Summary
ここで提示するプロトコルは、修飾コラゲ素灌流技術を用いた成体マウス肝臓からのマウス肝細胞の単離のためのプロトコルである。また、3Dコラーゲンサンドイッチ設定における肝細胞の長期培養と、胆道形成および治療に対する応答を研究するための細胞骨格成分の免疫標識についても説明する。
Abstract
肝細胞は、その代謝機能を担当する肝臓の中心的な細胞です。.このように、それらは、2つ以上の肝細胞が胆汁が分泌される胆管ネットワークを形成するために上皮膜を寄与するユニークな偏光上皮を形成する。肝細胞偏光は正しい運河形成に不可欠であり、肝細胞細胞骨格、細胞間接触、および細胞外マトリックスとの相互作用に依存する。カナリキュリ形成における肝細胞細胞骨格の関与とその病理学的状況への応答のインビトロ研究は、生体内のカナリクリネットワーク構造によく似た細胞培養の欠如によって障害を受ける。ここで説明するプロトコルは、修飾コラゲアゲ症灌流技術を用いて成体マウス肝臓からマウス肝細胞を単離するためのプロトコルである。また、胆道の形成とインビトロでの治療に対する応答を研究するために細胞骨格成分の免疫標識に使用される3Dコラーゲンサンドイッチ設定での培養の生産についても説明する。肝細胞3Dコラーゲンサンドイッチ培養は、毒素(エタノール)またはアクチン細胞骨格変化薬(例えば、ブレビスタチン)による治療に反応し、胆汁カナリクリの形成と機能のインビトロ研究のための貴重なツールとして機能することが示されています。
Introduction
肝細胞は、その代謝機能を担う肝臓の中央細胞構造であり、独特に偏光上皮細胞である。出生直後に哺乳類に出現する偏光は、胆道管ネットワークの形成をもたらし、適切な胆汁分泌に不可欠である。肝細胞のアピカル膜は胆汁カナリクリをまとめて形成するのに対し、基底膜はシヌソイドの内皮と接触したままである。肝細胞偏光の喪失は胆汁トランスポーターの再分配につながり、肝臓における胆汁保持に関連する病理学的プロセス(すなわち、胆汁うっ血症)をもたらす。
肝細胞偏光の確立と維持と胆胆カナリアクリの発達は複雑なメカニズムを伴う。基礎となるプロセスは、肝細胞細胞骨格間の集合的な相互作用、細胞間接触、および細胞外マトリックス1との相互作用に依存する。肝細胞細胞骨格は、3つのフィラメントネットワーク、アクチン細胞骨格、微小管、および中間フィラメントで構成され、運河形成の構造的支持を提供します。胆管ネットワークの再生および維持における細胞骨格成分の微分的役割は、3Dコラーゲンサンドイッチ肝細胞培養におけるインビトロ2において以前に例示されている。
アクチン微小フィラメントおよび微小管は、カナリクルス第2世代の部位における肝細胞膜偏光の初期段階において重要である。アクチン細胞骨格は、胆汁カナリクリの構造および機能を確立し、膜関連マイクロフィラメントおよび円周環を形成し、従って運河構造を支持し、アクチン細胞骨格をタイトで付着した接合部3に挿入する。アクチン細胞骨格外のケラチン中間フィラメントの環は、運河構造3をさらに安定化させる。
胆汁カナリクリアーキテクチャの組織における肝細胞接合複合体におけるタンパク質の重要性は、いくつかのノックアウトマウスモデルにおいて十分に文書化されており、接合タンパク質4、5、6の両方を欠くマウスにおいて歪んだカナリキュリを示す。付着部接合タンパク質α-カテニンの欠失は、肝細胞アクチン細胞骨格の崩壊、胆管内腔の膨張、漏れやすい接合、およびコレスタティック表現型4に効果的に導することが示されている。また、in vitro研究は、肝細胞アピカルルーメンおよびタンパク質密入7の改造においてE-カドヘリンおよびβカテニンを接着する接合成分の重要性を示している。
顕著に、主要なケラチンオーガナイザーである細胞骨格架橋タンパクチンのアブレーションは、アクチン細胞骨格8に関連するものに匹敵する表現型を明らかにした。これは、運河構造の支持におけるケラチン中間フィラメントの重要な役割を示唆している。3D肝細胞コラーゲンサンドイッチを利用したインビトロ研究では、胆道ネットワーク形成におけるAMP活性化プロテインキナーゼおよびその上流活性化剤LKB1の重要性も示されている。これらの知見は、その後の生体内研究10、11によってさらに確認された。従って、肝細胞偏光、適切な管ネットワーク形成、胆汁分泌の確立に関与するシグナル伝達過程の理解を深めるために、インビトロ研究が必要であることが明らかになりました。
胆道形成に関連するプロセスとインビトロの病理学的状況に対する応答を研究する際の大きな課題は、生体内12の状況によく似た細胞培養条件を使用することです。単離されたばかりの原発性肝細胞は偏光しない。したがって、それらは、2D培養条件下で機能性、形態、および機能的胆汁カナリクリ(例えば、遺伝子調節の変化、偏光、および脱分化13、14、15)を失う。この事実にもかかわらず、新鮮に単離された肝細胞は、生体内の肝臓の性質を最も密接に反映し、肝臓由来細胞株16とは異なり。過去に使用されてきたにもかかわらず、不死化細胞株は肝細胞の上皮様特徴的形態を発揮せず、これらの細胞によって形成される胆管管ルーメンは肝臓カナリクリに似ていない7.近年、原発性肝細胞の3D培養は、マウスとラットの両方から、インビトロ9における胆道ネットワーク形成に関与するプロセスを調べるのに有用なツールとなっている。コラーゲンの2層間で培養された原発性肝細胞(3Dコラーゲンサンドイッチ培養と称する)は、数日で再分極化することができる。3Dコラーゲンサンドイッチでマウス肝細胞を培養する際に必要な技術需要が高いため、胆道形成時の細胞骨格成分の関与を特徴付けるために、3Dコラーゲンサンドイッチに埋め込まれたマウス肝細胞を分離、育成、免疫標識する複雑なプロトコルを提示します。
Protocol
すべての動物実験は、欧州指令2010/63/EUに従って行われ、チェコ中央動物福祉委員会によって承認されました。
1. 材料
- 定期的なチョウや飲料水への無料アクセスを持つ実験動物科学協会連盟のガイドラインに従って、特定の病原体のない条件の下で動物を収容します。12時間/12時間の暗い/光サイクルの下で動物を収容する。肝細胞の単離と培養のために、8-12週齢の動物を使用してください。
- ストックソリューションAとB
- 表1及び表2に従って、ストック・ソリューションA及び原液Bを事前に準備しておきます。すべての成分を蒸留H2O(dH2O)の1Lに溶解する。
- 溶液のpHを7.2に調整し、0.2μmフィルタで溶液をフィルタリングします。両方のソリューションは、最大6ヶ月間4 °Cで保存できます。
- ストック ソリューション C
- 原発性肝細胞単離の日に溶液Cを調製する。
- 表3に従ってすべての成分を追加し、dH2 Oで50mLの総容積に充填し、溶解する。pHを7.3に調整します。
- 50 mLチューブ内の溶液のアリコート50 mL。動物ごとに1本のチューブを使用します。必要なすべてのアリコートを、事前に温めた水浴(37°)に入れます。
- ストック ソリューション D
- 原発性肝細胞単離の日に溶液Dを調製する。
- 表4に従ってすべての成分を追加し、dH2 Oで30mLの総容積に充填し、溶解する。pHを7.3に調整します。
- 50 mLチューブ内の溶液のアリコート30 mL。コラゲターゼI(5mg/30 mL)を溶液に加え、動物1匹につきアリコートを1つ使用します。すべてのアリコートを予温水バス(37°)に入れます。
- ストック ソリューション E
- 原発性肝細胞単離の日に溶液Eを調製する。
- 表5に従ってすべての成分を追加し、dH2 Oで50mLの総容積に充填し、溶解する。pHを7.3に調整します。
- 50 mLチューブ内の溶液のアリコート50 mL。アルブミンV(0.65 g/50 mL)を溶液Eに加え、動物1匹につきアリコートを1つ使用します。すべてのアリコートを予温水バス(37°)に入れます。
2. コラーゲンサンドイッチの調製
- 原発性肝細胞単離の1日前に、Iサンドイッチのコラーゲンの第1層を準備する。
注:氷に取り組み、事前に冷却された溶液、先端、プレート、チューブを使用して、コラーゲンIの不要なゲル化を最小限に抑えます。 - メーカーのプロトコルに従って、(ラットテールから)コラーゲンIの必要量を中和します。実験サンプル(3.5cm皿)あたり中和コラーゲン(1.5mg/mL)の100μLのボリュームが必要です。中和コラーゲン1mL(1.5mg/mL)を調製するには、10x DMEMの100 μL、1M NaOHの1.5μL、dH2 Oの48.5μLを500μLのコラーゲン(ストック濃度=3mg/mL)に加えます。リトマス紙で中和コラーゲンのpHを確認してください(pHは~7.5でなければなりません)。
- 氷上に設定された3.5cm皿の表面に予味した200°Lチップを使用して、中和コラーゲン溶液の100°Lを均等に分散させます。
- 標準培養条件下で一晩インキュベートする(37°Cで5%CO2のインキュベーター)。原発性肝細胞単離の日に、1mLの事前温め(37°)PBSを第1コラーゲン層に加える。コラーゲンを37°Cで2~3時間水分補給します。
3. 設備の設定
- 図1に示すように、材料表に示すようにすべての機器を準備し、設定します。
4. 外科的処置
- チレタミン(体重60mg/kg)、ゾラゼパム(60mg/kg)、キシラジン(4.5 mg/kg)の筋肉内注射によってマウスを麻酔する。数分後、つま先ピンチによる適切な麻酔を確認します。動物がピンチに反応しない場合は、4.2に進みます。
- 解剖マットの上に麻酔されたマウスを置き、下肢と上肢をテープで留め、マウスをすみずな位置に固定します。70%のエタノールで腹部をスワブし、陰部から前脚までのV字型切開で腹部を開きます。胸の上の皮膚を折りたたんで腹腔を明らかにします。解剖用マットを解剖顕微鏡の下に置きます。
- インスリン注射針(30G)を45°の角度に曲げます。腸と結腸をコード方向に動かすことによって、下大静脈(IVC)を露出させます。
- 2.5 mL の予め温めた (37 °) 溶液 C をカニューレで 2 mL 注射器に充填します。カニューレや注射器に気泡がないことを確認します。
- IVCの缶入り前に、肝臓葉を湿った(PBS)綿棒で横隔膜まで押し上げて位置を変更する。肝臓のすぐ下の IVC の周りにシルクの縫合糸を置きます (図 2A,B)。
- ヘパリン(5000 U/mL)の10μLを、45°の角度で曲げた30G針のインスリン注射器を使用して門脈に注入する(図2C)。
- 肝臓をカニューレするには、肝臓のすぐ隣にあるIVCにマイクロサージカルハサミで小さな切開を行います(縫合糸の下;図2D)カニューレを挿入するのに十分な大きさ。縫合糸と2つの外科結び目を使用して位置にカニューレを固定する(図2E)。
- 門脈を切り取り(図2F)、肝臓の膨張を防ぐために、灌流緩衝液が肝臓から流出することを可能にする。
- カニューレに接続された注射器をゆっくりと押して、1.5 mLの前温め溶液Cで肝臓を手動で熟動させる(これは〜15秒を取る必要があります)。肝臓の変色による肝臓からの血液の除去が観察されるようになりました。
- ペリスタリックポンプに予め温め(37°)溶液を事前に充填し、灌流装置を確認し、システムに気泡がないことを確認します。
- 慎重に注射器からカニューレを取り外し、2.5 mL/分の流量で実行されている蠕動ポンプのチューブに接続します。
- 肝臓を溶液Cで2分間(溶液Cの5 mL)でペルフューズする。溶液Dに変更し、さらに10分間(溶液Dの25 mL)の灌流を続けます。
- 肝臓が浸透したら、腹腔から取り出します。肝臓は非常に壊れやすく、色が薄くなります(図3)。
5. 原発性肝細胞の単離
- マウスから肝臓を取り除く。カニューレはまだ肝臓に結びついているので、鉗子を使って肝臓でカニューレを持ち上げ、すべての筋膜接続を慎重に遮断する。肝臓を20mLの予温溶液Eを含む50mLチューブに移す。
- 鉗子を使用して肝臓とカニューレを保持し、分離された肝細胞を緩衝液に移すためにチューブの壁の周りに肝臓をこすることによって組織の関連付けを解除します。隔離された細胞を氷の上に置いてください。
注:単離された一次肝細胞は、氷の上に保たれている間、数時間生存可能である。ユーザーは、必要に応じて、別のドナーマウスから一次肝細胞を分離する手順4.1~5.2を繰り返すか、次のステップに進むことができます。 - 50 mLチューブの上に70μmのナイロンセルストレーナーを置き、単離されたセルを濾過します。
- 50 x gと 4 °C でチューブを 5 分間遠心分離します。死んだ細胞を除去し、生存細胞のパーセンテージを増やすために、DMEMの40%パーコールの20 mLでペレットを再中断します。
- 5分間50xgと4°Cでチューブを遠心分離し、死細胞を含む上清を吸引し、溶液Eの20 mLでペレットを再中断する。
- 5分間50xgおよび4°Cの遠心管は上清を吸引し、溶液Eの10 mLでペレットを再中断する。
- トリパンブルー染色を用いて、原発性肝細胞収率と生存率を確認します。ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用して細胞数をカウントし、細胞濃度を3.75 x 105生存細胞/mLに調整します。細胞を氷の上に置いておきなさい。
6. 3Dコラーゲンサンドイッチにおける原発性肝細胞の培養
- 肝細胞培養培地(HCM)を調製する。グルカゴンの15 μL(1mg/mL)、ヒドロコルチゾンの15°L(50mg/mL)、インスリン40μL(10mg/mL)を50mLの完全な培地(DMEM、高グルコース、10%FBS、1%ペニシリン・ストレプトマイシン)に加えます。
- 2mL(5 x 105細胞/mL)の生存可能な一次肝細胞を予めコーティングされた3.5cm皿に均等に分散させます。3時間37°Cで5%CO2で細胞をインキュベートする重要:インキュベーターに皿を入れる直前に、すべての方向に皿を傾けて細胞を均等に分配する。
- 中和コラーゲンI(100μL/3.5cm皿;すなわち、上記の[ステップ2.1])のすべての皿のための十分な容積を準備する。使用するまで氷の上に置いておきなさい。
- 3時間後、培地と未接続の細胞を慎重に取り除き、各3.5cm皿に中和コラーゲンIの100μLを加え、細胞上のコラーゲンサンドイッチの最上層を形成します。標準的な細胞培養条件下でコラーゲンサンドイッチをインキュベートする(37°Cで5%CO2)。1時間インキュベーションした後、HCMを2mL加えます。
- 培養24時間後、HCM培地を新鮮なものに変更する。
- 胆汁カナリクリの形成に応じて、3〜8日間の培養。毎日顕微鏡で培養物をチェックする(図4)。HCM を 2 日ごとに変更します。
7. 3Dコラーゲンサンドイッチにおける原発性肝細胞の免疫標識
- 肝細胞サンドイッチからメディアを取り出し、予め温めたPBSで慎重に洗浄します。1 mLの4%パラホルムアルデヒドを室温で30分間PBSに固定します。
- 固定後、サンドイッチ3xを2mLで10分間洗い、PBS+0.1%ツイーン20(PBS-T)を洗浄します。
- 0.1 M グリシンの 1 mL、0.2% TRIton X-100 の PBS で 1 時間 RT で 1 h. PBS-T で 10 分間洗浄 3x の細胞を透過します。
- 十分な抗体の浸透を確保するために、真空吸引に接続された10°Lローディングチップを使用してコラーゲンの最上層を穏やかに乱します。
- PBS-Tで5%BSAの1 mLのブロック(すなわち、ブロッキング溶液)を2時間インキュベートし、ブロッキング溶液中で希釈した一次抗体を37°Cで一晩インキュベートする。PBS-Tで3xを15分間洗浄します。
- 洗浄後、2次抗体を37°Cで5時間洗浄し、PBS-Tで15分間洗浄し、続いてH2Oを蒸留して1x洗浄する。
- 顕微鏡検査用のアンチフェード取り付けメディア(材料表参照)を搭載。
Representative Results
マウス原発性肝細胞を単離し、3Dコラーゲンサンドイッチに播種した。隣接する2つの細胞間の胆汁カナリクリは、播種後数時間以内に形成し始めた。細胞はクラスターを形成し、1日以内に胆汁カナリクリの約規則的なネットワークで自己組織化する(図4)。3~6日以内に、5~10個の細胞のクラスターが観察され、完全に偏光した肝細胞が運河ネットワークを形成します(図4)。
毒素(エタノール)または細胞骨格変化薬による3Dコラーゲンサンドイッチにおける原発マウス肝細胞の治療(例えば、 ブレビスタチン、オカダ酸)は、肝細胞細胞骨格、カナリキュリ幅、形状、およびケラチン8(肝細胞で最も豊富なケラチン)に対する抗体で免疫標識することによって示される胆汁カナリキュリの数、ファロジン(F-アクチンを可視化する)、および接合タンパク質ズンオクラクチャに対する抗体の変化をもたらした。図 5)。
エタノール処理はケラチン8の組織に軽度の効果しか持っていなかった;しかし、それは(F-アクチン染色から見た)拷問性と胆道幅の分布を増加させた(図5)。ZO-1染色のシグナル強度は、未処理の対照と比較してエタノール処理胆汁カナリクリにおいて減少し、エタノール処理後の接合部の損失を示唆した。ブレビスタチンとのアクトミオシン収縮の阻害は、胆汁カナリアクリの形状および数に有意に影響を及ぼした。通常の管路ネットワークは、未処理の肝細胞と比較して、薄い長いものではなく厚い丸い胆汁カナリクリの発生率が増加した無秩序な形の胆汁カナリクリに再編成された(管幅のヒストグラムに見られるように)。
さらに、オカダイン酸(OA)阻害ホスファターゼによる治療は、前に示したようにケラチンの物性に強い影響を与えた。OAはケラチンフィラメントの溶解度を変化させます。したがって、治療はケラチンメッシュワークの深遠な再編成をもたらし、大きな核骨の凝集体に崩壊した。F-アクチンおよびタイト接合タンパク質ZO-1はいずれも特定の構造に局在しておらず、組織化された胆汁カナリクリのほぼ完全な消失と肝細胞極性の完全な喪失を示唆した。残りの胆汁カナリクリは、運河幅ヒストグラムに見られるように、未処理のコントロールと比較して有意に狭められました(図5)。
肝細胞細胞骨格の変化の顕微鏡観察と治療に対する肝細胞生化学的反応を相関させるために、プロトコルはまた、3Dコラーゲンサンドイッチから上清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)(肝細胞損傷マーカーとして一般的に使用される2つの肝酵素)のレベルを測定した(図6)エタノール治療はALTとASTの両方のレベルを有意に上昇させ、重度の肝細胞損傷を示唆した。ブレビスタチン治療は、ALTとASTの両方のレベルのかなりの変化を引き起こさなかったオカダイン酸治療は、ALTのレベルの増加と軽度の生化学的変化を引き起こしたが、ASTのレベルの変化はなかった。従って、肝細胞上清からインビトロで測定された肝細胞損傷の生化学的マーカーは、免疫染色によって観察される細胞骨格変化と相関する。
図1:実験的なセットアップ。(A)マウスをサフィンの位置に固定し、手術前に解剖顕微鏡下に置く。必要なすべての外科用器具は皿の上に置かれる。(B)マウス肝灌流中の灌流スイートは、貯留槽と温緩衝液と浸透したマウスとを接続するシリコーンチューブを示す。(C) B の概略図表は、この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腹腔の開口部とIVCのカヌレーション。腹部は陰部から前肢へのV字型切開で開かれる。皮膚は胸の上に折り畳まれ、腹腔を露出させ、拡大する。IVCを露出させるために、腸および結腸は慎重に動かす。(A, B)IVCの缶入りに先立って、肝葉はPBS湿潤綿棒で横隔膜に上向きに押し付けることによって再配置されるべきである。その後、IVCは周囲の組織から慎重に分離され、シルク縫合糸は肝臓の近くにIVCの周りに置かれます。パネルBは、パネルAに示す腹腔の概略を表す。肝葉、腸、下大静脈(IVC、赤色)、縫合糸が示される。(C)ヘパリンは、インスリン注射器(45°角度で曲がった30G針)で門脈(PV、矢印)に注入される。(D) 肝臓をカニューレするために、IVCは肝臓のすぐ隣(縫合糸の下)に切開される。(E) カニューレを挿入し、2つの外科的結び目を結びることによって縫合糸で固定される。(F) ポータル静脈は、自由な緩衝液の流出を可能にするために完全に切断され、肝臓の膨張を防ぎます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:灌流前後の代表的な肝臓画像。(A, B)カニューリン酸肝臓を切除し、2.5 mL/分の流量で12分間浸透した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:原発マウス肝細胞の3Dコラーゲンサンドイッチ培養3D条件下で1、2、3日間培養したマウス原発性肝細胞の代表的な明視野画像。なお、高度に組織化された細胞のより大きなクラスターは、培養中3日後に形成される。ボックス化された領域には、約 3 倍の拡大画像が表示されます。矢印は胆汁カナリクリを示す。スケール バー = 100 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図5:免疫蛍光顕微鏡による毒性ストレスに対する形態学的応答の評価3Dコラーゲンサンドイッチで培養した原発マウス肝細胞を培養3日目に毒素(エタノール、ブレビスタチン、またはオカダ酸)で処理した。固定細胞を染色し、細胞骨格成分を可視化した:ケラチン8(緑)、F-アクチン(赤色)、及びソヌラ・オククルデンス-1(ZO-1、マゼンタ)を免疫蛍光により可視化した。毒性処理は可視化された細胞骨格成分の崩壊につながり、胆汁カナリクリの数を減らし、拷問を増加させた。カナル幅は、未処理および治療された肝細胞の両方で測定され、幅分布のヒストグラムとして描かれている。矢印は胆汁カナリクリを示す。スケール バー = 100 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図6:3D肝細胞コラーゲンサンドイッチの毒性傷害に対する反応の生化学的分析ALTおよびASTは、肝細胞損傷の十分に確立されたマーカーを、毒素(エタノール、ブレビスタチン、およびオカダ酸)で処理した3D肝細胞コラーゲンサンドイッチから上清で測定した。ALTおよびASTは、未処理の細胞と比較して治療された細胞において上昇した。データは算術平均±SEMとして報告されています。
| ストック ソリューション A (10x) | |
| 試薬 | 最終濃度(g/リットル) |
| 塩化 ナトリウム | 80 |
| Kcl | 4 |
| MgSO4・7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4・2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
表 1: ストック ソリューション A レシピ
| ストック ソリューション B (10x) | |
| 試薬 | 最終濃度(g/リットル) |
| 塩化 ナトリウム | 69 |
| Kcl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4・7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
表 2: ストック ソリューション B のレシピ
| ソリューション C | |
| 試薬 | |
| ストック ソリューション A (10x) | 5 mL |
| ナフコ3 | 0.1094グラム |
| EGTA | 0.0095グラム |
| dH2O | 50 mL まで |
表 3: ストック ソリューション C のレシピ
| ソリューション D | |
| 試薬 | |
| ストック ソリューション A (10x) | 3 mL |
| ナフコ3 | 0.065グラム |
| CaCl2 | 0.0125グラム |
| dH2O | 30 mL まで |
表 4: ストック ソリューション D のレシピ
| ソリューション E | |
| 試薬 | |
| ストックソリューションB(10x) | 5 mL |
| ナフコ3 | 0.1グラム |
| グルコース | 0.045グラム |
| dH2O | 50 mL まで |
表 5: ストック ソリューション E レシピ
Discussion
マウス原発性肝細胞培養物の使用は、肝細胞偏光、適切な運河構造形成、胆汁分泌の確立に関与するシグナル伝達プロセスをよりよく理解するために、in vitro研究において重要です。2D培養におけるマウス原発性肝細胞の単離および長期培養における課題は、単離細胞の分離効果と寿命を高め、それぞれにいくつかの利点を有するいくつかの技術的アプローチの発明を推進してきた。欠点。原発性肝細胞の2D培養は、短期間の肝生物学の限られた数の属性のみを模倣することが広く受け入れられている。したがって、コラーゲンサンドイッチ配置における3D培養は、2D条件を広く置き換え、特に肝臓生物学における細胞骨格の機能に着目した場合(例えば、胆汁輸送の有毒な薬物効果または空間的組織)である。
1980年代以降、様々な改変を伴うマウス肝細胞の単離のためのいくつかのプロトコルが記載されている。2段階コラゲラゲアゼ灌流アプローチは、多くの研究室で広く使用されるようになった。分離プロトコルに勾配遠心分離を加えると、死細胞19、20の除去が可能となり、生存細胞の数が大幅に増加する(ここでは、日常的に〜93%)。このステップは、細胞の取り扱い時間を延長し、細胞数21を減少させるが、このステップは、適切な胆管ネットワーク形成のための3Dコラーゲンサンドイッチ培養において必要と見なされる。さらに、灌流工程の間に迅速かつ正確に進むことがより重要であり、細胞の処理時間を短縮します。
細胞の生存率を高め、3Dで運河ネットワークを形成する能力を高める他の重要な要因は、新たに調製された溶液の使用と灌流中の気泡の回避です。したがって、溶液はマウス肝細胞単離の日に調製する必要があり、溶液を変更する際に蠕動ポンプとチューブをチェックする必要があります。プロトコルが密接に従う場合、原発性肝細胞の単離は、生存可能な細胞の高収率で成功する必要があります。
長期3D肝細胞培養におけるもう一つの重要な要因は、使用される原発性肝細胞の初期供給源である。肝細胞の最適なドナーとして機能する生後8~12週の動物を使用することが重要です。これらの肝細胞は形態をより頻繁に変化させ、脱分極し、運河ネットワークを形成しなくなったため、古い動物からの肝細胞の使用は長期培養では成功しなかった。また、比較的濃縮された溶液から形成された適切に中和されたコラーゲンゲル上の肝細胞のめっきは重要なステップである。ほとんどのプロトコルでは、約1mg/mLの濃度が使用されます。多くの最適化の後、1.5 mg/mLの濃度は長期肝細胞の培養に最適であり、形成された胆汁カナリアキュリと高度に組織化された肝細胞を提供する。
このわかりやすいプロトコルは、一次マウス肝細胞の長期培養を可能にします。代表的な結果は、胆汁カナリキュリ形成における細胞骨格成分の役割を研究する際に、3D培養した一次マウス肝細胞に対する広範な使用を実証する。
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品はチェコの補助金機関(18-02699S)によってサポートされました。チェコ共和国保健省補助金機関(17-31538A);チェコ科学アカデミー(RVO 68378050)およびMEYS CRプロジェクト(LQ1604 NPU II、 LTC17063、LM2015040、OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395、および OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775;チャールズ大学(英国に個人的な奨学金)、および運営プログラムプラハ競争力プロジェクト(CZ.2.16/3.1.00/21547)。我々は、光顕微鏡の中心施設、IMG CAS、プラハ、チェコ共和国(サポートされたMEYS CRプロジェクトLM2015062およびLO1419)が提示された顕微鏡画像によるサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
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