Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.
Abstract
הפטציטים הם התאים המרכזיים של הכבד האחראים לתפקוד חילוף החומרים שלו. ככאלה, הם יוצרים האפיתל מקוטב ייחודי, שבו שני או יותר הפטוציטים לתרום הקרום האפילי ליצור רשת המרה שדרכה המרה מופרש. הפטציט פולריזציה הכרחית להיווצרות הקנאליזציה הנכונה והיא תלויה באינטראקציות בין שלד הציטוציט, הקשר בין תאי התא לבין המטריצה המיפתתית. במחקרים בעלי מבחנה של מעורבות השלד הציטוציט במבנה קאנאלילי ותגובתה למצבים פתולוגיים, הינם נכים על ידי חוסר תרבות התאים, אשר דומה מאוד למבנה הרשת הקנאליאני בvivo. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מן הכבד העכבר המבוגר באמצעות שינוי שונה הקולגן הטכניקה בטכניקת. מתואר גם הייצור של התרבות בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, אשר משמש לאימונויניום של רכיבים ציטושלד לחקור את היווצרות המרה ותגובתה לטיפולים מבחנה. הוא מראה כי hepatocyte 3d כריך קולגן התרבויות להגיב טיפולים עם רעלים (אתנול) או אקטין השלד משנה תרופות משנה (g., בלאקסטטין) ולשמש כלי רב ערך עבור לימודי מבחנה של היווצרות ותפקוד של המרה.
Introduction
Hepatocytes, המבנים הסלולריים המרכזיים של הכבד האחראים פונקציות מטבוליות שלה, הם באופן ייחודי תאים אפיתל מקוטב. הקיטוב שלהם, המופיעים ביונקים זמן קצר לאחר הלידה, תוצאות היווצרות הרשת המרה והיא חיונית לפרשת מרה נאותה. קרום הקודקוד של הפטציטים בצורה קולקטיבית, ואילו הקרומים הבזליים נשארים במגע עם האנדותל של הסינאונואידים. אובדנו של הפטציט פולריזציה מוביל להפצה מראש של מובילי המרה ותוצאות בתהליכים פתולוגיים הקשורים בשמירה על המרה בכבד (כלומר, כולאוסטזיס).
הקמתה ותחזוקתו של הפטציט פולריזציה ופיתוח המרה כרוכה במנגנונים מורכבים. התהליכים הבסיסיים תלויים באינטראקציה הקולקטיבית בין שלד הפתציט, הקשר בין תאי התא והאינטראקציות עם מטריצת החילוץ1. שלד ציטוציט מורכב מכל שלוש רשתות הפילמנט, שלד הציטוטין, microtubules וחוטי ביניים, המספקים תמיכה מבנית למערך הקנאלילי. התפקיד הדיפרנציאלי של רכיבים ציטולדים בהתחדשות ותחזוקה של רשתות המרה מומחש בעבר בתוך מבחנה ב-3D קולגן-סנדוויץ ' ההיפטציט תרבויות2.
במהלך השלבים הראשוניים של הפולריזציה של ממברנה הפציט, באתרים של דורהשנישל המיקרוקלולוס, מיקרופיטין ומיקרוטובולים חשובים. השלד ציטוטין מקימה את המבנה ואת התפקוד של המרה canaliculi, יוצרים מיקרופילדים הקשורים ממברנה ואת הטבעת הcircum, ובכך לתמוך באדריכלות canaliculi והוספת השלד ציטוטין לתוך הצמתים הדוקה וחסיד3. הטבעת של חוטים ביניים קרטין מחוץ לשלד ציטוטין מייצב נוסף את המבנה הקנאלילי3.
החשיבות של חלבונים ב hepatocyte junctional מתחמי בארגון של האדריכלות מרה canaliculi היתה מתועדת היטב בכמה מודלים העכבר לנקוש מספר, אשר מראים canaliculi מעוות בעכברים חסר הן הדוקה ו/או מחסיד junctional חלבונים4,5,6. מחיקה של חלבון הצומת חסיד α-catenin הוכח להוביל לחוסר של השלד ציטוציט אקטין, רחבה של המרה לומן, הצמתים דולף הדוק, וביעילות לתוך פנוטיפ הכיס הולסטטי4. יתר על כן, במחקרים בלתי מתורבת הראו את החשיבות של רכיבי הצומת מחסיד E-קדהרין ו-β-catenin בשיפוצים של לומן appatocתאיים וסחר בחלבונים7.
בצורה מעולה, אבלציה של השלד ציטובן המקשר את plectin חלבון, אשר הוא המארגן קרטין הגדולות, חשף פנוטיפים הדומים לאלה המקושרים לשלד ציטוטין8. זה מציע תפקיד קריטי של חוטי ביניים קרטין בתמיכה של המבנה הקנאלילי. במחקרים חוץ גופית ניצול 3D hepatocyte קולגן כריכים הראו גם את החשיבות של האנטי-מנוע חלבון קינאז והזרם שלה activator LKB1 בתצורת רשת המרה9. ממצאים אלה התקבל לאחר מכן על ידי הבאים במחקרים vivo10,11. לפיכך, התברר כי במחקרים מחוץ לרשת נחוצים להבנת תהליכי האיתות המעורבים בהקמת הפולריזציה קיטוב, היווצרות רשתות מתאימות והפרשת מרה.
האתגר העיקרי בחקר תהליכים הקשורים עם היווצרות המרה והתגובה שלה למצבים פתולוגיים בתוך מבחנה היא באמצעות מצבים של תרבות התא הדומה למצב ב vivo12. הפטציטים הראשיים המבודדים אינם מקוטדים; לפיכך, הם מאבדים את תפקידם, מורפולוגיה, ומתקני המרה הפונקציונלית בתנאים התרבותיים הדו (למשל, שינויים בתקנות הגנים, הקיטוב והדה-בידול13,14,15). למרות העובדה הזו, הפטציטים מבודדים היטב משקפים את טבעו של הכבד בvivo, בניגוד לקווי הכבד הנגזרים מתאי16. למרות שהם שימשו בעבר, קווי התאים הונצח לא להפעיל את המיורפולוגיה אופייני האפיתל של hepatocytes, ואת המרה של לומן שנוצר על ידי תאים אלה הדומים לכבד canalicular7. לאחרונה, התרבויות 3D של hepatocytes הראשי, משני עכברים וחולדות, הפכו כלי שימושי כדי לחקור את התהליכים המעורבים בהקמת רשת המרה של מבחנה9. הפציטים הראשי מתורבת בין שתי שכבות של קולגן (המכונה כריך קולגן 3D התרבות) יכול repolarize בתוך כמה ימים. בגלל דרישות טכניות גבוהות נדרש כאשר culturing העכבר העליון בסנדוויצ קולגן 3D, כאן אנו מציגים פרוטוקול מורכב כדי לבודד, לטפח, וכדי immunolabel עכבר מוטבע כריכי קולגן 3D כדי לאפיין את המעורבות של רכיבים ציטושלד במהלך היווצרות המרה.
Protocol
כל ניסויי החיות בוצעו לפי הדירקטיבה האירופאית 2010/63/האיחוד האירופי ואושרו על ידי הנציבות המרכזית הצ לרווחת בעלי חיים.
1. חומרים
- בעלי חיים בבית תחת תנאים ללא פתוגן ספציפי על פי ההנחיות של הפדרציה לחקר בעלי חיים מעבדה האגודות עם גישה חופשית אוכל רגיל ושתיית מים. בעלי חיים מתחת למחזור כהה/מהיר של 12 שעות. לצורך הבידוד והתרבות, השתמשו בחיות בן 8 – 12 שבועות.
- פתרונות מניות A ו-B
- הכן פתרון מניות A ופתרון מניות B לפי טבלה 1 ושולחן 2, בהתאמה, מראש. מפזר את כל הרכיבים ב 1 L של מזוקק H2o (dH2o).
- להתאים את ה-pH של פתרונות כדי 7.2 ולסנן את הפתרונות באמצעות פילטר 0.2 יקרומטר. ניתן לאחסן את שני הפתרונות ב -4 ° c עד 6 חודשים.
- פתרון מניות C
- הכינו פתרון סי ביום הבידוד. הראשוני של הפאציט
- הוסף את כל הרכיבים בהתאם לטבלה 3, מלא לנפח הכולל 50 ML עם dH2O, והתמוססות. כוונן את ה-pH ל-7.3.
- 50 mL של הפתרון בצינורות 50 mL. . השתמש בצינור אחד לכל חיה מניחים את כל התוספות הנדרשות באמבט מים מחומם מראש (37 ° c).
- פתרון מניות D
- הכינו פתרון D ביום הבידוד הראשוני של הפאציט.
- הוסף את כל הרכיבים בהתאם לטבלה 4, המשך לנפח הכולל של 30 מ ל עם dH2O והתמוססות. כוונן את ה-pH ל-7.3.
- מחלקים 30 מ ל של הפתרון בצינורות 50 mL. הוסף קולגן ואני (5 מ"ג/30 mL) לתוך פתרון D. השתמש באחד משני החלקים לכל חיה. מניחים את כל התוספות באמבט מים מחומם מראש (37 ° c).
- פתרון מניות E
- הכינו פתרון E ביום הבידוד הראשוני של hepatocyte.
- הוסף את כל הרכיבים לפי טבלה 5, מלא לאמצעי אחסון כולל של 50 ML עם dH2O והתמוססות. כוונן את ה-pH ל-7.3.
- 50 mL של הפתרון בצינורות 50 mL. הוסף אלבומין V (0.65 g/50 mL) לפתרון E. השתמש באחד משני המינים לכל חיה. מניחים את כל התוספות באמבט מים מחומם מראש (37 ° c).
2. הכנת כריכי קולגן
- הכינו את השכבה הראשונה. של כריך הקולגן
הערה: לעבוד על קרח ולהשתמש פתרונות טרום מקורר, טיפים, צלחות, וצינורות כדי למזער את הגגנציה לא רצויה של קולגן I. - לנטרל את הכמות הנדרשת של קולגן אני (מזנב חולדה) על פי פרוטוקול של היצרן. נפח של 100 μL של קולגן לנטרל (1.5 mg/mL) לכל מדגם ניסיוני (3.5 cm צלחת) נדרש. כדי להכין 1 mL של קולגן לנטרל (1.5 mg/mL), להוסיף 100 μL של 10x DMEM, 1.5 μL של 1M NaOH, ו 48.5 μL של dH2O לתוך 500 μl של קולגן (ריכוז מניות = 3 מ"ג/mL). בדוק את ה-pH של קולגן לנטרל עם נייר לקמוס (ה-pH צריך להיות ~ 7.5).
- לפזר 100 μL של פתרון קולגן לנטרל באופן שווה באמצעות מראש מקורר 200 μL טיפ על פני השטח של מערכת 3.5 ס"מ להגדיר על קרח.
- דגירה לילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים (חממה עם 5% CO2 ב 37 ° c). ביום של הבידוד הראשוני hepatocyte, להוסיף 1 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) PBS לשכבת הקולגן הראשון. אפשר לקולגן לעבור מחדש עבור 2-3 h ב 37 ° c.
3. הגדרת ציוד
- הכן את כל הציוד כמפורט ברשימת החומרים והגדר כמוצג באיור 1.
4. הליך כירורגי
- הרליד העכבר על ידי הזרקת השרירים של tiletamine (60 מ"ג/ק ג של משקל הגוף), זולפם (60 מ"ג/ק"ג), ו xylazine (4.5 מ"ג/ק"ג). לאחר מספר דקות, לאשר את ההרדמה הנכונה על ידי צביטה הבוהן. , אם החיה לא תגיב לצביטה. המשך ל-4.2
- מניחים את העכבר מורדם על מחצלת לחיתוך וקלטת את הגפיים התחתונות והעליון כדי לתקן את העכבר במצב פרקדן. לנגב את הבטן עם 70% אתנול ולפתוח את הבטן עם חתך צורת V מאזור הערווה לרגליים הקדמיות. מקפלים את העור על החזה כדי לחשוף את חלל הבטן. מניחים את המשטח החוצה. תחת מיקרוסקופ מבתר
- לכופף מחט מזרק אינסולין (30 G) לזווית 45 °. לחשוף את האובלה הנחותה (IVC) על ידי הזזת המעיים והמעי הגס בכיוון caudal.
- מילוי 2.5 mL של מחמם טרום מחומם (37 ° c) פתרון C לתוך מזרק 2 מ ל עם צינורית. ודא שאין בועות אוויר בצינורית או במזרק.
- לפני הצינורית של IVC, למקם מחדש את האונות בכבד על ידי לחיצה עליהם עד הסרעפת עם ספוגית רטוב (PBS) כותנה. מניחים תפר משי סביב IVC ממש מתחת לכבד (איור 2א, ב).
- הכנס 10 μL של הפארין (5000 U/mL) לתוך הווריד הפורטל באמצעות מזרק אינסולין עם מחט של 30 גרם כפוף בזווית 45 ° (איור 2ג).
- כדי צינורית הכבד, לעשות חתך קטן עם מספריים יקרוכירורגית ל-ivc ישירות ליד הכבד (מתחת תפר; איור 2ד) זה גדול מספיק כדי להכניס את הצינורית. אבטחו את הצינורית בתנוחה באמצעות תפרים ושתי קשרים כירורגיים (איור 2E).
- חותכים את הווריד השער (איור 2F) כדי לאפשר למאגרי ההיתוך לזרום מהכבד כדי למנוע התרחבות של הכבד.
- באופן ידני את הכבד עם 1.5 מ ל של הפתרון הטרום מחומם C על ידי לחיצה איטית על המזרק המחובר לצינורית (זה צריך לקחת ~ 15 s). הסרת דם מהכבד על ידי שינוי צבע של הכבד יכול עכשיו להיות נצפתה.
- מילוי משאבה פריסטלטית עם התקן טרום מחומם (37 ° c) C. בדוק את מכשיר ההיתוך וודא כי אין בועות אוויר במערכת.
- נתק בזהירות את הצינורית ממזרק וחבר אותו לצינורות של המשאבה הפריסטלטית הפועלת בקצב הזרימה של 2.5 mL/min. עבודה במהירות אך בזהירות ולהבטיח כי צינורית נשאר בעמדה וכי אין בועות להיכנס אבובים או צינורית.
- מבשם הכבד עם פתרון C עבור 2 דקות (5 מ"ל של פתרון C). לשנות את הפתרון D ולהמשיך את הפרזיה עבור 10 דקות נוספות (25 מ ל של פתרון D).
- , ברגע שהכבד הושם את הכבד. הסירו אותו מחלל הבטן הכבד יהיה כעת מאוד שברירי וחיוור בצבע (איור 3).
5. בידוד ההיפאציטים הראשוניים
- להסיר את הכבד מהעכבר. הצינורית עדיין תהיה קשורה לכבד, לכן השתמשו בלקחיים כדי להרים את הצינורית עם הכבד, ולנתק בזהירות את כל החיבורים הfascia. העבר את הכבד לצינור 50 mL המכיל 20 מ ל של הפתרון הטרום מחומם E.
- להחזיק את הצינורית עם הכבד באמצעות מלקחיים ולנתק את הרקמה על ידי לשפשף את הכבד סביב הקיר של הצינור כדי להעביר את hepatocytes מבודדים לתוך המאגר. . השאר את התאים המבודדים בקרח
הערה: האסכולה ההפאציטים המרכזית מבודדת במשך מספר שעות, תוך שמירה על הקרח. משתמשים יכולים לחזור על שלבים 4.1 עד 5.2 בידוד החרופציטים ראשונית מעכבר תורם אחר, אם יש צורך, או להמשיך לשלב הבא. - מקום מסננת תא ניילון 70 יקרומטר על גבי שפופרת 50 mL ולסנן את התאים המבודדים.
- צנטריפוגה את הצינור ב 50 x g ו 4 ° c עבור 5 דקות.. מרוב הסופרנטאנט כדי להסיר תאים מתים ולהגדיל את אחוז התאים קיימא, להשעות מחדש את הגלולה ב 20 מ ל של 40% percol ב DMEM.
- צנטריפוגה את הצינור ב 50 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות. הסופר המכיל תאים מתים והשהה מחדש את הגלולה ב 20 מ ל של פתרון E.
- צינורות צנטריפוגה ב 50 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של פתרון E.
- בדקו את התפוקה והכדאיות הראשונית של ההיפטציט באמצעות טריטין כתמים. ספור את מספר התאים באמצעות תא של מונה תאים מנויבאואר וכוונן את הריכוז של התא ל-3.75 x5 תאים מתאימים/mL. . השאר את התאים על הקרח
6. טיפוח של המופיציטים ראשוניים בכריכים קולגן תלת-ממדיים
- הכינו את התרבות הבינונית-מדיום (HCM). הוסף 15 μl של גלוקגון (1 מ"ג/ml), 15 μl של הידרוקורטיזון (50 מ"ג/ml), ו 40 μl של אינסולין (10 מ"ג/ml) כדי 50 mL של בינוני מלא (dmem גלוקוז גבוה, 10% fbs, 1% פניצילין-סטרפטומיצין).
- לפזר באופן שווה 2 מ ל (5 x 105 תאים/ml) של hepatocytes הראשי קיימא בצלחת מצופה מראש 3.5 ס מ. מודחת התאים עם 5% CO2 ב 37 ° c עבור 3 h. חשוב: לפזר באופן שווה את התאים על ידי הטיית הצלחת בכל הכיוונים רק לפני לשים את התבשיל לתוך החממה.
- להכין קולגן נטרל I (100 μL/3.5 ס"מ צלחת; כלומר, נפח מספיק עבור כל הכלים כמתואר לעיל [שלב 2.1]). . המשיכו להשתמש בקרח עד השימוש
- לאחר 3 שעות, בזהירות להסיר את התאים בינונית ובלתי מחוברת ולהוסיף 100 μL של קולגן לנטרל אני כל 3.5 ס"מ צלחת ליצור את השכבה העליונה של כריך קולגן על התאים. מודטה את כריך הקולגן בתנאים הסטנדרטיים התרבות התא (5% CO2 ב 37 ° c) עבור 1 h. לאחר הדגירה 1 h, בזהירות להוסיף 2 מ ל של HCM.
- לאחר 24 שעות של תרבות, לשנות את המדיום HCM עבור אחד טרי.
- תרבות במשך 3 – 8 ימים, בהתאם להיווצרות מיכל המרה. בדוק את התרבות כל יום תחת מיקרוסקופ (איור 4). שנה את ה-HCM כל יום שנייה.
7. אימונוולבלינג של הפטציטים ראשוניים בכריכים קולגן תלת-ממדיים
- להסיר את המדיה מסנדוויצ hepatocyte, ולאחר מכן לשטוף בזהירות עם הקדם מחומם PBS. תקן את תרבויות סנדוויץ עם 1 מ ל של 4% פאראמפורמלדהיד ב-PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- לאחר קיבעון, לשטוף את הסנדוויצ 3x עבור 10 דקות ב 2 מ ל של PBS + 0.1% רצף 20 (PBS-T).
- תאים מחלחלים עם 1 מ ל של 0.1 M גליצין, 0.2% טריטון X-100 ב-PBS ב RT עבור 1 h. לשטוף את 3x עבור 10 דקות ב-PBS-T.
- בעדינות להפריע את השכבה העליונה של קולגן באמצעות 10 μL טעינת טיפ מחובר שאיפה ואקום כדי להבטיח חדירה מספקת נוגדן.
- בלוק עם 1 מ ל של 5% BSA ב PBS-T (כלומר, חסימת פתרון) עבור 2 h. מודלת עם נוגדנים העיקרי מדולל בפתרון חסימת לילה ב 37 ° c. לרחוץ את 3x עבור 15 דקות ב-PBS-T.
- לאחר כביסה, דגירה עם נוגדן משני ב 37 ° c עבור 5 h. לשטוף 3x עבור 15 דקות ב-PBS-T ואחריו לשטוף 1x עם מזוקקים H2O.
- מאונט עם מדיה הרכבה נגד עמעום (ראה טבלת חומרים) למיקרוסקופיה.
Representative Results
העכבר הראשי החרופציטים היו מבודדים והופרה ב כריכי קולגן תלת-ממדיים. כולי המרה בין שני תאים סמוכים החלו להיווצר בתוך מספר שעות לאחר זריעה. תאים הקימו אשכולות ומאורגנים באופן עצמאי ברשת בקירוב של המרה בתוך יום אחד (איור 4). בתוך 3 – 6 ימים, אשכולות של 5-10 תאים נצפו בדרך כלל, עם hepatocytes מקוטב מלא להרכיב רשתcanalicular (איור 4).
הטיפול של העכבר הראשי הפטוציטים בכריכים קולגן 3D עם או רעלן (אתנול) או השלד תרופות משנה (למשל, בלייאוקסטטין, חומצה ok,) הביא שינויים בשלד הציטוציט, רוחב, צורה, ומספר של המרה מומחש על ידי immunolabeling עם נוגדן ל קרטין 8 (קרטין הנפוץ ביותר ב hepatocytes), phalloidin (ויזואליזציה של F-actin), ונוגדנים כדי הדוק בצומת חלבון zonula מאורות -1 (ZO-1; איור 5).
הטיפול אתנול היה רק השפעה קלה על הארגון של קרטין 8; עם זאת, היא הגדילה את tortuosity (כפי שנראה מ-F-actin כתמים) והפצה של רוחב המרה (איור 5). עוצמת האות של הצביעת ZO-1 הצטמצמה ב אתנול מטופל המרה canuli לעומת פקדים לא מטופלים, רומז אובדן של צמתים הדוקים לאחר טיפול אתנול. העיכוב של actomyosin כושר עם בלוקטיסטטין השפיע באופן משמעותי על הצורה והמספר של המרה canaliculi. הרשת canאליאליזה הרגיל היה מאורגן מראש, לעומת hepatocytes מטופל, לתוך הפרוע בצורת מעשה ידי מרה עם שכיחות מוגברת של המרה עבה מעוגל של מעוגלות במקום אלה ארוך דקים (כפי שנראה היסטוגרמה של רוחב הקאליאליזה).
בנוסף, הטיפול עם חומצה ok, (OA) מעכב זרחן משפיע מאוד על תכונות פיזיות של keratins, כפי שהוצג בעבר8,17. OA משנה את הסיסות של הסיבים קרטין; לפיכך, הטיפול הביא לסידור מראש מעמיק של העבודות הקרטין, שהתמוטטו באגרגטים גדולים וברורים. הן F-actin ו-חלבון הצומת הדוקה ZO-1 לא היו מקומיים לתוך מבנים מסוימים, מציע היעלמות כמעט מוחלטת של מאורגן המרה ואובדן מוחלט של קוטביות hepatocyte. מיכל המרה הנותר הצטמצם באופן משמעותי בהשוואה לפקדים לא מטופלות, כפי שנראה בהיסטוגרמה הרוחב של הערוץ (איור 5).
לתיאום תצפיות מיקרוסקופיים של שינויים בשלד הפתציט עם התגובה הביוכימית לטיפול, הפרוטוקול נמדד גם רמות של אלטין עמינח (ALT) ו אספרטט סירום (AST) (שני אנזימים בכבד המשמשים בדרך כלל כסמני פציעה hepatocתאיים) ב supernatant של כריכי 3d קולגן (איור 6)18. הטיפול אתנול הגבוהות באופן משמעותי את רמות של ALT ו-AST, מציע פציעה hepatocellular חמור. טיפול בליביוסטטין לא הוביל לשינויים ניכרים ברמות ALT ו-AST בהשוואה לטיפול בחומצה ok, אשר עוררה שינויים קלים בביוכימיים עם רמות גבוהות של ALT, אך אין שינוי ברמות של AST. לפיכך, סמנים ביוכימיים של פציעה הפטאותית הנמדדת במבחנה מהפטוציט סופרנט בתיאום עם שינויי השלד הציטומי שנצפו על ידי כתמים חיסוני.
איור 1: הגדרת הניסוי. (A) עכבר קבוע במצב פרקדן, ממוקם תחת מיקרוסקופ מבתר לפני הניתוח. כל כלי הניתוח הנדרשים ממוקמים על מגש. (ב) הסוויטה זלוף במהלך זלוף כבד העכבר מראה אבובים סיליקון חיבור מאגר עם מאגר חם ועכבר מבשם. (ג) ייצוג סכמטי של B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פתיחת חלל הבטן והצינורית של ה-IVC. הבטן נפתחת עם חתך של צורת V מאזור הערווה ועד הרגליים הקדמיות. העור מקופל על החזה כדי לחשוף ולהגדיל את חלל הבטן. כדי לחשוף את ה-IVC, המעיים והנקודתיים מועברים בזהירות. (א, ב) לפני הצינורית של ה-IVC, יש למקם את אונות הכבד על-ידי לחיצה עליהם כלפי מעלה לסרעפת בעזרת מילוי כותנה של PBS. ה-IVC מופרד בזהירות מרקמות שמסביב, ותפר משי ממוקם סביב ה-IVC בקרבת הכבד. פאנל ב' מייצג את השרטוטים של חלל הבטן המוצג בלוח A. האונות הכבד, בטן, הורד הלבן הנחותים (IVC, אדום), ותפרים מצוינים. (ג) הפארין מוזרק לווריד השער (PV, חץ) עם מזרק אינסולין (30 גרם מחט כפוף בזווית 45 °). (ד) כדי צינורית הכבד, ה-ivc מונצח ישירות ליד הכבד (מתחת לתפר). (ה) הצינורית מוכנסת ומאובטחת בתפרים באמצעות קשירת שני קשרים כירורגיים. (ו) הווריד של השער נחתך במלואו כדי לאפשר זרימה פנויה של מאגר, מניעת הרחבת הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מייצגים הכבד תמונות לפני ואחרי perfusion. (א, ב) הכבד הקנולזה היה מחדש ומיוצר עבור 12 דקות בקצב הזרימה של 2.5 mL/min. שים לב הכבד דהוי באופן משמעותי לאחר זלוף (ב) לעומת הכבד הטרי מחדש (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4:3D התרבות כריך קולגן של העכבר הראשי hepatocytes. הנציג באור בהיר תמונות של העכבר הראשי hepatocytes תרבותי עבור 1, 2, ו 3 ימים בתנאי תלת-ממד. יצוין כי אשכולות גדולים יותר של תאים מאורגנים מאוד נוצרות לאחר 3 ימים בתרבות. באזורים מסוימים מופיעים ~ 3x תמונות מוגדלות. ראשי חץ מצביעים. על כנפי המרה סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הערכת התגובה המורורפולוגית ללחץ רעיל על ידי מיקרוסקופ מוטוראוסקופיה. העכבר הראשי hepatocytes מתורבת בכריכים קולגן תלת-ממדיים טופלו רעלים (אתנול, בליידוסטטין, או חומצה ok,) ביום 3 של התרבות. תאים קבועים היו מוכתמים לדמיין רכיבים ציטושלד: קרטין 8 (ירוק), F-actin (אדום), ו zonula סגר -1 (ZO-1, מגנטה) על ידי immunofluorescence. הטיפול הרעיל הוביל לחוסר של מרכיבים שלדים של דמיינו, והוא הפחית את המספר והגדיל את הtortuosity של המרה. רוחב כאליאליאלילי נמדד בשני הצדדים שאינם מטופלים וטופלו ומתוארים כהיסטורגרמות של התפלגות הרוחב. ראשי חץ מצביעים. על כנפי המרה סרגל בקנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח ביוכימיים של התגובה של כריכי קולגן 3D hepatocyte לפציעה רעילה בתוך מבחנה. ALT ו-AST, סמנים הוקמה היטב של פציעה hepatocellular, נמדדה על-ידי כריכי קולגן 3D hepatציט מטופלים עם רעלים (אתנול, בלייאוקסטטין, ו okadaic חומצה). ALT ו-AST היו גבוהות בתאים מטופלים בהשוואה לאלה שאינם מטופלים. נתונים מדווחים כאמצעי אריתמטי ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מניות פתרון A (10x) | |
| ריאגנט | ריכוז סופי (גר'/ליטר) |
| מיכל שלמה | 80 |
| אשלגן כלורי | 4 |
| מדחס4· 7h2O | 1.97 |
| Na2hpo4· 2h2O | 0.598 |
| KH2פו4 | 0.6 |
טבלה 1: פתרון מניות. מתכון
| מניות פתרון B (10x) | |
| ריאגנט | ריכוז סופי (גר'/ליטר) |
| מיכל שלמה | 69 |
| אשלגן כלורי | 3.6 |
| KH2פו4 | 1.30 |
| מדחס4· 7h2O | 2.94 |
| מיכל2 | 2.772 |
שולחן 2: פתרון מניות B מתכון.
| פתרון C | |
| ריאגנט | |
| מניות פתרון A (10x) | 5 מ ל |
| נחקו3 | 0.1094 גרם |
| מיכל בגין | 0.0095 גרם |
| dH2O | עד 50 mL |
שולחן 3: פתרון מניות C מתכון.
| פתרון ד | |
| ריאגנט | |
| פתרון מניות A (10x) | 3 מ ל |
| נחקו3 | 0.065 גרם |
| מיכל2 | 0.0125 גרם |
| dH2O | עד 30 מ ל |
שולחן 4: פתרון מניות D מתכון.
| פתרון E | |
| ריאגנט | |
| פתרון מניות B (10x) | 5 מ ל |
| נחקו3 | 0.1 גרם |
| גלוקוז | 0.045 גרם |
| dH2O | עד 50 mL |
שולחן 5: פתרון מניות E מתכון.
Discussion
השימוש בתרביות החיציט העיקרי של העכבר חשוב במחקרים בעלי מבחנה כדי להבין טוב יותר את תהליכי האיתות המעורבים בהקמת הפולריזציה קיטוב, היווצרות מבנה מתאים והפרשת מרה. האתגרים בבידוד ותרבות ארוכת טווח של העכבר הראשי בתרבות דו-ממדית הניעו את ההמצאה של מספר גישות טכניות עם בידוד מוגבר ואריכות ימים של תאים מבודדים, כל אחד עם מספר יתרונות ו חסרונות. עכשיו זה מקובל באופן נרחב כי התרבויות הדו של hepatocytes הראשי מחקה רק מספר מוגבל של תכונות ביולוגיה של הכבד לתקופה קצרה של זמן. כך, טיפוח 3D בהסדר כריך קולגן הוא נרחב להחליף את התנאים 2D, במיוחד כאשר מתמקדים בפונקציה של שלד התא בביולוגיה של הכבד (g., תופעות לוואי רעילות או ארגון מרחבי של הובלה מרה).
מאז שנות ה-80, תוארו מספר פרוטוקולים לבידוד בעכבר הפטציטים עם שינויים שונים. במעבדות הרבות נעשה שימוש נרחב בשתי השלבים הללו. תוספת של הדרגתי צנטריפוגה לתוך פרוטוקול הבידוד מאפשר הסרת תאים מתים19,20 ומגדיל באופן משמעותי את מספר התאים הקיימא (כאן, שגרתי כדי ~ 93%). למרות שלב זה מרחיב את זמן הטיפול של התאים ותוצאות מספרים תא מופחת21, שלב זה מוצג כנדרש בתרבות כריך קולגן 3d עבור היווצרות רשת המרה הנכונה. בנוסף, חשוב יותר להמשיך במהירות ובדייקנות במהלך שלבי ההיתוך, התקצר את הזמן שבו מטופלות התאים.
גורמים חשובים אחרים המגבירים את הכדאיות של התאים ואת יכולתם ליצור רשתות canalicular ב-3D הוא השימוש של פתרונות טריים המוכנים הימנעות בועות במהלך perfusion. לכן, פתרונות צריך להיות מוכן ביום של בידוד hepatocyte העכבר, ואת המשאבה הפריסטלטית ואבובים יש לבדוק בעת שינוי פתרונות. אם הפרוטוקול מלווה באופן הדוק, הבידוד של החרופציטים הראשיות צריך להצליח בתשואה גבוהה של תאים מוצלחים.
גורם קריטי נוסף בתרבות החרופציט לטווח ארוך הוא המקור הראשוני של הפציטים הראשיות המשמשות. חשוב להשתמש בבעלי חיים בני 8 עד 12 שבועות, המשמשים כתורמים אופטימליים של hepatocytes. השימוש בפטציטים מבעלי חיים מבוגרים לא היה מוצלח בתרבות ארוכת טווח, מאחר שהפטוציטים האלה שינו את המבנה שלהם לעתים קרובות יותר, מפוקוטב, והפסיקו ליצור רשתות קנאליפיות. כמו כן, ציפוי הפטוציטים על ג'ל מנוטרל כראוי נוצר מפתרון מרוכז יחסית הוא צעד חיוני. ברוב הפרוטוקולים, משתמשים בריכוזים של כ-1 מ"ג/mL. לאחר מיטובי רבים, ריכוז של 1.5 מ"ג/mL הוא אופטימלי לטיפוח ארוך טווח והוא מספק הפטציטים מאורגן במיוחד עם הבנה של המרה.
פרוטוקול קל למעקב זה מאפשר טיפוח ארוך טווח של העכבר הראשי הפטוציטים. התוצאות הייצוגיות להפגין ספקטרום רחב של שימוש עבור 3D העכבר הראשי מתורבת הלחץ כאשר לימוד התפקיד של רכיבים ציטושלד במערך המרה canaliculi.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי סוכנות המענק של צ'כיה (18 02699S); סוכנות המענקים של משרד הבריאות של צ'כיה (17-31538A); פרויקט המחקר המוסדי של האקדמיה הצ למדעים (RVO 68378050) ו MEYS CR פרוייקטים (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, אופ RVO CZ. 1.05/2.1.00/19.0395, אופ RVO CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); אוניברסיטת צ'רלס (מלגה אישית לK.K.), ותוכנית מבצעית בפראג – פרויקט תחרותיות (CZ. 2.16/3.1.00/21547). אנו מכירים במתקן הליבה של מיקרוסקופ האור, IMG CAS, פראג, צ'כיה (תמיכה ב-MEYS CR LM2015062 ו-LO1419) לתמיכה בדימות המיקרוסקופיה המוצגת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
