 50 x g og 4 ° c i 5 min. aspirer supernatanten som inneholder døde celler og resuspend pellet i 20 ml oppløsning E.
- Sentrifugerør ved 50 x g og 4 ° c i 5 min. aspirer supernatanten og resuspend pellet i 10 ml oppløsning E.
- Sjekk den primære hepatocytter avkastning og levedyktighet ved hjelp trypan blå farging. Telle celle nummeret ved hjelp av en Neubauer celle telling kammer og justere celle konsentrasjonen til 3,75 x 105 levedyktige celler/ml. Hold cellene på isen.
6. dyrking av primær hepatocytter i 3D kollagen smørbrød
- Forbered hepatocytter kultur medium (HCM). Tilsett 15 μL av glukagon (1 mg/mL), 15 μL av Hydrocortisone (50 mg/ml) og 40 μL av insulin (10 mg/mL) til 50 mL komplett medium (DMEM, høy glukose, 10% FBS, 1% penicillin-Streptomycin).
- Jevnt spre 2 mL (5 x 105 celler/ml) av levedyktige primære hepatocytter i en pre-belagt 3,5 cm parabolen. Ruge cellene med 5% CO2 ved 37 ° c for 3 t. viktig: jevnt fordele cellene ved å vippe parabolen i alle retninger like før du setter parabolen i inkubator.
- Forbered nøytralisert kollagen I (100 μL/3.5 cm parabol, dvs. et tilstrekkelig volum for alle rettene som beskrevet ovenfor [trinn 2,1]). Hold på isen til bruk.
- Etter 3 h, forsiktig fjerne medium og ledige celler og tilsett 100 μL av nøytralisert kollagen jeg til hver 3,5 cm parabol å danne det øverste laget av kollagen sandwich på celler. Ruge kollagen sandwich under standard celle-kultur forhold (5% CO2 ved 37 ° c) for 1 t. Etter en 1 h inkubasjons, tilsett forsiktig 2 mL HCM.
- Etter 24 h av kultur, endre HCM medium for en ny en.
- Kultur for 3 – 8 dager, avhengig av dannelsen av galle canaliculi. Sjekk kulturen hver dag under et mikroskop (Figur 4). Endre HCM annenhver dag.
7. Immunolabeling av primær hepatocytter i 3D kollagen smørbrød
- Fjern mediene fra hepatocytter smørbrød, vask deretter forsiktig med forvarmet PBS. Fest sandwich-kulturene med 1 mL 4% paraformaldehyde i PBS i 30 min ved romtemperatur (RT).
- Etter fiksering, vask smørbrødene 3x i 10 min i 2 mL PBS + 0,1% mellom 20 (PBS-T).
- Permeabilize celler med 1 mL 0,1 M Glycine, 0,2% Triton X-100 i PBS ved RT for 1 h. vask 3x i 10 min i PBS-T.
- Forsiktig forstyrre det øverste laget av kollagen ved hjelp av et 10 μL laste spiss som er koblet til et vakuum aspirasjon for å sikre tilstrekkelig antistoff inntrengning.
- Blokk med 1 mL 5% BSA i PBS-T (dvs. blokkerings løsning) for 2 h. ruge med primær antistoffer fortynnet i blokkerings løsning over natten ved 37 ° c. Vask 3x i 15 min i PBS-T.
- Etter vask, ruge med sekundært antistoff ved 37 ° c i 5 h. vask 3x i 15 min i PBS-T etterfulgt av 1x vask med destillert H2O.
- Monter med anti-fade monterings medier (se tabell over materialer) for mikroskopi.
Representative Results
Mouse primære hepatocytter ble isolert og seeded i 3D kollagen smørbrød. Galle canaliculi mellom to tilstøtende celler begynte å dannes i løpet av flere timer etter såing. Celler dannet klynger og selv-organisert i et tilnærmet vanlig nettverk av galle canaliculi innen 1 dag (Figur 4). Innen 3-6 dager, klynger av 5-10 celler ble vanligvis observert, med fullt polarisert hepatocytter danner et canalicular nettverk (Figur 4).
Behandling av primær mus hepatocytter i 3D kollagen smørbrød med enten gift (etanol) eller cytoskeleton-manipulerer legemidler (f. eks blebbistatin, okadaic syre) resulterte i endringer i hepatocytter cytoskeleton, canaliculi bredde, form og antall galle canaliculi illustrert ved immunolabeling med et antistoff til keratin 8 (den mest tallrike keratin i hepatocytter), phalloidin (visualisere F-utgangen), og antistoff til stramt veikryss protein zonula occludens-1 (ZO-1; Figur 5).
Etanol behandling hadde bare en mild effekt på organiseringen av keratin 8; imidlertid økte det tortuosity (sett fra F-utgangen farging) og distribusjon av galle canalicular bredder (figur 5). Signalet intensiteten av ZO-1 farging ble redusert i etanol-behandlet galle canaliculi sammenlignet med ubehandlede kontroller, noe som tyder på tap av stramme veikryss etter etanol behandling. Hemming av actomyosin contractility med blebbistatin signifikant påvirket form og antall galle canaliculi. Den vanlige canalicular nettverket ble omorganisert, sammenlignet med ubehandlet hepatocytter, i uorganisert formet galle canaliculi med en økt forekomst av tykt avrundet galle canaliculi i stedet for tynne lange seg (som sett i histogrammet av canalicular bredder).
I tillegg, behandling med okadaic acid (OA) hemme phosphatases sterkt påvirket de fysiske egenskapene til keratins, som tidligere vist8,17. OA endrer løselighet av keratin filamenter; dermed behandlingen resulterte i dyp omorganisering av keratin meshwork, som kollapset i store perinukleære antinøytrofile aggregater. Både F-utgangen og stramt veikryss protein ZO-1 ble ikke lokalisert inn i noen spesielle strukturer, antyder nesten fullstendig forsvinningen av organiserte galle canaliculi og et fullstendig tap av hepatocytter polaritet. De resterende galle canaliculi ble signifikant smalere sammenlignet med ubehandlede kontroller, som sett i canalicular bredde histogrammet (figur 5).
For å koordinere mikroskopiske observasjoner av endringer i hepatocytter cytoskeleton med den lever biokjemiske responsen på behandlingen, målte protokollen også nivåene av alanin alaninaminotransferase (ALAT) og aspartate aspartattransaminase (AST) (to leverenzymer som ofte brukes som leverskade markører) i supernatanten fra 3D kollagen smørbrød (figur 6)18. Etanol behandling betydelig forhøyet nivåene av både ALAT og AST, noe som tyder alvorlig lever Kader. Blebbistatin behandling førte ikke til noen betydelige endringer i både ALAT og AST nivåer sammenlignet med okadaic syre behandling, som utløste milde biokjemiske endringer med økte nivåer av ALT, men ingen endring i nivåene av AST. Således, biokjemiske markører for lever Kader målt in vitro fra hepatocytter supernatanten relatere med cytoskjelettkomponenter endringer observert av immunostaining.
Figur 1: eksperimentell oppsett. (A) mus fast i en liggende posisjon, er plassert under et dissekere mikroskop før operasjonen. Alle kirurgiske instrumenter som kreves er plassert på et brett. (B) programpakken under mus leveren som viser silikon slange som forbinder reservoaret med varm buffer og perfusert musen. (C) skjematisk representasjon av B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: åpning av bukhulen og kanyleringen av IVC. Buken er åpnet med en V-form innsnitt fra kjønnshår området til front ben. Huden brettes over brystet for å avdekke og forstørre bukhulen. For å eksponere IVC, tarmen og kolon er nøye flyttet caudally. (A, B) Før kanyleringen av IVC, bør leveren fliker flyttes ved å trykke dem oppover til membranen med en PBS-fuktet bomullsdott. IVC er deretter nøye adskilt fra omkringliggende vev, og en silke Sutur er plassert rundt IVC i nærheten av leveren. Panel B representerer skjematisk av bukhulen vist i panel A. Leveren fliker, gut, dårligere vena cava (IVC, rød), og Sting er indikert. (C) heparin injiseres i portalen VENE (PV, pil) med en insulinsprøyte (30 G nål bøyd ved 45 ° vinkel). (D) for å kannelerer LEVEREN, IVC er radert rett ved siden av leveren (under Sutur). (E) kanyle settes inn og sikres med sting ved å binde to kirurgiske knuter. (F) portalen venen er helt kuttet for å tillate fri buffer utløp, forebygge leveren ekspansjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative lever bilder før og etter (A, B) Den kanylert leveren ble resected og perfusert i 12 minutter ved en strømningshastighet på 2,5 mL/min. Merk den signifikant misfarget leveren etter å ha fått (B) sammenlignet med den ferske resected leveren (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:3D kollagen sandwich kultur av primær mus hepatocytter. Representative lyse felt bilder av mus primære hepatocytter kultivert for 1, 2 og 3 dager i 3D-forhold. Det bør bemerkes at større klynger av svært organiserte celler er dannet etter 3 dager i kulturen. Innrammet områder viser ~ 3x forstørrede bilder. Pilspisser angir galle canaliculi. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: evaluering av morfologiske respons på giftig stress ved immunofluorescent mikroskopi. Primær mus hepatocytter kultivert i 3D kollagen smørbrød ble behandlet med toksiner (etanol, blebbistatin, eller okadaic acid) på dag 3 av kulturen. Faste celler ble flekkete å visualisere cytoskjelettkomponenter komponenter: keratin 8 (grønn), F-utgangen (rød), og zonula occludens-1 (ZO-1, magenta) ved immunofluorescence. Den giftige behandlingen førte til disorganization av visualisere cytoskjelettkomponenter komponenter, og det reduserte antallet og økt tortuosity av galle canaliculi. Canalicular bredder ble målt i både ubehandlet og behandlet hepatocytter og er avbildet som histogrammer av bredder distribusjon. Pilspisser angir galle canaliculi. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: biokjemiske analyse av responsen til 3D hepatocytter kollagen smørbrød til giftig skade in vitro. ALAT og AST, veletablerte markører for lever Kader, ble målt i supernatanten fra 3D hepatocytter kollagen smørbrød behandlet med toksiner (etanol, blebbistatin, og okadaic syre). ALAT og AST var forhøyet i behandlede celler i forhold til ubehandlet seg. Data rapporteres som aritmetiske midler ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Lagerløsning A (10x) | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon (g/liter) |
| Nacl | 80 |
| KCl | 4 |
| MgSO4· 7H2O | 1,97 |
| Na2HPO4· 2h2O | 0,598 |
| KH2PO4 | 0,6 |
Tabell 1: lagerløsning en oppskrift.
| Lagerløsning B (10x) | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon (g/liter) |
| Nacl | 69 |
| KCl | 3,6 |
| KH2PO4 | 1,30 |
| MgSO4· 7H2O | 2,94 |
| CaCl2 | 2,772 |
Tabell 2: lagerløsning B oppskrift.
| Løsning C | |
| Reagens | |
| Lagerløsning A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1094 g |
| EGTA | 0,0095 g |
| dH2O | til 50 mL |
Tabell 3: lagerløsning C oppskrift.
| Løsning D | |
| Reagens | |
| Lagerløsning A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0,065 g |
| CaCl2 | 0,0125 g |
| dH2O | til 30 mL |
Tabell 4: lagerløsning D oppskrift.
| Løsning E | |
| Reagens | |
| Lagerløsning B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glukose | 0,045 g |
| dH2O | til 50 mL |
Tabell 5: lagerløsning E oppskrift.
Discussion
Bruk av musen primære hepatocytter kulturer er viktig for in vitro studier for å bedre forstå signalering prosessene som er involvert i etableringen av hepatocytter polarisering, riktig canalicular struktur dannelse, og galle sekresjon. Utfordringene i isolasjon og langsiktig kultur av mus primære hepatocytter i 2D kultur har drevet oppfinnelsen av flere tekniske tilnærminger med økt isolasjon effektiviteten og levetid på isolerte celler, hver med flere fordeler og Ulemper. Det er nå allment akseptert at 2D kulturer av primære hepatocytter etterligne bare begrenset antall attributter av leveren biologi for en kort periode. Således, 3D dyrking i en kollagen sandwich arrangement er mye erstatte 2D forhold, spesielt når fokusert på funksjon av cytoskeleton i leveren biologi (f. eks, giftige narkotika effekter eller romlig organisering av galle transport).
Siden 1980-tallet har det blitt beskrevet flere protokoller for isolering av muse hepatocytter med ulike modifikasjoner. Den to-trinns kollagenase-tilnærmingen har blitt mye brukt i mange laboratorier. Tillegg av gradient sentrifugering inn i isolasjons protokollen tillater fjerning av døde celler19,20 og signifikant øker antall levedyktige celler (her, rutinemessig til ~ 93%). Selv om dette trinnet forlenger håndterings tiden av cellene og resulterer i redusert celle tall21, er dette trinnet sett på som nødvendig i 3D kollagen sandwich kultur for riktig galle canalicular nettverk formasjon. I tillegg er det viktigere å fortsette raskt og nøyaktig i løpet av trinn, noe som forkorter tiden cellene håndteres.
Andre viktige faktorer som øker levedyktigheten til cellene og deres evne til å danne canalicular nettverk i 3D, er bruken av nylagde løsninger og unngåelse av bobler under bruk. Derfor bør løsninger være forberedt på dagen for musen hepatocytter isolasjon, og peristaltisk pumpen og slangen bør sjekkes når du skifter løsninger. Hvis protokollen er tett fulgt, bør isolering av primære hepatocytter være vellykket med en høy avkastning av levedyktige celler.
En annen kritisk faktor i langsiktig 3D hepatocytter kultur er den opprinnelige kilden til primære hepatocytter som brukes. Det er viktig å bruke dyr som er 8-12 uker gamle, som fungerer som optimale givere av hepatocytter. Bruken av hepatocytter fra eldre dyr var ikke så vellykket i langsiktig kultur, da disse hepatocytter endret sin morfologi oftere, depolarisert, og opphørt å danne canalicular nettverk. Også plating hepatocytter på riktig nøytralisert kollagen gel dannet fra relativt svært konsentrert løsning er et viktig skritt. I de fleste protokollene brukes konsentrasjoner på ca. 1 mg/mL. Etter mange optimaliseringer, en konsentrasjon av 1,5 mg/mL er optimal for langsiktig hepatocytter dyrking og gir svært organiserte hepatocytter med dannet galle canaliculi.
Denne lett-å-følge protokollen tillater langsiktig dyrking av primær mus hepatocytter. Representative resultater demonstrere et bredt spekter av bruk for 3D kultivert primær mus hepatocytter når man studerer rollen som cytoskjelettkomponenter komponenter i galle canaliculi formasjon.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grant Agency i den tsjekkiske republikk (18-02699S); Grant Agency i Helsedepartementet av den tsjekkiske republikk (17-31538A); den institusjonelle forskningsprosjekt av den tsjekkiske Academy of Sciences (RVO 68378050) og MEYS CR prosjekter (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1.05/2.1.00/19.0395 og OP RDE CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775); Charles University (Personal stipend to K.K.), og et operativt program Praha-konkurranseevne Project (CZ. 2.16/3.1.00/21547). Vi erkjenner Light mikroskopi Core Facility, IMG CAS, Praha, Tsjekkia (støttet MEYS CR prosjekter LM2015062 og LO1419) for støtte med mikroskopi Imaging presentert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
