Summary
Burada sunulan değiştirilmiş bir kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak yetişkin fare karaciğerlerinden fare hepatositizolasyon için bir protokoldür. Ayrıca açıklanan bir 3D kollajen sandviç ayarında hepatosituzun kültürü yanı sıra safra kanaliküler oluşumu ve tedaviye yanıt çalışma için sitoskeletal bileşenlerin immünetiketleme.
Abstract
Hepatositler karaciğerin metabolik fonksiyonundan sorumlu merkezi hücreleridir. Bu nedenle, iki veya daha fazla hepatosit safra salgılanan bir safra kanaliküler ağ oluşturmak için apikal membranlar katkıda bulunduğu benzersiz polarize epitel oluştururlar. Hepatosit polarizasyonu doğru kanaliküler formasyon için gereklidir ve hepatosit sitoiskeleti, hücre-hücre kontamı ve hücre dışı matriks arasındaki etkileşimlere bağlıdır. Kanalikül oluşumunda hepatosit sitoiskeletinin tutulumu ve patolojik durumlara tepkisiin in vitro çalışmaları, in vivo'daki kanaliculi ağ yapısına çok benzeyen hücre kültürünün eksikliğinden engellidir. Burada tanımlanmış değiştirilmiş bir kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak yetişkin fare karaciğerinden fare hepatositizolasyon için bir protokoldür. Ayrıca açıklanan bir 3D kollajen sandviç ayarı kültür üretimi, safra kanaliküler oluşumu ve in vitro tedavilere yanıt çalışması için sitoskeletal bileşenlerin immünetiketleme için kullanılır. Hepatosit 3D kollajen sandviç kültürlerinin toksinler (etanol) veya aktin sitoiskelet değiştiren ilaçlarla (örneğin, blebbistatin) tedavilere yanıt verdiği ve safra kanalikül oluşumu ve fonksiyonunun in vitro çalışmaları için değerli bir araç olarak hizmet verdiği gösterilmiştir.
Introduction
Karaciğerin metabolik işlevlerinden sorumlu olan merkezi hücresel yapıları olan hepatositler, benzersiz polarize epitel hücreleridir. Doğumdan kısa bir süre sonra memelilerde görülen polarizasyonları, safra kanaliküler ağın oluşmasına neden olarak ortaya çıkar ve uygun safra salgıları için gereklidir. Hepatositlerin apikal membranları topluca safra canaliculi oluştururken, bazal membranlar sinüzoidlerin endotel ile temas halinde kalır. Hepatosit polarizasyonunun kaybı safra taşıyıcılarının yeniden dağıtılmasına yol açar ve karaciğerde safra retansiyonu ile bağlantılı patolojik süreçlerle sonuçlanır (yani kolestaz).
Hepatosit polarizasyonunun kurulması ve sürdürülmesi ve safra kanaliculi gelişimi karmaşık mekanizmalar gerektirir. Altta yatan süreçler hepatosit sitoiskeleti, hücre-hücre bağlantıları ve hücre dışı matriks1ile etkileşimler arasında kolektif etkileşime bağlıdır. Hepatosit sitoiskeleti, kanaliküler formasyon için yapısal destek sağlayan üç filament ağın, aktin sitoiskeleti, mikrotübüller ve ara filamentlerden oluşur. Safra kanaliküler ağların yenilenmesi ve bakımında sitoskeletal bileşenlerin diferansiyel rolü daha önce 3D kollajen-sandviç hepatosit kültürlerde in vitro gösterilmiştir2.
Kanaliculus nesil2bölgelerinde hepatosit membran polarizasyonunun ilk aşamalarında aktin mikrofilamentler ve mikrotübüller önemlidir. Aktin sitoiskeleti safra kanaliculi yapısını ve işlevini kurar, membran ilişkili mikrofilamentler ve çevre halkası oluşturur, böylece kanaliküler mimariyi destekler ve aktin sitoiskeletini sıkı ve yapışık kavşaklara ekler3. Aktin sitoiskeleti dışındaki keratin ara filamentlerin halkası, kanaliküler yapıyı daha da stabilize eder3.
Safra kanaliculi mimarisinin organizasyonunda hepatosit kavşak kompleksleri proteinlerin önemi iyi çeşitli knock-out fare modellerinde belgelenmiştir, hangi farelerde çarpık canaliculi göstermek hem sıkı ve / veya yapışık çnumaralı proteinler4,5,6. Yapışık kavşak proteinα-catenin deletion hepatosit aktin sitoskeleton düzensizlik yol gösterilmiştir, safra kanaliküler lümen ler dilatasyonu, sızıntılı sıkı kavşaklar, ve etkili bir kolestatik fenotip4. Ayrıca, in vitro çalışmalar hepatosellüler apikal lümen ve protein ticareti remodeling e-kadherin ve β-catenin yapışık kavşak bileşenleri nin önemini göstermiştir7.
Çarpıcı, sitoiskelet crosslinking protein plektin ablasyon, hangi büyük keratin organizatörü, bu aktin sitoskeleton 8bağlı olanlara karşılaştırılabilir fenotipleri ortaya koymuştur . Bu, keratin ara filamentlerinin kanaliküler yapının desteklenmesinde kritik bir rol üst üste olduğunu göstermektedir. 3D hepatosit kollajen sandviçkullanan in vitro çalışmalar da AMP-aktive protein kiaz ve safra kanaliküler ağ oluşumunda upstream aktivatör LKB1 önemini göstermiştir9. Bu bulgular daha sonra daha sonra in vivo çalışmalar tarafından doğrulandı10,11. Bu nedenle hepatosit polarizasyonunun kurulması, uygun kanaliküler ağ oluşumu ve safra salgılanması nda rol oynayan sinyalizasyon süreçlerinin anlaşılması için in vitro çalışmaların gerekli olduğu ortaya çıkmıştır.
Safra kanaliküler oluşumu ve in vitro patolojik durumlara yanıtı ile bağlantılı süreçlerin incelenmesinde önemli bir sorun yakından vivo12durumuna benzeyen bir hücre kültürü koşulları kullanıyor. Taze izole primer hepatositpolarize değildir; böylece, 2B kültür koşullarında işlevlerini, morfolojilerini ve fonksiyonel safra kanaliculilerini kaybederler (örneğin, gen regülasyonundaki değişiklikler, polarizasyon ve de-farklılaşma13,14,15). Bu gerçeğe rağmen, taze izole hepatositler en yakından in vivo karaciğer doğasını yansıtan, karaciğer kaynaklı hücre hatları aksine16. Geçmişte kullanılmış olsalar da, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları hepatositlerin epitel benzeri karakteristik morfolojisini uygulamaz ve bu hücrelerin oluşturduğu safra kanaliküler lümenler karaciğer kanaliculi ne kadar kötü 7' yebenzer. Son zamanlarda, birincil hepatosit 3D kültürler, hem fare ler hem de sıçanlar, in vitro9safra kanaliküler ağ oluşumu ile ilgili süreçleri araştırmak için yararlı bir araç haline gelmiştir. Primer hepatositkolajen iki tabaka arasında kültürlü (3D kollajen sandviç kültürü olarak anılacaktır) birkaç gün içinde repolarize olabilir. 3D kollajen sandviçlerde fare hepatositleri elde ederken gerekli olan yüksek teknik talepler nedeniyle, burada safra kanaliküler oluşumu sırasında sitoskelet alektif bileşenlerin tutulumunu karakterize etmek için 3D kollajen sandviçlere gömülü fare hepatositlerini izole etmek, yetiştirmek ve immünetiket fare hepatositleri bulmak için karmaşık bir protokol salıyoruz.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Avrupa Direktifi 2010/63/EU uyarınca yapılmıştır ve Çek Hayvan Refahı Merkez Komisyonu tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemeler
- Düzenli yemek ve içme suyuna ücretsiz erişim ile Laboratuvar Hayvan Bilim Dernekleri Federasyonu yönergelerine göre belirli patojen içermeyen koşullar altında Ev hayvanları. 12 h/12 h karanlık/ışık döngüsü altında ev hayvanları. Hepatosit izolasyonu ve kültürü için 8-12 haftalık hayvanları kullanın.
- A ve B stok çözümleri
- Stok çözeltisi A ve stok çözeltisi B'yi sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'yegöre önceden hazırlayın. Tüm bileşenleri distile H2O (dH2O) 1 L'de çözün.
- Çözeltilerin pH'ını 7,2'ye ayarlayın ve çözümleri 0,2 μm'lik bir filtre ile filtreleyin. Her iki çözelti de 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
- Stok çözeltisi C
- Birincil hepatosit izolasyon gününde C çözeltisini hazırlayın.
- Tablo 3'e göre tüm bileşenleri ekleyin, dH2O ile 50 mL toplam hacmi doldurun ve çözünür. pH'ı 7.3 olarak ayarlayın.
- Aliquot 50 mL tüplerde çözeltinin 50 mL'si. Hayvan başına bir tüp kullanın. Gerekli tüm aliquotları önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin.
- Stok çözeltisi D
- Birincil hepatosit izolasyon gününde D çözeltisini hazırlayın.
- Tablo 4'egöre tüm bileşenleri ekleyin, dH2O ile 30 mL toplam hacmi doldurun ve çözünür. pH'ı 7.3 olarak ayarlayın.
- Aliquot çözeltisinin 30 mL'si 50 mL tüplerde. Çözeltiiçine kollajenaz I (5 mg/30 mL) ekleyin D. Hayvan başına bir aliquot kullanın. Tüm aliquotları önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin.
- Stok çözümü E
- Birincil hepatosit izolasyon gününde Çözelti E'yi hazırlayın.
- Tablo 5'e göre tüm bileşenleri ekleyin, dH2O ile 50 mL toplam hacmi doldurun ve çözünün. pH'ı 7.3 olarak ayarlayın.
- Aliquot 50 mL tüplerde çözeltinin 50 mL'si. Çözeltiye albumin V (0.65 g/50 mL) ekleyin E. Hayvan başına bir aliquot kullanın. Tüm aliquotları önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin.
2. Kollajen sandviç hazırlanması
- Birincil hepatosit izolasyonundan bir gün önce, kollajen I sandviçinin ilk tabakasını hazırlayın.
NOT: Buzun üzerinde çalışın ve kollajen I'in istenmeyen jelasyonunu en aza indirmek için önceden soğutulmuş solüsyonlar, ipuçları, plakalar ve tüpler kullanın. - Üreticinin protokolüne göre gerekli miktarda kollajen I'yi (fare kuyruğundan) nötralize edin. Deneysel numune başına (3,5 cm çanak) 100 μL nötralize kollajen (1,5 mg/mL) hacim gereklidir. 1 mL nötralize kollajen (1.5 mg/mL) hazırlamak için 100 μL 10x DMEM, 1.5 μL 1M NaOH ve 48.5 μL dH2O 500 μL kollajen (stok konsantrasyonu = 3 mg/mL) ekleyin. Turnusol kağıdı ile nötralize kollajen pH kontrol edin (pH ~ 7.5 olmalıdır).
- 100 μL nötralize kollajen çözeltisini, önceden soğutulmuş 200 μL'lik bir ucu buz üzerinde 3,5 cm'lik bir kabın yüzeyine eşit olarak dağıtın.
- Standart kültür koşullarında bir gecede kuluçkaya yat (37 °C'de %5 CO2 ile kuvöz). Primer hepatosit izolasyongününde ilk kollajen tabakasına önceden ısıtılmış (37 °C) PBS 1 mL ekleyin. Kollajen 37 °C'de 2-3 saat rehydrate sağlar.
3. Ekipman kurulumu
- Malzemeler Tablosu'nda listelenen ve Şekil 1'degösterildiği gibi ayarlanan tüm ekipmanları hazırlayın.
4. Cerrahi işlem
- Kiremitamin (60 mg/kg vücut ağırlığı), zolazepam (60 mg/kg) ve ksilazin (4.5 mg/kg) intramüsküler enjeksiyonu ile fareyi anestezi altına alın. Birkaç dakika sonra, parmak tutam tarafından uygun anestezi onaylayın. Hayvan kıskacına yanıt vermezse, 4.2'ye doğru ilerleyin.
- Anestezili fareyi bir diseksiyon minyonu üzerine yerleştirin ve fareyi bir supine pozisyonda düzeltmek için alt ve üst ekstremiteleri bantlayın. % 70 etanol ile karın bezi ve ön bacaklara kasık bölgesinden V şeklinde bir kesi ile karın açın. Karın boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde cilt katlayın. Diseksiyon paspasını bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.
- Bir insülin şırınga iğnesini (30 G) 45° açıya bükün. Inferior vena kava maruz (IVC) kaudal yönde bağırsak ve kolon hareket ettirerek.
- 2,5 mL önceden ısıtılmış (37 °C) çözeltic çözeltisini 2 mL'lik bir şırınga yayla doldurun. Kanül veya şırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- IVC kanülasyonu önce, ıslak (PBS) pamuk lu bez ile diyafram kadar basarak karaciğer lobları yeniden konumlandırmak. IVC'nin etrafına karaciğerin hemen altına bir ipek sütür yerleştirin(Şekil 2A,B).
- 45° açıda 30 G iğne bükülmüş bir insülin şırıngası kullanarak portal vene 10 μL heparin (5000 U/mL) enjekte edin(Şekil 2C).
- Karaciğer kanüle için, doğrudan karaciğer yanında IVC mikrocerrahi makas ile küçük bir kesi yapmak (dikiş altında; Şekil 2D) kanül eklemek için yeterince büyük. Kanülleri dikiş ve iki cerrahi düğüm(Şekil 2E)kullanarak pozisyonda sabitle.
- Perfüzyon tamponlarının karaciğerin genişlemesini önlemek için karaciğerden dışarı akmasını sağlamak için portal damarı(Şekil 2F)kesin.
- Kanüle bağlı şırıngaya yavaşça basarak karaciğeri 1,5 mL önceden ısıtılmış çözelti C ile elle takın (bu ~ 15 s almalıdır). Karaciğerde renk değişikliği ile karaciğerden kan çıkarılması artık görülebilir.
- Peristaltik bir pompayı önceden ısıtılmış (37 °C) solüsyonuyla önceden doldurun C. Perfüzyon cihazını kontrol edin ve sistemde hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Kanunu şırıngadan dikkatlice çıkarın ve 2,5 mL/dk akış hızında çalışan peristaltik pompanın tüpüne bağlayın.
- Karaciğeri 2 dk (5 mL çözelti C) için C çözeltisi ile perfüzyonlayın. D çözeltisine değiştirin ve ek 10 dakika (25 mL çözelti D) için perfüzyona devam edin.
- Karaciğer perfüzyon sonra, karın boşluğundan çıkarın. Karaciğer şimdi çok kırılgan ve renk soluk olacak(Şekil 3).
5. Primer hepatositlerin izolasyonu
- Fareden karaciğeri çıkarın. Kanül hala karaciğerbağlı olacak, bu yüzden karaciğer ile kanül kaldırmak için forseps kullanın, ve dikkatle tüm fasya bağlantıları kesti. Karaciğeri 20 mL önceden ısıtılmış çözelti E içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Büşremakkullanarak karaciğer ile kanül tutun ve tampon içine izole hepatosit aktarmak için tüp duvar etrafında karaciğer sürtünme doku ayırmak. İzole edilmiş hücreleri buzda tut.
NOT: İzole primer hepatositler buzüzerinde tutulurken birkaç saat kullanılabilir. Kullanıcılar gerekirse başka bir donör fareden 4.1 ile 5.2 arasında yalıtım lı birincil hepatositleri yineleyebilir veya bir sonraki adıma geçebilir. - 50 mL'lik bir tüpün üzerine 70 m naylon hücreli süzgeç yerleştirin ve izole edilmiş hücreleri filtreleyin.
- Tüpü 5 0 x g ve 4 °C'de 5 dk. Aspire etmek için santrifüj edin. Ölü hücreleri ortadan kaldırmak ve canlı hücrelerin yüzdesini artırmak için, DMEM'de peletin 20 mL'lik ve %40 percol'un yeniden askıya alınması.
- Tüpü 5 0 x g ve 4 °C'de 5 dk. Ölü hücreler içeren süpernatantı aspire edin ve 20 mL çözeltisi E'de peleti yeniden askıya alın.
- 5 dk. 5 dk. Aspire ve çözelti E 10 mL pelet resuspend 50 x g ve 4 °C'de santrifüj tüpler.
- Trypan mavisi boyama kullanarak birincil hepatosit verimini ve canlılığını kontrol edin. Neubauer hücre sayma odasını kullanarak hücre numarasını sayın ve hücre konsantrasyonu 3.75 x 105 canlı hücre/mL olarak ayarlayın. Hücreleri buzda tut.
6. 3D kollajen sandviçlerde primer hepatosit ekimi
- Hepatosit kültür ortamı (HCM) hazırlayın. 15 μL glukagon (1 mg/mL), 15 μL hidrokortizon (50 mg/mL) ve 40 μL insülin (10 mg/mL) ila 50 mL tam orta (DMEM, yüksek glikoz, %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin) ekleyin.
- Önceden kaplanmış 3,5 cm'lik bir tabağa 2 mL (5 x 105 hücre/mL) uygun primer hepatositleri eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 3 7 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Nötralize kollajen I (100 μL/3.5 cm çanak; yani yukarıda açıklandığı gibi tüm yemekler için yeterli hacimde [adım 2.1]) hazırlayın. Kullanıma kadar buzda tutun.
- 3 saat sonra, dikkatle orta ve bekar hücreleri kaldırmak ve hücreler üzerinde kollajen sandviç üst tabakası nı oluşturmak için her 3,5 cm çanak nötralize kollajen I 100 μL ekleyin. Kollajen sandviçi standart hücre kültürü koşullarında (37 °C'de %5 CO2) 1 saat süreyle kuluçkaya yatırın. 1 saat kuluçkadan sonra 2 mL HCM'yi dikkatlice ekleyin.
- Kültürün 24 saat sonra, taze bir hCM orta değiştirin.
- Kültür 3-8 gün, safra canaliculi oluşumuna bağlı olarak. Kültürü her gün mikroskop altında kontrol edin (Şekil 4). HCM'yi her saniye değiştirin.
7. 3D kollajen sandviçlerde primer hepatositlerin immünetiketlemesi
- Ortamı hepatosit sandviçlerinden çıkarın, ardından önceden ısıtılmış PBS ile dikkatlice yıkayın. Sandviç kültürlerini PBS'de %4 paraformaldehit 1 mL oda sıcaklığında 30 dakika (RT) düzeltin.
- Fiksasyondan sonra sandviçleri 10 dk boyunca 3 x 2 mL PBS + %0.1 Ara 20 (PBS-T) yıkayın.
- 0,1 M glisin 1 mL, RT'de PBS'de %0.2 Triton X-100 ile permeabilize hücreler 1 saat. PBS-T'de 10 dk boyunca 3x yıkayın.
- Yeterli antikor penetrasyonu sağlamak için vakum aspirasyonuna bağlı 10 μL yükleme ucu kullanarak kollajenin üst tabakasını nazikçe bozun.
- PBS-T'de %5 BSA ile (yani bloklama çözeltisi) 2 saat boyunca 37 °C'de bloklama çözeltisinde seyreltilmiş primer antikorlarla inkübül. PBS-T'de 15 dk boyunca 3x yıkayın.
- Yıkandıktan sonra 37 °C'de 5 saat boyunca ikincil antikorla inkübasyon 15 dk pbs-t'de 3x yıkayın ve ardından damıtılmış H2O ile 1x yıkayın.
- Mikroskop için solma önleyici montaj ortamına (bkz. Malzeme Tablosu)monte edin.
Representative Results
Fare primer hepatositler izole edildi ve 3D kollajen sandviçler tohumlu. İki komşu hücre arasındaki safra canaliculi tohumlamadan sonra birkaç saat içinde oluşmaya başladı. Hücreler kümeler oluşturmuş ve 1 gün içinde yaklaşık düzenli bir safra kanaliculi ağında kendi kendini organize eder(Şekil 4). 3-6 gün içinde, 5-10 hücrekümeleri genellikle gözlendi, tam polarize hepatositler bir kanaliküler ağ oluşturan(Şekil 4).
3D kollajen sandviçlerde birincil fare hepatositlerinin toksin (etanol) veya sitoiskelet değiştiren ilaçlarla tedavisi (örn. blebbistatin, okadaic asit) hepatosit sitoiskeletdeğişiklikleri ile sonuçlandı, canaliculi genişliği, şekli, ve safra canaliculi sayısı keratin bir antikor ile immünetiketleme ile resimli 8 (hepatositen bol keratin), phalloidin (F-aktin görselleştirme), ve kavşak protein zonula oklüt-1 (ZO-1; Şekil 5).
Etanol tedavisi keratin organizasyonu üzerinde sadece hafif bir etkisi vardı 8; ancak tortuositliği (F-aktin boyamadan görüldüğü gibi) ve safra kanaliküler genişliklerinin dağılımını arttırmıştır(Şekil 5). ZO-1 boyama sinyal yoğunluğu etanol tedavi safra canaliculi tedavi edilmemiş kontroller ile karşılaştırıldığında azalmıştır, etanol tedavisi sonrası sıkı kavşak kaybı düşündürmektedir. Blebbistatin ile actomiyozin kontraktiliteinin inhibisyonu safra kanalilisinin şeklini ve sayısını önemli ölçüde etkilemiştir. Düzenli kanaliküler ağ yeniden düzenlendi, tedavi edilmemiş hepatositler ile karşılaştırıldığında, ince uzun olanlar yerine kalın yuvarlak safra canaliculi artan bir insidansı ile düzensiz şekilli safra canaliculi içine (kanaliküler genişliklerin histogramında görüldüğü gibi).
Ayrıca, okadaik asit ile tedavi (OA) fosfatses inhibe güçlü keratinlerin fiziksel özelliklerini etkiledi, daha önce gösterildiği gibi8,17. OA keratin filamentlerin çözünürlüğünü değiştirir; böylece, tedavi keratin meshwork derin yeniden yapılanma ile sonuçlandı, hangi büyük perinükleer agregalar içine çöktü. Hem F-aktin hem de sıkı kavşak proteini ZO-1 belirli yapılara lokalize değildi, organize safra kanaliculi neredeyse tam kaybolması ve hepatosit polarite tam kaybı düşündürmektedir. Kalan safra kanaliculi, canaliküler genişlik histogramında görüldüğü gibi tedavi edilmeyen kontrollere göre anlamlı olarak daraltıldı (Şekil 5).
Tedaviye hepatosellüler biyokimyasal yanıt ile hepatosit sitoiskelet değişiklikleri mikroskobik gözlemler ilişkilendirmek için, protokol de alanin aminotransferaz düzeyleri ölçülen (ALT) ve aspartat transaminaz (AST) (yaygın hepatosellüler yaralanma belirteçleri olarak kullanılan iki karaciğer enzimleri) 3D kollajen sandviç supernatant(Şekil 6)18. Etanol tedavisi hem ALT hem de AST düzeylerini önemli ölçüde yükselterek ciddi hepatosellüler yaralanmayı düşündürmektedir. Blebbistatin tedavisi okadaik asit tedavisine göre hem ALT hem de AST düzeylerinde önemli değişikliklere yol açmamıştır, bu da ALT düzeylerinde artış la hafif biyokimyasal değişiklikleri tetiklemiştir, ancak AST düzeylerinde herhangi bir değişiklik yoktur. Bu nedenle hepatosellüler yaralanmanın biyokimyasal belirteçleri hepatosit süpernatantından in vitro olarak ölçülen immünboyama ile gözlenen sitoskeletal değişikliklerle ilişkilidir.
Şekil 1: Deneysel kurulum. (A) Fare supine pozisyonunda sabitlenir, ameliyattan önce bir kesme mikroskobu altına yerleştirilir. Gerekli tüm cerrahi aletler bir tepsiye yerleştirilir. (B) Fare karaciğer perfüzyonu sırasında, rezervuarı sıcak tampon ve perfüzyonlu fare ile bağlayan silikon boruyu gösteren perfüzyon paketi. (C) B.'nin şematik gösterimi Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Karın boşluğunun açılması ve IVC'nin kanülasyonu. Karın, kasık bölgesinden ön bacaklara V şeklinde bir kesi ile açılır. Cilt ortaya çıkarmak ve karın boşluğu büyütmek için göğüs üzerinde katlanır. IVC ortaya çıkarmak için, bağırsak ve kolon dikkatle caudally taşınır. (A, B) IVC kanülasyonu önce, karaciğer lobları bir PBS ıslak pamuk bezi ile diyafram yukarı bastırarak yeniden konumlandırılmalıdır. IVC daha sonra dikkatle çevreleyen dokulardan ayrılır, ve bir ipek sütür karaciğer yakın IVC etrafında yerleştirilir. Panel B, A panelinde gösterilen karın boşluğuşemalarını temsil eder. Karaciğer lobları, bağırsak, inferior vena kava (IVC, kırmızı) ve dikişler endikedir. (C) Heparin portal vene (PV, ok) insülin şırınga (45° açıyla 30 G iğne bükülerek) enjekte edilir. (D) Karaciğer kanüle için, IVC doğrudan karaciğer yanında (dikiş altında) kesilir. (E) Kanül iki cerrahi düğüm bağlayarak dikişlerle yerleştirilir ve sabitlenir. (F) Portal ven tamamen serbest tampon çıkışı sağlamak için kesilir, karaciğer genişlemesini önlemek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Perfüzyon öncesi ve sonrası temsili karaciğer görüntüleri. (A, B) Kanüle karaciğer 2,5 mL/dk akış hızında 12 dakika boyunca rezeke edilip perfüzyon yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Birincil fare hepatosit3D kollajen sandviç kültürü. 3D koşullarda 1, 2 ve 3 gün boyunca kültüre fare birincil hepatositlerin temsili parlak alan görüntüleri. Kültürde 3 gün sonra yüksek organize olmuş daha büyük hücre kümelerinin oluştuğu unutulmamalıdır. Kutulu alanlar ~3x büyütülmüş görüntüler gösterir. Ok başları safra kanaliculi gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Toksik strese morfolojik yanıtın immünfloresan mikroskopi ile değerlendirilmesi. 3D kollajen sandviçlerde yetiştirilen birincil fare hepatositleri kültürün 3. Sabit hücreler sitosiskelet bileşenlerini görselleştirmek için lekelendi: keratin 8 (yeşil), F-aktin (kırmızı) ve zonula oklüdens-1 (ZO-1, macenta) immünoresans ile. Toksik tedavi görselleştirilmiş sitoskeletal bileşenlerin düzensizliğine yol açtı, ve sayısını azalttı ve safra canaliculi tortuosity arttı. Canaliküler genişlikler hem tedavi edilmeyen hem de tedavi edilen hepatositlerde ölçüldü ve genişlik dağılımının histogramları olarak gösterilmiştir. Ok başları safra kanaliculi gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 3D hepatosit kollajen sandviçlerin in vitro toksik yaralanmaya yanıtı biyokimyasal analizi. Hepatosellüler yaralanmanın köklü belirteçleri olan ALT ve AST, toksinlerle (etanol, blebbistatin ve okadaik asit) tedavi edilen 3D hepatosit kollajen sandviçlerden süpernatant olarak ölçüldü. ALT ve AST tedavi edilmeyen hücrelerde tedavi edilmeyen hücrelere göre yükselmiş. Veriler aritmetik olarak bildirilir ± SEM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
| Stok Çözümü A (10x) | |
| Reaktif | Son konsantrasyon (g/litre) |
| Nacl | 80 |
| Kartal | 4 |
| MgSO4·7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4·2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
Tablo 1: Stok çözüm A tarifi.
| Stok Çözeltisi B (10x) | |
| Reaktif | Son konsantrasyon (g/litre) |
| Nacl | 69 |
| Kartal | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4·7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
Tablo 2: Stok çözeltisi B tarifi.
| Çözelti C | |
| Reaktif | |
| Stok Çözümü A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0.1094 g |
| EGTA | 0,0095 g |
| dH2O | 50 mL'ye kadar |
Tablo 3: Stok çözeltisi C tarifi.
| Çözelti D | |
| Reaktif | |
| Stok çözeltisi A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0,065 g |
| CaCl2 | 0,0125 g |
| dH2O | 30 mL'ye kadar |
Tablo 4: Stok çözeltisi D tarifi.
| Çözüm E | |
| Reaktif | |
| Stok çözeltisi B (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0,1 g |
| Glikoz | 0,045 g |
| dH2O | 50 mL'ye kadar |
Tablo 5: Stok çözeltisi E tarifi.
Discussion
Hepatosit polarizasyonun kurulması, uygun kanaliküler yapı oluşumu ve safra salgılanmasında rol oynayan sinyalizasyon süreçlerini daha iyi anlamak için fare primer hepatosit kültürlerin kullanımı in vitro çalışmalar için önemlidir. 2D kültüründe fare birincil hepatositlerin izolasyon ve uzun vadeli kültür zorlukları, her biri çeşitli avantajları ile izole hücrelerin artan izolasyon etkisi ve uzun ömürlü çeşitli teknik yaklaşımlar icadı tahrik ve Dezavantaj -ları. Primer hepatositlerin 2D kültürlerinin kısa bir süre için karaciğer biyolojisinin sadece sınırlı sayıdaki özelliklerini taklit ettiği artık yaygın olarak kabul edilmektedir. Böylece, bir kollajen sandviç düzenleme 3D ekimi yaygın 2D koşulları yerine, özellikle karaciğer biyolojisi sitoskeleton fonksiyonu odaklanmış (örneğin, toksik ilaç etkileri veya safra taşıma mekansal organizasyon).
1980'lerden bu yana, fare hepatositlerinin çeşitli modifikasyonlarla izole edilmesi için çeşitli protokoller tanımlanmıştır. İki aşamalı kollajenaz perfüzyon yaklaşımı birçok laboratuvarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yalıtım protokolüne gradyan santrifüj eklenmesi ölü hücrelerin19,20'nin çıkarılmasını sağlar ve canlı hücre sayısını önemli ölçüde artırır (burada, rutin olarak ~%93'e). Bu adım hücrelerin kullanım süresini uzatsa ve azaltılmış hücre sayıları21ile sonuçlansa da, bu adım uygun safra kanaliküler ağ oluşumu için 3D kollajen sandviç kültüründe gerekli olarak görülüyor. Ayrıca, perfüzyon adımları sırasında hızlı ve doğru bir şekilde ilerlemek daha önemlidir, bu da hücrelerin işlenme süresini kısaltır.
Hücrelerin canlılığını ve 3Boyutlu olarak kanaliküler ağları oluşturma yeteneklerini artıran diğer önemli faktörler, taze hazırlanmış çözümlerin kullanımı ve perfüzyon sırasında kabarcıklardan kaçınmaktır. Bu nedenle fare hepatosit izolasyon gününde çözeltiler hazırlanmalı ve çözelti değiştirirken peristaltik pompa ve tüp kontrol edilmelidir. Protokol yakından takip edilirse, birincil hepatositlerin izolasyonu canlı hücrelerin yüksek verimile başarılı olmalıdır.
Uzun süreli 3D hepatosit kültüründe bir diğer kritik faktör de kullanılan primer hepatositlerin ilk kaynağıdır. Bu hepatosit optimal donör olarak hizmet 8-12 haftalık olan hayvanların kullanılması önemlidir. Yaşlı hayvanlardan hepatosit kullanımı uzun süreli kültürde başarılı değildi, çünkü bu hepatositler morfolojilerini daha sık değiştirip depolarize ettiler ve kanaliküler ağlar oluşturmaya son verebildiler. Ayrıca, nispeten yüksek konsantre çözelti oluşan düzgün nötralize kollajen jel üzerinde kaplama hepatositler hayati bir adımdır. Çoğu protokolde yaklaşık 1 mg/mL konsantrasyonlar kullanılır. Birçok optimizasyondan sonra, 1.5 mg/mL konsantrasyonu uzun süreli hepatosit yetiştiriciliği için en uygun konsantrasyondur ve oluşan safra canaliculi ile son derece organize hepatosit sağlar.
Bu kolay takip protokolü birincil fare hepatositlerinin uzun süreli ekimine olanak sağlar. Temsili sonuçlar safra kanaliculi oluşumunda sitoskeletal bileşenlerin rolünü incelerken 3D kültürlü birincil fare hepatositleri için geniş bir kullanım spektrumu göstermektedir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çek Cumhuriyeti Hibe Ajansı (18-02699S) tarafından desteklenmiştir; Çek Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı Hibe Ajansı (17-31538A); Çek Bilimler Akademisi Kurumsal Araştırma Projesi (RVO 68378050) ve MEYS CR projeleri (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 ve OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0.0/16_013/0001775); Charles Üniversitesi (K.K.'ye kişisel ödenek) ve Prag-Rekabet-Rekabet Programı projesi (CZ.2.16/3.1.00/21547). Sunulan mikroskopi görüntüleme desteği için Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi, IMG CAS, Prag, Çek Cumhuriyeti (desteklenen MEYS CR projeleri LM2015062 ve LO1419) kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
