Summary
Præsenteret her er en protokol til isolering af mus hepatocytter fra voksne mus lever ved hjælp af en modificeret kollagenase perfusion teknik. Også beskrevet er den langsigtede kultur af hepatocytter i en 3D kollagen sandwich indstilling samt immunolabeling af cytoskelet komponenter til at studere galde canaliculært dannelse og dens respons på behandling.
Abstract
Hepatocytter er de centrale celler i leveren er ansvarlige for sin metaboliske funktion. Som sådan danner de et unikt polariseret epitel, hvor to eller flere hepatocytter bidrager med apikale membraner til dannelse af et galde canaliculært netværk, hvorigennem galde udskilles. Hepatocyt polarisering er afgørende for korrekt canaliculært dannelse og afhænger af interaktioner mellem hepatocyt cytoskelet, celle-celle kontakter, og den ekstracellulære matrix. In vitro undersøgelser af hepatocyt cytoskelet involvering i eller dannelse og dens reaktion på patologiske situationer er handicappet af manglen på cellekultur, som vil nøje ligne eller netværk struktur in vivo. Beskrevet her er en protokol til isolering af mus hepatocytter fra voksne mus leveren ved hjælp af en modificeret kollagenase perfusion teknik. Også beskrevet er produktion af kultur i en 3D kollagen sandwich indstilling, som anvendes til immunolabeling af cytoskelet komponenter til at studere galde canaliculært dannelse og dens respons på behandlinger in vitro. Det er vist, at hepatocyt 3D kollagen sandwich kulturer reagerer på behandlinger med toksiner (ethanol) eller actin cytoskelet ændre narkotika (f. eks, blebbistatin) og tjene som et værdifuldt værktøj til in vitro-undersøgelser af galde eller dannelse og funktion.
Introduction
Hepatocytter, de centrale cellulære strukturer i leveren, der er ansvarlige for dens metaboliske funktioner, er unikt polariserede epiteliale celler. Deres polarisering, der optræder i pattedyr kort efter fødslen, resulterer i dannelse af det Biliære canaliculære netværk og er afgørende for korrekt galde sekretion. Apical membraner af hepatocytter kollektivt danner galde canaliculi, mens basal membraner forbliver i kontakt med endotelet af sinusoids. Tabet af hepatocyt polarisering fører til omfordeling af galde transportører og resulterer i patologiske processer forbundet med galde retention i leveren (dvs. kolestase).
Etablering og vedligeholdelse af hepatocyt polarisering og udvikling af galde eller indebærer komplekse mekanismer. De underliggende processer afhænger af det kollektive samspil mellem cyskelettet hepatocyt, celle celle kontakter og interaktioner med den ekstracellulære matrix1. Den hepatocyt cytoskelet består af alle tre filament netværk, actin cytoskelet, microtubuler, og mellemliggende filamenter, som giver strukturel støtte til canaliculært dannelse. Den differentiale rolle af cytoskelet komponenter i regenerering og vedligeholdelse af galde canaliculært netværk er tidligere blevet illustreret in vitro i 3D kollagen-sandwich hepatocyt kulturer2.
Actin mikrofilamenter og microtubuler er vigtige i de indledende stadier af hepatocyt membran polarisering på stederne for canaliculus generation2. Actin cytoskelet etablerer strukturen og funktionen af galde canaliculi, danner membran-associerede mikrofilamenter og den circumferentielle ring, således støtte den canaliculære arkitektur og indsættelse af actin cytoskelet i stramme og klæber kryds3. Ringen af keratin mellemliggende filamenter uden for actin cytoskelettet stabiliserer yderligere den canaliculære struktur3.
Betydningen af proteiner i hepatocyt supplerende komplekser i organiseringen af galde eller arkitektur er blevet veldokumenteret i flere knock-out musemodeller, som viser forvrænget eller i mus mangler både stramme og/eller klæber supplerende proteiner4,5,6. Det har vist sig, at udeladelsen af klæber Junction protein α-køreledningen fører til disorganisering af hepatocyt actin cytoskelet, dilatation af galde canaliculære lumen, utætte stramme vejkryds og effektivt til en kolestatisk fænotype4. Desuden har in vitro-undersøgelser vist betydningen af klæber Junction komponenter E-cadherin og β-køreledning i remodeling af hepatocellulære apikale lumen og protein handel7.
Påfaldende, ablation af cytoskelet binding protein plectin, som er den største Keratin organisator, har afsløret fænotyper sammenlignelige med dem, der er forbundet med actin cytoskelet8. Dette antyder en afgørende rolle for Keratin mellemliggende filamenter i støtte af canaliculært struktur. In vitro undersøgelser udnytter 3D hepatocyt kollagen sandwich har også vist betydningen af den amp-aktiverede protein kinase og dens upstream aktivator LKB1 i galde canaliculært netværk dannelse9. Disse fund blev derefter yderligere bekræftet af de efterfølgende in vivo-undersøgelser10,11. Således, det er blevet klart, at in vitro-undersøgelser er nødvendige for at fremme forståelsen af signalering processer involveret i etableringen af hepatocyt polarisering, korrekt canaliculært netværk dannelse, og galde sekretion.
En stor udfordring i at studere processer i forbindelse med galde canaliculær dannelse og dens reaktion på patologiske situationer in vitro er ved hjælp af en cellekultur betingelser, der nøje ligner situationen i vivo12. Frisk isolerede primære hepatocytter er ikke polariseret; således mister de deres funktion, morfologi, og funktionelle galde eller i 2D kulturforhold (f. eks ændringer i genregulering, polarisering, og de-differentiering13,14,15). På trods af dette faktum, frisk isolerede hepatocytter mest nøje afspejler karakteren af leveren in vivo, i modsætning til lever-afledte cellelinjer16. Selv om de har været brugt i fortiden, udødeliggjort cellelinjer ikke udøver epitelial-lignende karakteristisk morfologi af hepatocytter, og galde canaliculært lumen dannet af disse celler ligne leveren eller dårligt7. For nylig, 3D-kulturer af primære hepatocytter, fra både mus og rotter, er blevet et nyttigt redskab til at undersøge processer involveret i galde canaliculært netværk dannelse in vitro9. Primære hepatocytter, der dyrkes mellem to lag af kollagen (omtalt som en 3D kollagen sandwich kultur) kan repolarisere i flere dage. På grund af høje tekniske krav, der kræves, når dyrkning mus hepatocytter i 3D kollagen sandwich, her præsenterer vi en kompleks protokol for at isolere, dyrke, og at immunolabel mus hepatocytter indlejret i 3D kollagen sandwich for at karakterisere inddragelsen af cytoskelet komponenter under galde canaliculært dannelse.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63/EU, og de blev godkendt af den tjekkiske central Kommission for dyrevelfærd.
1. materialer
- Husdyr under specifikt patogenfrie forhold i henhold til retningslinjerne fra føderationen for laboratorium dyrevidenskab foreninger med fri adgang til regelmæssig Chow og drikkevand. Husdyr under en 12 h/12 h mørk/lys cyklus. For hepatocyt isolation og kultur, brug 8 – 12 uger gamle dyr.
- Stock Solutions A og B
- Forbered stamopløsning A og stamopløsning B i henhold til henholdsvis tabel 1 og tabel 2på forhånd. Alle komponenter opløses i 1 L destilleret H2o (DH2o).
- Juster pH-værdien af opløsninger til 7,2, og Filtrer løsningerne gennem et 0,2 μm-filter. Begge opløsninger kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder.
- Stamopløsning C
- Forbered opløsning C på dagen for primær hepatocyt isolation.
- Tilføj alle komponenter i henhold til tabel 3, fyld til en 50 ml total volumen med DH2O, og opløses. Juster pH-værdien til 7,3.
- Alikvot 50 mL af opløsningen i 50 mL rør. Brug et rør pr. dyr. Placer alle påkrævede aliquoter i et foropvarmet vandbad (37 °C).
- Stamopløsning D
- Forbered løsning D på dagen for primær hepatocyt isolation.
- Tilføj alle komponenter i henhold til tabel 4, fyld til en 30 ml total volumen med DH2O, og opløses. Juster pH-værdien til 7,3.
- Aliquot 30 mL af opløsningen i 50 mL rør. Tilsæt kollagenase i (5 mg/30 ml) til opløsning D. Brug én alikvot pr. dyr. Alle aliquoter placeres i et foropvarmet vandbad (37 °C).
- Stamopløsning E
- Forbered opløsning E på dagen for primær hepatocyt isolation.
- Tilføj alle komponenter i henhold til tabel 5, fyld til en 50 ml total volumen med DH2O, og opløses. Juster pH-værdien til 7,3.
- Alikvot 50 mL af opløsningen i 50 mL rør. Tilsæt albumin V (0,65 g/50 mL) til opløsning E. Brug én alikvot pr. dyr. Alle aliquoter placeres i et foropvarmet vandbad (37 °C).
2. forberedelse af kollagen sandwich
- En dag før primær hepatocyt isolation, forberede det første lag af kollagen i sandwich.
Bemærk: Arbejd på is, og brug præ-afkølede opløsninger, spidser, plader og rør for at minimere uønsket gelering af kollagen i. - Neutralisere den nødvendige mængde kollagen I (fra Rottehale) i henhold til producentens protokol. Der kræves et rumfang på 100 μL neutraliseret kollagen (1,5 mg/mL) pr. eksperimentel prøve (3,5 cm skål). Til klargøring af 1 mL neutraliseret kollagen (1,5 mg/mL) tilsættes 100 μL 10x DMEM, 1,5 μL af 1M NaOH og 48,5 μL dH2O til 500 μl kollagen (lager koncentration = 3 mg/ml). Kontroller pH af neutraliseret kollagen med lakmusprøve papir (pH skal være ~ 7,5).
- Disperse 100 μL neutraliseret kollagen opløsning jævnt ved hjælp af en forkølet 200 μL spids over overfladen af en 3,5 cm parabol sæt på is.
- Inkubér natten over under standard dyrkningsbetingelser (inkubator med 5% CO2 ved 37 °c). På dagen for primær hepatocyt isolation tilsættes 1 ml forvarmet (37 °c) PBS til det første kollagenlag. Lad Kollagenet rehydrere i 2-3 h ved 37 °C.
3. opsætning af udstyr
- Forbered alt udstyr som anført i tabel over materialer og sat op som vist i figur 1.
4. kirurgisk indgreb
- Anæstetize musen ved intramuskulær injektion af Tiletamin (60 mg/kg legemsvægt), zolazepam (60 mg/kg), og xylazin (4,5 mg/kg). Efter flere minutter, Bekræft korrekt bedøvelsesmiddel af tåen knivspids. Hvis dyret ikke reagerer på knibning, skal du fortsætte til 4,2.
- Placer den bedøvede mus på en dissektions måtte og tape de nedre og øvre ekstremiteter for at fastgøre musen i en liggende position. Vatpind maven med 70% ethanol og åbne maven med en V-form indsnit fra kønsbehåring område til forreste ben. Fold huden over brystet for at afdække bughulen. Placer dissekting måtten under et dissekterende mikroskop.
- Bøj en insulin sprøjte kanyle (30 G) til en vinkel på 45 °. Udsæt den ringere Vena cava (IVC) ved at flytte tarmene og tyktarmen i den hale retning.
- Fyld 2,5 mL forvarmet (37 °C) opløsning C i en 2 mL sprøjte med en kanyle. Sørg for, at der ikke er luftbobler i kanyle eller sprøjte.
- Før kanyle ringen af IVC, skal du flytte lever loberne ved at trykke dem op til membranen med en våd (PBS) vatpind. Placer en silke sutur omkring IVC lige under leveren (figur 2a, B).
- Der indsprøjtes 10 μL heparin (5000 e/mL) i Portal vene ved hjælp af en insulin sprøjte med en 30 G nål bøjet i en 45 ° vinkel (figur 2C).
- At kanyle leveren, lave et lille snit med mikrokirurgisk saks til IVC direkte ved siden af leveren (under suturen; Figur 2D), der er stor nok til at indsætte kanylen. Fastgør kanylen i positionen ved hjælp af suturer og to kirurgiske knuder (figur 2E).
- Skær Portal vene (figur 2F) for at tillade perfusions buffere at flyde ud fra leveren for at forhindre udvidelse af leveren.
- Manuelt perfuse leveren med 1,5 mL forvarmet opløsning C ved langsomt at trykke på sprøjten tilsluttet kanylen (dette bør tage ~ 15 s). Fjernelse af blod fra leveren ved misfarvning af leveren kan nu observeres.
- Pre-fill en peristaltisk pumpe med præ-opvarmet (37 °C) opløsning C. Kontrollér perfusions apparatet, og sørg for, at der ikke er luftbobler i systemet.
- Frakobl forsigtigt kanylen fra sprøjten og Tilslut den til slangen på den peristaltiske pumpe, der kører ved strømningshastigheden på 2,5 mL/min. Arbejd hurtigt, men forsigtigt, og sørg for, at kanylen forbliver i position, og at der ikke kommer bobler ind i slangen eller kanylen.
- Bland leveren med opløsningen C i 2 min. (5 mL opløsning C). Skift til opløsning D og Fortsæt perfusion i yderligere 10 min (25 mL opløsning D).
- Når leveren er blevet perfektoret, fjerne det fra bughulen. Leveren vil nu være meget skrøbelig og bleg i farve (figur 3).
5. isolering af primære hepatocytter
- Fjern leveren fra musen. Kanylen vil stadig være bundet til leveren, så brug pincet til at løfte kanylen med leveren, og omhyggeligt afskære alle fascia forbindelser. Leveren overføres til et 50 mL rør, der indeholder 20 mL forvarmet opløsning E.
- Hold kanylen med leveren ved hjælp af pincet og disassociere vævet ved at gnide leveren omkring væggen af røret for at overføre de isolerede hepatocytter i buffer. Hold de isolerede celler på is.
Bemærk: isolerede primære hepatocytter er levedygtige i flere timer, mens de holdes på is. Brugere kan gentage trin 4,1 til 5,2 isolerende primære hepatocytter fra en anden donor mus, hvis det er nødvendigt, eller gå videre til næste trin. - Placer en 70 μm nylon cellefilter på toppen af et 50 mL rør og Filtrer de isolerede celler.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 50 x g og 4 °c i 5 min. Aspirér supernatanten. For at fjerne døde celler og øge procentdelen af levedygtige celler, resuspendere pellet i 20 mL af 40% percol i DMEM.
- Centrifugeglasset centrifugeres ved 50 x g og 4 °c i 5 min. Aspirér supernatanten indeholdende døde celler, og resuspender pellet i 20 ml opløsning E.
- Centrifugerør ved 50 x g og 4 °c i 5 min. Aspirér supernatanten, og resuspender pellet i 10 ml opløsning E.
- Kontroller det primære hepatocyttal udbytte og levedygtighed ved hjælp trypan og et blå farvning. Tæl celle nummeret ved hjælp af en Neubauer celle tælle kammer og justere celle koncentrationen til 3,75 x 105 levedygtige celler/ml. Hold cellerne på is.
6. dyrkning af primære hepatocytter i 3D kollagen sandwich
- Forbered hepatocyt Culture medium (HCM). Tilsæt 15 μL Glucagon (1 mg/mL), 15 μL hydrocortison (50 mg/mL) og 40 μL insulin (10 mg/mL) til 50 mL komplet medium (DMEM, højt glucose, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin).
- Jævnt sprede 2 ml (5 x 105 celler/ml) af levedygtige primære hepatocytter i en pre-coated 3,5 cm skål. Cellerne inkubates med 5% CO2 ved 37 °c i 3 timer. vigtigt: jævnt distribuere cellerne ved at vippe skålen i alle retninger lige før at sætte skålen i inkubator.
- Forbered neutraliseret kollagen I (100 μL/3,5 cm skål; dvs. en tilstrækkelig mængde til alle retter som beskrevet ovenfor [trin 2,1]). Hold på isen indtil brug.
- Efter 3 timer skal du forsigtigt fjerne de mellemstore og ikke-tilsluttede celler og tilføje 100 μL neutraliseret kollagen I til hver 3,5 cm skål for at danne det øverste lag af kollagen sandwich på celler. Kollagen-sandwichen inkubates under standard celle-dyrkningsbetingelser (5% CO2 ved 37 °c) i 1 time. Efter en 1 h inkubation tilsættes forsigtigt 2 mL HCM.
- Efter 24 timer af kulturen, ændre HCM medium for en frisk en.
- Kultur i 3 – 8 dage, afhængigt af dannelsen af galde canaliculi. Undersøg kulturen hver dag under et mikroskop (figur 4). Skift HCM hver anden dag.
7. immunolabeling af primære hepatocytter i 3D kollagen sandwich
- Fjern medierne fra hepatocyt sandwich, derefter vaskes forsigtigt med præ-varmet PBS. Ret sandwich kulturen med 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Efter fiksering vaskes sandwicherne 3x i 10 min i 2 mL PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T).
- Permeabilize celler med 1 mL 0,1 M Glycin, 0,2% Triton X-100 i PBS ved RT for 1 h. vask 3x i 10 min i PBS-T.
- Forstyrre forsigtigt det øverste lag af kollagen ved hjælp af en 10 μL læsse spids forbundet til en vakuum aspiration for at sikre tilstrækkelig antistof penetration.
- Blok med 1 mL 5% BSA i PBS-T (dvs. blokerende opløsning) i 2 timer. Inkubatin med primære antistoffer fortyndet i blokerende opløsning natten over ved 37 °C. Vask 3x i 15 minutter i PBS-T.
- Efter vask, Inkuber med sekundært antistof ved 37 °C i 5 h. vask 3x i 15 min i PBS-T efterfulgt af 1x vask med destilleret H2O.
- Montering med anti-fade monterings medier (Se tabel over materialer) til mikroskopi.
Representative Results
Mus primære hepatocytter blev isoleret og seedet i 3D kollagen sandwich. Galde eller mellem to tilstødende celler begyndte at danne inden for flere timer efter såning. Celler dannede klynger og selvorganiserede i et omtrent almindeligt netværk af galde eller inden for 1 dag (figur 4). Inden for 3 – 6 dage blev klynger af 5 – 10 celler normalt observeret med fuldt polariserede hepatocytter, der dannede et canaliculært netværk (figur 4).
Behandling af primære mus hepatocytter i 3D kollagen sandwich med enten toksin (ethanol) eller cytoskelet-ændre narkotika (f. eks, blebbistatin, okadainsyre) resulterede i ændringer i hepatocyt cytoskelet, eller bredde, form, og antallet af galde eller illustreret ved immunolabeling med et antistof til Keratin 8 (den mest rigelige Keratin i hepatocytter), phalloidin (visualisering af F-actin), og antistof til stramt Junction protein zonula occludens-1 (zo-1; Figur 5).
Ethanol behandling havde kun en mild virkning på organiseringen af keratin 8; Men, det øget tortuositet (set fra F-actin farvning) og fordeling af galde canaliculære bredder (figur 5). Signal intensiteten af zo-1-farvning blev reduceret i ethanol-behandlet galde eller sammenlignet med ubehandlet kontrol, hvilket tyder på et tab af stramme kryds efter ethanol behandling. Hæmning af actomyosin kontraktilitet med blebbistatin påvirkede signifikant formen og antallet af galde canaliculi. Det regulære canaliculære netværk blev reorganiseret sammenlignet med ubehandlet hepatocytter i uordnet formet galde eller med en øget incidens af tyk afrundet galde eller i stedet for tynde lange (som det ses i histogrammet af canaliculære bredder).
Desuden, behandling med okadainsyre (OA) inhiberende fosfataser stærkt påvirket de fysiske egenskaber af keratiner, som tidligere vist8,17. OA ændrer opløseligheden af keratin filamenter; således resulterede behandlingen i en dybtgående omlægning af keratin meshværket, som kollapsede i store perinukleare aggregater. Både F-actin og tight Junction protein zo-1 var ikke lokaliseret i nogen bestemt strukturer, hvilket tyder på næsten fuldstændig forsvinden af organiserede galde eller og et fuldstændigt tab af hepatocyt polaritet. Den resterende galde eller blev signifikant indsnævret sammenlignet med ubehandlede Kontroller, som det ses i det canaliculære bredde-histogram (figur 5).
At korrelere mikroskopiske observationer af ændringer i cytoskeletet hepatocyt med hepatocellulær biokemisk respons på behandling, protokollen målte også niveauer af alanin aminotransferase (ALAT) og aspartat transaminase (AST) (to leverenzymer, der almindeligvis anvendes som hepatocellulære skade markører) i supernatanten fra 3D kollagen sandwich (figur 6)18. Ethanolbehandling forhøjede niveauerne af både ALAT og AST signifikant, hvilket tyder på svær hepatocellulær skade. Blebbistatinbehandling førte ikke til betydelige ændringer i både ALAT-og asat-niveauerne sammenlignet med okadainsyrebehandling, som udløste milde biokemiske ændringer med forhøjede niveauer af ALAT, men ingen ændring i niveauet af asat. Således er biokemiske markører for hepatocellulær skade målt in vitro fra hepatocyt supernatanten korrelerer med de cytoskeletale ændringer observeret ved immun farvning.
Figur 1: eksperimentel opsætning. (A) mus fastgjort i liggende position, er placeret under en dissekere mikroskop før operationen. Alle nødvendige kirurgiske instrumenter er placeret på en bakke. (B) perfusion Suite under mus lever perfusion viser silikone slange forbinder reservoiret med varm buffer og perfbrugte mus. C) skematisk gengivelse af B. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: åbning af bughulen og kanylering af IVC. Maven åbnes med en V-form indsnit fra det kønsbehåring område til forreste ben. Huden foldes over brystet for at eksponere og forstørre bughulen. At udsætte IVC, tarmene og tyktarmen er omhyggeligt flyttet hale. (A, B) Før kanyle ringen af IVC bør lever lapper flyttes ved at trykke dem opad til mellem gulvet med en PBS-furet vatpind. IVC er derefter omhyggeligt adskilt fra omgivende væv, og en silke sutur er placeret omkring IVC i nærheden af leveren. Panel B repræsenterer skematik i bughulen vist i panel A. Lever lobes, Gut, ringere Vena cava (IVC, rød), og suturer er indiceret. (C) heparin injiceres i Portal VENE (PV, Arrow) med en insulin sprøjte (30 G nål bøjet ved 45 ° vinkel). (D) for at kanyle leveren, er IVC indsnit direkte ved siden af leveren (under suturen). E) kanylen indsættes og fastgøres med suturer ved at binde to kirurgiske knuder. (F) portalen vene er fuldt skåret til at tillade gratis buffer udstrømning, forhindrer lever ekspansion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative lever billeder før og efter perfusion. (A, B) Den kanylerede lever blev genbrugt og perfektioneret i 12 min. ved en strømningshastighed på 2,5 mL/min. Bemærk den signifikant misfarvede lever efter perfusion (B) sammenlignet med den nygenerede lever (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:3D kollagen sandwich kultur af primær mus hepatocytter. Repræsentative lyse-feltbilleder af mus primære hepatocytter dyrket i 1, 2, og 3 dage i 3D-betingelser. Det skal bemærkes, at større klynger af meget organiserede celler dannes efter 3 dage i kulturen. Boxed områder viser ~ 3x forstørrede billeder. Arrowheads indikerer galde canaliculi. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: vurdering af den morfologiske respons på toksisk stress ved immunfluorescent mikroskopi. Primær mus hepatocytter kulturperler i 3D kollagen sandwich blev behandlet med toksiner (ethanol, blebbistatin, eller okadainsyre) på dag 3 af kultur. Faste celler blev plettet til at visualisere cytoskelet komponenter: Keratin 8 (grøn), F-actin (rød), og zonula occludens-1 (ZO-1, magenta) ved immunofluorescence. Den giftige behandling førte til disorganisering af visualiserede cytoskelet komponenter, og det reducerede antallet og øget tortuositet af galde canaliculi. Canaliculære bredder blev målt i både ubehandlet og behandlet hepatocytter og afbildes som histogrammer af bredder fordeling. Arrowheads indikerer galde canaliculi. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: biokemisk analyse af reaktionen af 3D hepatocyt collagen sandwich til toksisk skade in vitro. ALT og AST, veletablerede markører for hepatocellulær skade, blev målt i supernatanten fra 3D hepatocyt kollagen sandwich behandlet med toksiner (ethanol, blebbistatin, og okadainsyre). ALAT og AST blev forhøjet i behandlede celler sammenlignet med ubehandlede. Data indberettes som aritmetiske midler ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stamopløsning A (10x) | |
| Reagens | Endelig koncentration (g/liter) |
| Nacl | 80 |
| KCl | 4 |
| MgSO4· 7h2O | 1,97 |
| Na2HPO4· 2H2O | 0,598 |
| KH2po4 | 0,6 |
Tabel 1: stamopløsning en opskrift.
| Stamopløsning B (10x) | |
| Reagens | Endelig koncentration (g/liter) |
| Nacl | 69 |
| KCl | 3,6 |
| KH2po4 | 1,30 |
| MgSO4· 7h2O | 2,94 |
| CaCl2 | 2,772 |
Tabel 2: stamopløsning B opskrift.
| Løsning C | |
| Reagens | |
| Stamopløsning A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1094 g |
| EGTA | 0,0095 g |
| dH2O | til 50 mL |
Tabel 3: stamopløsning C opskrift.
| Løsning D | |
| Reagens | |
| Stamopløsning A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0,065 g |
| CaCl2 | 0,0125 g |
| dH2O | til 30 mL |
Tabel 4: stamopløsning D opskrift.
| Løsning E | |
| Reagens | |
| Stamopløsning B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glukose | 0,045 g |
| dH2O | til 50 mL |
Tabel 5: stamopløsning E opskrift.
Discussion
Brugen af mus primære hepatocyt kulturer er vigtigt for in vitro-undersøgelser for bedre at forstå signalering processer involveret i etableringen af hepatocyt polarisering, korrekt canaliculært struktur dannelse, og galde sekretion. Udfordringerne i isolation og langsigtet kultur af mus primære hepatocytter i 2D kultur har drevet opfindelsen af flere tekniske tilgange med øget isolation effektivitet og levetid af isolerede celler, hver med flere fordele og Ulemper. Det er nu almindeligt accepteret, at 2D-kulturer af primære hepatocytter efterligner kun begrænset antal attributter af leveren biologi for en kort periode. Således 3D dyrkning i en kollagen sandwich arrangement er bredt erstatter de 2D betingelser, især når fokuseret på funktion af cytoskelet i leveren biologi (f. eks, giftige narkotika effekter eller rumlig organisering af galde transport).
Siden 1980 ' erne, flere protokoller for isolering af mus hepatocytter med forskellige modifikationer er blevet beskrevet. Den to-trins kollagenase perfusion tilgang er blevet meget udbredt i mange laboratorier. Tilføjelsen af gradient centrifugering i isolations protokollen tillader fjernelse af døde celler19,20 og øger antallet af levedygtige celler (her rutinemæssigt til ~ 93%). Selv om dette trin udvider behandlingstiden for cellerne og resulterer i reducerede cellenumre21, ses dette trin som nødvendigt i 3D kollagen sandwich kulturen for korrekt galde canaliculært netværksdannelse. Derudover er det vigtigere at fortsætte hurtigt og præcist under perfusions trin, hvilket forkorter den tid, cellerne håndteres.
Andre vigtige faktorer, der øger levedygtigheden af cellerne og deres evne til at danne canaliculært netværk i 3D er brugen af frisk tilberedte opløsninger og undgåelse af bobler under perfusion. Derfor bør opløsninger være forberedt på dagen for mus hepatocyt isolation, og den peristaltiske pumpe og slanger skal kontrolleres, når de skifter opløsninger. Hvis protokollen følges nøje, bør isolering af primære hepatocytter lykkes med et højt udbytte af levedygtige celler.
En anden kritisk faktor i langsigtede 3D hepatocyt kultur er den oprindelige kilde til primære hepatocytter, der anvendes. Det er vigtigt at bruge dyr, der er 8 – 12 uger gamle, der tjener som optimale donorer af hepatocytter. Brugen af hepatocytter fra ældre dyr var ikke så vellykket i langsigtet kultur, som disse hepatocytter ændrede deres morfologi oftere, depolariseret, og ophørte med at danne canaliculært netværk. Også plating hepatocytter på korrekt neutraliseret kollagen gel dannet af relativt stærkt koncentreret opløsning er et afgørende skridt. I de fleste protokoller anvendes der koncentrationer på ca. 1 mg/mL. Efter mange optimeringer er en koncentration på 1,5 mg/mL optimal til langvarig hepatocyt dyrkning og giver meget organiserede hepatocytter med dannet galde canaliculi.
Denne nemme at følge protokol giver langsigtet dyrkning af primære mus hepatocytter. Repræsentative resultater demonstrere et bredt spektrum af brug for 3D kulturperler primær mus hepatocytter når man studerer rollen af cytoskelet komponenter i galde eller dannelse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Den Tjekkiske Republiks tilskuds agentur (18-02699S); Den Tjekkiske Republiks sundhedsministeriums tilskuds agentur (17-31538A) det institutionelle forskningsprojekt under det tjekkiske Videnskabsakademi (RVO 68378050) og MEYS CR-projekter (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ. 1,05/2.1.00/19.0395 og OP RDE CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_013/0001775); Charles University (Personal stipendium til K.K.), og et operationelt program Prag-konkurrenceevne projekt (CZ. 2.16/3.1.00/21547). Vi anerkender den lette mikroskopi kerne facilitet, IMG CAS, Prag, Tjekkiet (støttet Meys CR projekter LM2015062 og LO1419) for støtte med mikroskopi Imaging præsenteret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
