Presentert her er en protokoll for isolering av musen hepatocytter fra voksen mus lever ved hjelp av en modifisert kollagenase-teknikk. Likeledes beskrevet er det lang-frist kulturen av hepatocytter inne en 3D kollagen sandwich innfatning likeledes idet immunolabeling av det cytoskjelettkomponenter komponentene å studere galle canalicular formasjon og dens svaret å handling.
Hepatocytter er de sentrale cellene i leveren ansvarlig for sin metabolske funksjon. Som sådan danner de et unikt polarisert epitel, der to eller flere hepatocytter bidrar apikale membraner til å danne en galle canalicular nettverk gjennom hvilken galle utskilles. Hepatocytter polarisering er avgjørende for riktig canalicular formasjon og avhenger av interaksjoner mellom hepatocytter cytoskeleton, celle-celle kontakter, og ekstracellulære matrise. In vitro studier av hepatocytter cytoskeleton involvering i canaliculi formasjon og dens reaksjon på patologiske situasjoner er handikappet ved mangelen på cellekultur, som ville likne nøye den canaliculi nettverksstrukturen in vivo. Beskrevet her er en protokoll for isolering av mus hepatocytter fra voksen mus leveren ved hjelp av en modifisert kollagenase. Også beskrevet er produksjon av kultur i en 3D kollagen sandwich innstilling, som brukes for immunolabeling av cytoskjelettkomponenter komponenter for å studere galle canalicular formasjon og dens reaksjon på behandlinger in vitro. Det er vist at hepatocytter 3D kollagen sandwich kulturer svare på behandlinger med toksiner (etanol) eller utgangen cytoskeleton endre narkotika (f. eks blebbistatin) og tjene som et verdifullt verktøy for in vitro studier av galle canaliculi formasjon og funksjon.
Hepatocytter, den sentrale cellulære strukturer i leveren som er ansvarlig for sine metabolske funksjoner, er unikt polarisert epitelceller. Deres polarisering, som vises i pattedyr kort tid etter fødselen, resulterer i dannelse av galle canalicular nettverk og er avgjørende for riktig galle sekresjon. Apikale membraner av hepatocytter kollektivt form galle canaliculi, mens basal membraner forbli i kontakt med endotelet av sinusoids. Tapet av hepatocytter polarisering fører til omfordeling av galle transportører og resultater i patologiske prosesser forbundet med galle oppbevaring i leveren (dvs. kolestase).
Etablering og vedlikehold av hepatocytter polarisering og utvikling av galle canaliculi innebære komplekse mekanismer. De underliggende prosessene avhenger av kollektivt samspill mellom hepatocytter cytoskeleton, celle celle kontakter og interaksjoner med ekstracellulære matrise1. Den hepatocytter cytoskeleton består av alle tre filament nettverk, den utgangen cytoskeleton, mikrotubuli, og mellomliggende filamenter, som gir strukturell støtte for canalicular dannelse. Differensial rollen av cytoskjelettkomponenter komponenter i regenerering og vedlikehold av galle canalicular nettverk har tidligere blitt illustrert in vitro i 3D kollagen-sandwich hepatocytter kulturer2.
Utgangen microfilaments og mikrotubuli er viktig i de innledende stadier av hepatocytter membran polarisering på steder av canaliculus generasjon2. Den utgangen cytoskeleton etablerer struktur og funksjon av galle canaliculi, forming membran-assosiert microfilaments og circumferential ringen, og dermed støtte canalicular arkitektur og sette inn utgangen cytoskeleton i stramme og adherens kryss3. Ringen av keratin mellomliggende filamenter utenfor utgangen cytoskeleton ytterligere stabiliserer canalicular struktur3.
Betydningen av proteiner i hepatocytter junctional komplekser i organiseringen av galle canaliculi arkitektur har vært godt dokumentert i flere Knock-Out musemodeller, som viser forvrengt canaliculi hos mus mangler både stramt og/eller adherens junctional proteiner4,5,6. Slettingen av det adherens krysset protein α-catenin har vist å føre til disorganization av hepatocytter utgangen cytoskeleton, dilatasjon av galle canalicular lumen, lekk trange veikryss, og effektivt til en kolestatisk fenotype4. Videre har in vitro studier vist viktigheten av adherens Junction komponenter E-cadherin og β-catenin i ombygging av lever apikale lumen og protein smugling7.
Påfallende, ablasjon av det cytoskeleton Cross Linking protein plectin, hvilke er det større keratin organisator, har avsløre fenotyper sammenlignbare å dem sammenkoblet å det utgangen cytoskeleton8. Dette antyder en kritisk rolle av keratin mellomliggende filamenter i støtte av canalicular struktur. In vitro studier utnytte 3D hepatocytter kollagen smørbrød har også vist viktigheten av AMP-aktivert protein kinase og oppstrøms aktivator LKB1 i galle canalicular nettverk formasjon9. Disse funnene ble deretter ytterligere bekreftet av senere in vivo studier10,11. Dermed har det blitt klart at in vitro studier er nødvendig for å fremme forståelsen av signalering prosesser involvert i etableringen av hepatocytter polarisering, riktig canalicular nettverk formasjon, og galle sekresjon.
En stor utfordring i å studere prosesser knyttet til galle canalicular formasjon og dens reaksjon på patologiske situasjoner in vitro bruker en cellekultur forhold som ligner situasjonen i vivo12. Nylig isolerte primære hepatocytter er ikke polarisert; dermed mister de sin funksjon, morfologi, og funksjonell galle canaliculi i 2D kultur forhold (f. eks, endringer i gen regulering, polarisering, og de-differensiering13,14,15). Til tross for dette faktum, fersk isolert hepatocytter nærmest reflekterer natur leveren in vivo, i motsetning til lever-avledet cellelinjer16. Selv om de har vært brukt i det siste, udødeliggjort cellelinjer ikke utøve epitel-lignende karakteristiske morfologi av hepatocytter, og galle canalicular lumen dannet av disse cellene ligne leveren canaliculi dårlig7. I den seneste tid, 3D kulturen av primære hepatocytter, fra begge to mus og rotter, ha bli en nyttig verktøyet å etterforske prosesser involvert inne galle canalicular nettverk formasjon inne vitro9. Primær hepatocytter kultivert mellom to lag av kollagen (referert til som en 3D-kollagen sandwich kultur) kan repolarize i flere dager. På grunn av høye tekniske krav som kreves når dyrking mus hepatocytter i 3D kollagen smørbrød, her presenterer vi en kompleks protokoll for å isolere, å dyrke, og å immunolabel mus hepatocytter innebygd i 3D kollagen smørbrød for å karakterisere involvering av cytoskjelettkomponenter komponenter under galle canalicular formasjon.
Bruk av musen primære hepatocytter kulturer er viktig for in vitro studier for å bedre forstå signalering prosessene som er involvert i etableringen av hepatocytter polarisering, riktig canalicular struktur dannelse, og galle sekresjon. Utfordringene i isolasjon og langsiktig kultur av mus primære hepatocytter i 2D kultur har drevet oppfinnelsen av flere tekniske tilnærminger med økt isolasjon effektiviteten og levetid på isolerte celler, hver med flere fordeler og Ulemper. Det er nå allment akseptert at 2D kulturer av primære hepatocytter etterligne bare begrenset antall attributter av leveren biologi for en kort periode. Således, 3D dyrking i en kollagen sandwich arrangement er mye erstatte 2D forhold, spesielt når fokusert på funksjon av cytoskeleton i leveren biologi (f. eks, giftige narkotika effekter eller romlig organisering av galle transport).
Siden 1980-tallet har det blitt beskrevet flere protokoller for isolering av muse hepatocytter med ulike modifikasjoner. Den to-trinns kollagenase-tilnærmingen har blitt mye brukt i mange laboratorier. Tillegg av gradient sentrifugering inn i isolasjons protokollen tillater fjerning av døde celler19,20 og signifikant øker antall levedyktige celler (her, rutinemessig til ~ 93%). Selv om dette trinnet forlenger håndterings tiden av cellene og resulterer i redusert celle tall21, er dette trinnet sett på som nødvendig i 3D kollagen sandwich kultur for riktig galle canalicular nettverk formasjon. I tillegg er det viktigere å fortsette raskt og nøyaktig i løpet av trinn, noe som forkorter tiden cellene håndteres.
Andre viktige faktorer som øker levedyktigheten til cellene og deres evne til å danne canalicular nettverk i 3D, er bruken av nylagde løsninger og unngåelse av bobler under bruk. Derfor bør løsninger være forberedt på dagen for musen hepatocytter isolasjon, og peristaltisk pumpen og slangen bør sjekkes når du skifter løsninger. Hvis protokollen er tett fulgt, bør isolering av primære hepatocytter være vellykket med en høy avkastning av levedyktige celler.
En annen kritisk faktor i langsiktig 3D hepatocytter kultur er den opprinnelige kilden til primære hepatocytter som brukes. Det er viktig å bruke dyr som er 8-12 uker gamle, som fungerer som optimale givere av hepatocytter. Bruken av hepatocytter fra eldre dyr var ikke så vellykket i langsiktig kultur, da disse hepatocytter endret sin morfologi oftere, depolarisert, og opphørt å danne canalicular nettverk. Også plating hepatocytter på riktig nøytralisert kollagen gel dannet fra relativt svært konsentrert løsning er et viktig skritt. I de fleste protokollene brukes konsentrasjoner på ca. 1 mg/mL. Etter mange optimaliseringer, en konsentrasjon av 1,5 mg/mL er optimal for langsiktig hepatocytter dyrking og gir svært organiserte hepatocytter med dannet galle canaliculi.
Denne lett-å-følge protokollen tillater langsiktig dyrking av primær mus hepatocytter. Representative resultater demonstrere et bredt spekter av bruk for 3D kultivert primær mus hepatocytter når man studerer rollen som cytoskjelettkomponenter komponenter i galle canaliculi formasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grant Agency i den tsjekkiske republikk (18-02699S); Grant Agency i Helsedepartementet av den tsjekkiske republikk (17-31538A); den institusjonelle forskningsprosjekt av den tsjekkiske Academy of Sciences (RVO 68378050) og MEYS CR prosjekter (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1.05/2.1.00/19.0395 og OP RDE CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775); Charles University (Personal stipend to K.K.), og et operativt program Praha-konkurranseevne Project (CZ. 2.16/3.1.00/21547). Vi erkjenner Light mikroskopi Core Facility, IMG CAS, Praha, Tsjekkia (støttet MEYS CR prosjekter LM2015062 og LO1419) for støtte med mikroskopi Imaging presentert.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |