Summary
Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.
Abstract
Los hepatocitos son las células centrales del hígado responsables de su función metabólica. Como tal, forman un epitelio polarizado de forma única, en el que dos o más hepatocitos contribuyen con membranas apicales a formar una red canalicular biliar a través de la cual se secreta la bilis. La polarización de hepatocitos es esencial para la correcta formación canalicular y depende de las interacciones entre el citoesqueleto de hepatocitos, los contactos de células celulares y la matriz extracelular. Los estudios in vitro de la afectación del citoesqueleto de hepatocitos en la formación de canales y su respuesta a situaciones patológicas se ven perjudicados por la falta de cultivo celular, que se asemejaría mucho a la estructura de la red canaliculi in vivo. Aquí se describe un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón del hígado de ratón adulto utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe la producción de cultivo en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, que se utiliza para la inmunoetiquetado de componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular bilis y su respuesta a los tratamientos in vitro. Se ha demostrado que los cultivos de sándwiches de colágeno 3D de hepatocitos responden a tratamientos con toxinas (etanol) o fármacos que alteran el citoesqueleto de actina (por ejemplo, blebbistatin) y sirven como una herramienta valiosa para estudios in vitro de la formación y función de los canalulis biliares.
Introduction
Los hepatocitos, las estructuras celulares centrales del hígado que son responsables de sus funciones metabólicas, son células epiteliales polarizadas de forma única. Su polarización, que aparece en los mamíferos poco después del nacimiento, resulta en la formación de la red canalicular biliar y es esencial para la secreción biliar adecuada. Las membranas apicales de los hepatocitos forman colectivamente los canales biliares, mientras que las membranas basales permanecen en contacto con el endotelio de los sinusoides. La pérdida de polarización de hepatocitos conduce a la redistribución de los transportadores de bilis y resulta en procesos patológicos relacionados con la retención de bilis en el hígado (es decir, colestasis).
El establecimiento y mantenimiento de la polarización de hepatocitos y el desarrollo de canales biliares implican mecanismos complejos. Los procesos subyacentes dependen de la interacción colectiva entre el citoesqueleto de hepatocitos, los contactos de células celulares y las interacciones con la matriz extracelular1. El citoesqueleto de hepatocitos consta de las tres redes de filamentos, el citoesqueleto de actina, microtúbulos y filamentos intermedios, que proporcionan soporte estructural para la formación canalicular. El papel diferencial de los componentes citoesqueléticos en la regeneración y el mantenimiento de las redes canaliculares biliares se ha ilustrado previamente in vitro en los cultivos de hepatocitos de colágeno-sandwich3D 2.
Los microfilamentos y microtúbulos de Actin son importantes durante las etapas iniciales de la polarización de la membrana de hepatocitos en los sitios de canaliculus generación2. El citoesqueleto actino establece la estructura y función de los canales biliares, formando microfilamentos asociados a la membrana y el anillo circunferencial, apoyando así la arquitectura canalicular e insertando el citoesqueleto de actina en las uniones apretadas y adheridas3. El anillo de filamentos intermedios de queratina fuera del citoesqueleto de actina estabiliza aún más la estructura canalicular3.
La importancia de las proteínas en los complejos de unión de hepatocitos en la organización de la arquitectura de los canales biliares ha sido bien documentada en varios modelos de ratón noqueados, que muestran canales distorsionados en ratones que carecen de proteínas de unión herméticasy/oadheridas 4,5,6. Se ha demostrado que la deleción de la proteína de unión adheridas -catenina conduce a la desorganización del citoesqueleto de actina de hepatocitos, dilatación de lúmenes canaliculares biliares, uniones apretadas con fugas y, de manera efectiva, a un fenotipo colestásico4. Por otra parte, los estudios in vitro han demostrado la importancia de los componentes de unión adheridos E-cadherin a -catenina en la remodelación del flujo apical hepatocelular y el tráfico de proteínas7.
Sorprendentemente, la ablación del citoesqueleto de proteína reticulante plectina, que es el principal organizador de la queratina, ha revelado fenotipos comparables a los vinculados al citoesqueleto de actina8. Esto sugiere un papel crítico de los filamentos intermedios de queratina en el soporte de la estructura canalicular. Los estudios in vitro que utilizan sándwiches de colágeno de hepatocitos 3D también han demostrado la importancia de la proteína quinasa activada por AMP y su activador ascendente LKB1 en la formación de la red bililículo9. Estos hallazgos fueron confirmados posteriormente por estudios in vivo posteriores10,11. Por lo tanto, ha quedado claro que los estudios in vitro son necesarios para promover la comprensión de los procesos de señalización involucrados en el establecimiento de la polarización de hepatocitos, la formación adecuada de la red canalicular y la secreción de bilis.
Un desafío importante en el estudio de los procesos relacionados con la formación canalicular biliar y su respuesta a situaciones patológicas in vitro es el uso de condiciones de cultivo celular que se asemejan mucho a la situación in vivo12. Los hepatocitos primarios recién aislados no están polarizados; por lo tanto, pierden su función, morfología y canallíticobiliarbilis biliares funcionales en condiciones de cultivo 2D (por ejemplo, cambios en la regulación genética, polarización y desdiferenciación13,14,15). A pesar de este hecho, los hepatocitos recién aislados reflejan más de cerca la naturaleza del hígado invivo, a diferencia de las líneas celulares derivadas del hígado16. A pesar de que se han utilizado en el pasado, las líneas celulares inmortalizadas no ejercen la morfología característica epitelial de los hepatocitos, y los lúmenes canaliculares biliares formados por estas células se asemejan mal al hígado canalcíuli7. Recientemente, los cultivos 3D de hepatocitos primarios, tanto de ratones como de ratas, se han convertido en una herramienta útil para investigar los procesos implicados en la formación de redes canaliculares biliares in vitro9. Los hepatocitos primarios cultivados entre dos capas de colágeno (denominado cultivo de sándwich de colágeno 3D) pueden repolarizarse en varios días. Debido a las altas exigencias técnicas requeridas al cultivar hepatocitos de ratón en sándwiches de colágeno 3D, aquí presentamos un protocolo complejo para aislar, cultivar e inmunoetiquetar hepatocitos de ratón incrustados en sándwiches de colágeno 3D con el fin de caracterizar la implicación de los componentes citoesqueléticos durante la formación canalicular biliar.
Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Directiva Europea 2010/63/UE y fueron aprobados por la Comisión Central Checa de Bienestar Animal.
1. Materiales
- Animales de la casa en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencias Animales de Laboratorio con acceso gratuito a la comida regular y el agua potable. Animales de la casa bajo un ciclo oscuro/claro de 12 h/12 h. Para el aislamiento y el cultivo de hepatocitos, utilice animales de 8 a 12 semanas de edad.
- Soluciones de stock A y B
- Preparar la solución de stock A y la solución de stock B de acuerdo con la Tabla 1 y la Tabla 2,respectivamente, con antelación. Disolver todos los componentes en 1 L de H2O destilado (dH2O).
- Ajuste el pH de las soluciones a 7,2 y filtre las soluciones a través de un filtro de 0,2 m. Ambas soluciones se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 6 meses.
- Solución de stock C
- Prepare la solución C el día del aislamiento primario de los hepatocitos.
- Agregue todos los componentes según la Tabla 3, rellene a un volumen total de 50 ml con dH2O y disuelva. Ajuste el pH a 7.3.
- Aliquot 50 mL de la solución en tubos de 50 ml. Use un tubo por animal. Coloque todas las alícuotas necesarias en un baño de agua precalentado (37 oC).
- Solución de stock D
- Prepare la solución D el día del aislamiento primario de los hepatocitos.
- Agregue todos los componentes de acuerdo con la Tabla 4,rellene a un volumen total de 30 ml con dH2O y disuelva. Ajuste el pH a 7.3.
- Aliquot 30 mL de la solución en tubos de 50 ml. Añadir la colagenasa I (5 mg/30 ml) en la solución D. Use una alícuota por animal. Colocar todas las alícuotas en un baño de agua precalentado (37 oC).
- Solución de stock E
- Prepare la solución E el día del aislamiento primario de los hepatocitos.
- Agregue todos los componentes de acuerdo con la Tabla 5, rellene a un volumen total de 50 ml con dH2O y disuelva. Ajuste el pH a 7.3.
- Aliquot 50 mL de la solución en tubos de 50 ml. Añadir albúmina V (0,65 g/50 ml) en la solución E. Utilice una alícuota por animal. Colocar todas las alícuotas en un baño de agua precalentado (37 oC).
2. Preparación de sándwiches de colágeno
- Un día antes del aislamiento de hepatocitos primarios, prepare la primera capa del sándwich de colágeno I.
NOTA: Trabaje sobre hielo y utilice soluciones preenfriadas, puntas, placas y tubos para minimizar la gelación no deseada de colágeno I. - Neutralizar la cantidad requerida de colágeno I (de la cola de rata) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se requiere un volumen de 100 ml de colágeno neutralizado (1,5 mg/ml) por muestra experimental (plato de 3,5 cm). Para preparar 1 ml de colágeno neutralizado (1,5 mg/ml), añadir 100 ml de 10x DMEM, 1,5 ml de NaOH de 1M y 48,5 ml de dH2O en 500 ml de colágeno (concentración de stock de 3 mg/ml). Compruebe el pH del colágeno neutralizado con papel de litmus (el pH debe ser de 7,5).
- Disperse 100 ml de solución de colágeno neutralizado uniformemente utilizando una punta preenfriada de 200 l sobre la superficie de un plato de 3,5 cm sobre hielo.
- Incubar durante la noche en condiciones de cultivo estándar (incubadora con 5% deCO2 a 37oC). El día del aislamiento primario de hepatocitos, agregue 1 ml de PBS precalentado (37 oC) a la primera capa de colágeno. Dejar que el colágeno se rehidrate durante 2-3 h a 37oC.
3. Equipamiento configurado
- Prepare todo el equipo como se indica en la Tabla de materiales y configure como se muestra en la Figura 1.
4. Procedimiento quirúrgico
- Anestesiar el ratón mediante inyección intramuscular de tetimina (60 mg/kg de peso corporal), zolazepam (60 mg/kg) y xilazina (4,5 mg/kg). Después de varios minutos, confirme la anestesia adecuada por el pellizco del dedo del pie. Si el animal no responde al pellizco, proceda a 4.2.
- Coloque el ratón anestesiado en una estera de disección y pegue las extremidades inferior y superior para fijar el ratón en una posición supina. Swab el abdomen con 70% de etanol y abrir el abdomen con una incisión en forma de V desde el área púbica hasta las piernas delanteras. Dobla la piel sobre el pecho para descubrir la cavidad abdominal. Coloque la alfombra de disección bajo un microscopio de disección.
- Doble una aguja de jeringa de insulina (30 G) en un ángulo de 45o. Exponer la vena cava inferior (IVC) moviendo los intestinos y el colon en la dirección caudal.
- Llene 2,5 ml de solución precalentada (37 oC) en una jeringa de 2 ml con una cánula. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la cánula o jeringa.
- Antes de la cannulación del CIV, vuelva a colocar los lóbulos hepáticos presionando hasta el diafragma con un hisopo de algodón húmedo (PBS). Coloque una sutura de seda alrededor de la CIV justo debajo del hígado(Figura 2A,B).
- Inyectar 10 l de heparina (5000 U/ml) en la vena porta utilizando una jeringa de insulina con una aguja de 30 G doblada en un ángulo de 45o(Figura 2C).
- Para canalizar el hígado, hacer una pequeña incisión con tijeras microquirúrgicas al CIV directamente al lado del hígado (debajo de la sutura; Figura 2D) que es lo suficientemente grande como para insertar la cánula. Fije la cánula en la posición utilizando suturas y dos nudos quirúrgicos(Figura 2E).
- Cortar la vena portal(Figura 2F) para permitir que los tampones de perfusión fluyan desde el hígado para evitar la expansión del hígado.
- Permanuale manualmente el hígado con 1,5 ml de solución precalentada C presionando lentamente la jeringa conectada a la cánula (esto debe tomar 15 s). La eliminación de sangre del hígado por decoloración del hígado ahora se puede observar.
- Prellene una bomba peristáltica con solución precalentada (37 oC) C. Compruebe el aparato de perfusión y asegúrese de que no haya burbujas de aire en el sistema.
- Desconecte con precaución la cánula de la jeringa y conéctela al tubo de la bomba peristáltica que funciona a un caudal de 2,5 ml/min. Trabaje con rapidez pero con cuidado y asegúrese de que la cánula permanezca en posición y de que no entre burbujas en el tubo o la cánula.
- Perfumar el hígado con la solución C durante 2 min (5 ml de la solución C). Cambie a la solución D y continúe la perfusión durante 10 min (25 ml de solución D).
- Una vez que el hígado ha sido perfundido, retírelo de la cavidad abdominal. El hígado ahora será muy frágil y de color pálido(Figura 3).
5. Aislamiento de hepatocitos primarios
- Retire el hígado del ratón. La cánula todavía estará atada al hígado, así que usa los fórceps para levantar la cánula con el hígado, y cuidadosamente cortar todas las conexiones de fascia. Transfiera el hígado a un tubo de 50 ml que contenga 20 ml de solución Precalentada E.
- Sostenga la cánula con el hígado usando fórceps y desasocie el tejido frotando el hígado alrededor de la pared del tubo para transferir los hepatocitos aislados al tampón. Mantenga las células aisladas en hielo.
NOTA: Los hepatocitos primarios aislados son viables durante varias horas mientras se mantienen en hielo. Los usuarios pueden repetir los pasos 4.1 a 5.2 aisleando los hepatocitos primarios de otro ratón donante, si es necesario, o continuar con el siguiente paso. - Coloque un colador de células de nylon de 70 m encima de un tubo de 50 ml y filtre las células aisladas.
- Centrifugar el tubo a 50 x g y 4 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Para eliminar las células muertas y aumentar el porcentaje de células viables, resuspenda el pellet en 20 ml de 40% percol en DMEM.
- Centrifugar el tubo a 50 x g y 4 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante que contiene células muertas y resuspender el pellet en 20 ml de la solución E.
- Tubos centrífugos a 50 x g y 4 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de la solución E.
- Compruebe el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos primarios utilizando la tinción azul de tripa. Cuente el número de celda usando una cámara de conteo de células Neubauer y ajuste la concentración celular a 3.75 x 105 células viables/ml. Mantenga las células en hielo.
6. Cultivo de hepatocitos primarios en sándwiches de colágeno 3D
- Preparar el medio de cultivo de hepatocitos (HCM). Añadir 15 ml de glucagón (1 mg/ml), 15 ml de hidrocortisona (50 mg/ml) y 40 ml de insulina (10 mg/ml) a 50 ml de medio completo (DMEM, glucosa alta, 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina).
- Dispersar uniformemente 2 ml (5 x 105 células/ml) de hepatocitos primarios viables en un plato pre-recubierto de 3,5 cm. Incubar las células con 5% de CO2 a 37oC durante 3 h. Importante: Distribuir uniformemente las células inclinando el plato en todas las direcciones justo antes de poner el plato en la incubadora.
- Preparar colágeno neutralizado I (plato de 100 l/3,5 cm; es decir, un volumen suficiente para todos los platos como se describió anteriormente [paso 2.1]). Manténgase en hielo hasta su uso.
- Después de 3 h, retire cuidadosamente las células medianas y no unidas y agregue 100 ml de colágeno neutralizado I a cada plato de 3,5 cm para formar la capa superior de sándwich de colágeno en las células. Incubar el sándwich de colágeno en condiciones de cultivo celular estándar (5% CO2 a 37 oC) durante 1 h. Después de una incubación de 1 h, agregue cuidadosamente 2 mL de HCM.
- Después de 24 h de cultura, cambie el medio HCM por uno nuevo.
- Cultivo durante 3-8 días, dependiendo de la formación de canales biliares. Compruebe el cultivo todos los días bajo un microscopio (Figura 4). Cambie el HCM cada segundo día.
7. Inmunoetiquetado de hepatocitos primarios en sándwiches de colágeno 3D
- Retire los medios de los sándwiches de hepatocitos y, a continuación, lávelos cuidadosamente con PBS precalentado. Fijar los cultivos sándwich con 1 mL de 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Después de la fijación, lavar los sándwiches 3x durante 10 min en 2 mL de PBS + 0.1% Tween 20 (PBS-T).
- Permeabilizar células con 1 ml de glicina de 0,1 M, 0,2% de Tritón X-100 en PBS a RT durante 1 h. Lavar 3 x durante 10 min en PBS-T.
- Perturbe suavemente la capa superior de colágeno usando una punta de carga de 10 s conectada a una aspiración de vacío para asegurar una penetración suficiente de anticuerpos.
- Bloquear con 1 ml de 5% de BSA en PBS-T (es decir, solución de bloqueo) durante 2 h. Incubar con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 37 oC. Lavar 3 veces durante 15 min en PBS-T.
- Después del lavado, incubar con anticuerpo secundario a 37oC durante 5 h. Lavar 3 veces durante 15 min en PBS-T seguido de 1 lavado con H2O destilado.
- Montaje con medios de montaje anti-fade (ver Tabla de Materiales)para microscopía.
Representative Results
Los hepatocitos primarios del ratón fueron aislados y sembrados en sándwiches de colágeno 3D. Los canales biliares entre dos células adyacentes comenzaron a formarse dentro de varias horas después de la sembración. Las células formaron racimos y se autoorganizaron en una red regular aproximada de canales biliares dentro de 1 día(Figura 4). Dentro de 3-6 días, por lo general se observaron racimos de 5-10 células, con hepatocitos completamente polarizados formando una red canalicular(Figura 4).
Tratamiento de hepatocitos primarios de ratón en sándwiches de colágeno 3D con toxina (etanol) o fármacos que alteran el citoesqueleto (por ejemplo, blebbistatin, ácido okadaico) dio lugar a cambios en el citoesqueleto de hepatocitos, ancho de canaliculi, forma y número de canaliculi biliares ilustrados por inmunoetiquetado con un anticuerpo a la queratina 8 (la queratina más abundante en hepatocitos), faloidina (visualización de F-actina), y anticuerpos a proteína de unión apretada zonu zonu ocludens-1 (ZO-1; Figura 5).
El tratamiento del etanol sólo tuvo un efecto leve en la organización de la queratina 8; sin embargo, aumentó la tortuosidad (como se ve a partir de la tinción de F-actina) y la distribución de los anchos canaliculares biliares(Figura 5). La intensidad de la señal de la tinción ZO-1 disminuyó en los canales biliares tratados con etanol en comparación con los controles no tratados, lo que sugiere una pérdida de uniones estrechas después del tratamiento con etanol. La inhibición de la contractilidad de actomiosina con blebbistatin afectó significativamente la forma y el número de canales biliares. La red canalicular regular se reorganizó, en comparación con los hepatocitos no tratados, en canales biliares de forma desordenada con una mayor incidencia de canales biliares redondeados gruesos en lugar de largos delgados (como se ve en el histograma de anchos canaliculares).
Además, el tratamiento con ácido okadaico (OA) que inhibe las fosfatasas afectó fuertemente las propiedades físicas de las queratinas, como se ha demostrado anteriormente8,17. OA cambia la solubilidad de los filamentos de queratina; por lo tanto, el tratamiento dio lugar a una profunda reorganización de la malla de queratina, que se derrumbó en grandes agregados perinucleares. Tanto la F-actina como la proteína de unión estrecha ZO-1 no fueron localizadas en ninguna estructura en particular, lo que sugiere la desaparición casi completa de los canales biliares organizados y una pérdida completa de polaridad de hepatocitos. Los canales biliares restantes se redujeron significativamente en comparación con los controles no tratados, como se ve en el histograma de ancho canalicular(Figura 5).
Para correlacionar las observaciones microscópicas de los cambios en el citoesqueleto de hepatocitos con la respuesta bioquímica hepatocelular al tratamiento, el protocolo también midió los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) (dos enzimas hepáticas que se utilizan comúnmente como marcadores de lesión hepatocelular) en sobrenadante de los sándwiches de colágeno 3D(Figura 6)18. El tratamiento con etanol elevó significativamente los niveles de ALT y AST, lo que sugiere una lesión hepatocelular grave. El tratamiento con Blebbistatin no dio lugar a cambios considerables en los niveles de ALT y AST en comparación con el tratamiento con ácido okadaico, que desencadenó cambios bioquímicos leves con aumentos de los niveles de ALT, pero no cambios en los niveles de AST. Por lo tanto, los marcadores bioquímicos de lesión hepatocelular medidos in vitro a partir de sobrenadant espatocitos se correlacionan con los cambios citoesqueléticos observados por inmunostainismo.
Figura 1: Configuración experimental. (A) El ratón fijado en posición supina, se coloca bajo un microscopio de disección antes de la cirugía. Todos los instrumentos quirúrgicos requeridos se colocan en una bandeja. ( B ) La suitedeperfusión durante la perfusión hepática del ratón que muestra tubos de silicona que conectan el depósito con el búfer caliente y el ratón perfundido. (C) Representación esquemática de B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Apertura de la cavidad abdominal y cannulación de la CIV. El abdomen se abre con una incisión en forma de V desde el área púbica hasta las patas delanteras. La piel se dobla sobre el pecho para exponer y agrandar la cavidad abdominal. Para exponer el CIV, los intestinos y el colon se mueven cuidadosamente durante la dosis. (A, B) Antes de la cannulación de la CIV, los lóbulos hepáticos deben reposicionarse presionando hacia arriba hasta el diafragma con un hisopo de algodón humedecido por PBS. El CIV se separa cuidadosamente de los tejidos circundantes, y se coloca una sutura de seda alrededor del CIV cerca del hígado. El panel B representa los esquemas de la cavidad abdominal que se muestran en el panel A. Se indican los lóbulos hepáticos, el intestino, la vena cava inferior (IVC, rojo) y las suturas. (C) La heparina se inyecta en la vena porta (PV, flecha) con una jeringa de insulina (30 G de aguja doblada en ángulo de 45o). (D) Para canalizar el hígado, el CIV se incisa directamente junto al hígado (debajo de la sutura). (E) La cánula se inserta y se fija con suturas atando dos nudos quirúrgicos. (F) La vena del portal está completamente cortada para permitir la salida libre del búfer, evitando la expansión del hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes hepáticas representativas antes y después de la perfusión. (A, B) El hígado canulado fue resecado y perfundido durante 12 minutos a un caudal de 2,5 ml/min. Tenga en cuenta el hígado significativamente decolorado después de la perfusión (B) en comparación con el hígado recién resecado (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón. Imágenes representativas de campo brillante de hepatocitos primarios de ratón cultivados durante 1, 2 y 3 días en condiciones 3D. Cabe señalar que los grupos más grandes de células altamente organizadas se forman después de 3 días en el cultivo. Las áreas en caja muestran imágenes magnificadas de 3x. Las puntas de flecha indican los canales biliares. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de la respuesta morfológica al estrés tóxico mediante microscopía inmunofluorescente. Los hepatocitos primarios de ratón cultivados en sándwiches de colágeno 3D fueron tratados con toxinas (etanol, blebbistatin o ácido okadaico) en el día 3 del cultivo. Las células fijas se tiñieron para visualizar los componentes citoesqueléticos: queratina 8 (verde), F-actina (rojo) y zonula occludens-1 (ZO-1, magenta) por inmunofluorescencia. El tratamiento tóxico condujo a la desorganización de los componentes citoesqueléticos visualizados, y redujo el número y aumentó la tortuosidad de los canales biliares. Los anchos canaliculares se midieron tanto en hepatocitos no tratados como tratados y se representan como histogramas de distribución de anchos. Las puntas de flecha indican los canales biliares. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis bioquímico de la respuesta de los sándwiches de colágeno de hepatocitos 3D a lesiones tóxicas in vitro. ALT y AST, marcadores bien establecidos de lesión hepatocelular, se midieron en sobrenadante a partir de sándwiches de colágeno de hepatocitos 3D tratados con toxinas (etanol, blebbistatin y ácido okadaico). LA ALT y la AST se elevaron en las células tratadas en comparación con las no tratadas. Los datos se notifican como medios aritméticos - SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución de stock A (10x) | |
| Reactivo | Concentración final (g/litro) |
| Nacl | 80 |
| Kcl | 4 |
| MgSO4x 7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4x 2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
Tabla 1: Solución de stock Una receta.
| Solución de stock B (10x) | |
| Reactivo | Concentración final (g/litro) |
| Nacl | 69 |
| Kcl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4x 7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
Tabla 2: Receta de la solución B de stock.
| Solución C | |
| Reactivo | |
| Solución de stock A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0.1094 g |
| Egta | 0.0095 g |
| dH2O | a 50 mL |
Tabla 3: Receta C de la solución de stock.
| Solución D | |
| Reactivo | |
| Solución de stock A (10x) | 3 ml |
| NaHCO3 | 0.065 g |
| CaCl2 | 0.0125 g |
| dH2O | a 30 ml |
Tabla 4: Receta D de la solución de stock.
| Solución E | |
| Reactivo | |
| Solución de stock B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glucosa | 0.045 g |
| dH2O | a 50 mL |
Tabla 5: Receta E de la solución de stock.
Discussion
El uso de cultivos de hepatocitos primarios de ratón es importante para que los estudios in vitro comprendan mejor los procesos de señalización involucrados en el establecimiento de la polarización de hepatocitos, la formación adecuada de la estructura canalicular y la secreción de bilis. Los desafíos en el aislamiento y el cultivo a largo plazo de los hepatocitos primarios de ratón en el cultivo 2D han impulsado la invención de varios enfoques técnicos con mayor efectividad de aislamiento y longevidad de células aisladas, cada una con varias ventajas y Desventajas. Ahora es ampliamente aceptado que los cultivos 2D de hepatocitos primarios imitan sólo un número limitado de atributos de la biología hepática durante un corto período de tiempo. Por lo tanto, el cultivo 3D en una disposición de sándwich de colágeno está reemplazando ampliamente las condiciones 2D, particularmente cuando se centra en la función del citoesqueleto en la biología hepática (por ejemplo, efectos tóxicos de drogas u organización espacial del transporte biliar).
Desde la década de 1980, se han descrito varios protocolos para el aislamiento de hepatocitos de ratón con varias modificaciones. El enfoque de perfusión de colagenasa en dos pasos se ha vuelto ampliamente utilizado en muchos laboratorios. La adición de centrifugación de gradiente en el protocolo de aislamiento permite la eliminación de las células muertas19,20 y aumenta significativamente el número de células viables (aquí, rutinariamente a 93%). A pesar de que este paso extiende el tiempo de manejo de las células y resulta en números de celda reducidos21,este paso se considera necesario en el cultivo de sándwich de colágeno 3D para la formación adecuada de la red canalicular bilis. Además, es más importante proceder de forma rápida y precisa durante los pasos de perfusión, lo que acorta el tiempo que se manejan las celdas.
Otros factores importantes que aumentan la viabilidad de las células y su capacidad para formar redes canaliculares en 3D es el uso de soluciones recién preparadas y la evitación de burbujas durante la perfusión. Por lo tanto, las soluciones deben prepararse el día del aislamiento de hepatocitos de ratón, y la bomba peristáltica y el tubo deben comprobarse al cambiar las soluciones. Si el protocolo se sigue de cerca, el aislamiento de los hepatocitos primarios debe tener éxito con un alto rendimiento de células viables.
Otro factor crítico en el cultivo de hepatocitos 3D a largo plazo es la fuente inicial de hepatocitos primarios que se utilizan. Es importante utilizar animales de 8 a 12 semanas de edad, que sirven como donantes óptimos de hepatocitos. El uso de hepatocitos de animales mayores no fue tan exitoso en el cultivo a largo plazo, ya que estos hepatocitos cambiaron su morfología más a menudo, se despolarizaron y dejaron de formar redes canaliculares. Además, los hepatocitos de chapado en gel de colágeno debidamente neutralizado formado a partir de una solución relativamente altamente concentrada es un paso vital. En la mayoría de los protocolos, se utilizan concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml. Después de muchas optimizaciones, una concentración de 1,5 mg/ml es óptima para el cultivo de hepatocitos a largo plazo y proporciona hepatocitos altamente organizados con canaluli biliar formado.
Este protocolo fácil de seguir permite el cultivo a largo plazo de hepatocitos primarios de ratón. Los resultados representativos demuestran un amplio espectro de uso para hepatocitos de ratón primarios cultivados en 3D al estudiar el papel de los componentes citoesqueléticos en la formación de canales biliares.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la República Checa (18-02699S); la Agencia de Subvenciones del Ministerio de Salud de la República Checa (17-31538A); el Proyecto de Investigación Institucional de la Academia Checa de Ciencias (RVO 68378050) y los proyectos MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 y OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Universidad Charles (estipendio personal a K.K.), y un proyecto de Programa Operativo Praga-Competitividad (CZ.2.16/3.1.00/21547). Reconocemos el Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (apoyadome MEYS CR proyectos LM2015062 y LO1419) para el apoyo con las imágenes de microscopía presentadas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
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