Summary
在这里，我们演示如何对小鼠排毛体肌肉的毛细管后静脉进行体内显微镜检查。通常适用于不同炎症和败血症的模型，特别是那些由化学因子和细胞因子引起的，我们强调其在研究肌肉白细胞渗透的肌肉病的相关性。
Abstract
体内显微镜（IVM）广泛用于监测体内白细胞招募级联内的生理和病理生理过程。目前的协议是一种实用且可重复的方法，用于可视化白细胞内皮相互作用，导致白细胞在小鼠完整有机体内的骨骼肌衍生组织中招募白细胞。该模型适用于所有研究领域，重点是颗粒细胞活化及其在疾病中的作用。
我们提供分步协议，以指导该方法，并突出潜在的陷阱和技术困难。该协议涵盖以下几个方面：实验设置和所需材料、小鼠麻醉、排骨肌解剖以及气管和胡萝卜罐、IVM 记录和离线分析。详细解释了粘附白细胞、滚动通量 （RF） 和滚动通量分数 （RFF） 等数据格式，并讨论了适当的应用。结果部分提供了肌营养不良mdx小鼠的代表性结果。
IVM是评估体内白细胞招募的有力工具;然而，例如内皮和白细胞功能，如果内皮和白细胞功能，可能需要与外活体设置（如流室实验）组合。此外，感兴趣的动物的遗传背景可能极大地影响基线的招募，需要个人对所提供的协议进行微调。尽管它有局限性，IVM可以作为一个平台，很容易将体外发现转化为活脊椎动物的有机体。
Introduction
宫内显微镜（IVM）是白细胞生物学领域常用的工具。白细胞招募遵循了由白细胞捕获、滚动和粘附到内皮壁引起的一系列明确事件，最后将白细胞迁移和外移到炎症1的实际部位。每个步骤由各种化学素（如IL-8/CXCL8）、受体（例如LFA-1、Mac-1）和相应的内皮细胞粘附分子（例如ICAM-1、VCAM-1和E-Selectin）进行调节2,和控制。,使用IVM,944、5、6、7、8、95,6,7发现不同调控部位、控制因子和调剂的相互作用，如高级甘化端产物受体（RAGE）、细胞间粘附分子1（ICAM-1）、C-X-C图案配体（CXCL）1/2及其受体CXCR2。8
IVM的方法被描述为许多不同的器官和组织，如肠道10，皮肤11，淋巴结12，胚胎蛋黄袋13等。然而，IVM研究最广泛的方法是在大鼠14中首次描述的克里马斯特模型。虽然这种方法仍然用于大鼠15，但由于不同转基因系的丰度高，目前主要应用于小鼠。我们的团队最近强调了排泄物IVM在炎症性肌肉病领域的潜在作用，如杜琴肌肉萎缩症（DMD），研究肌营养不良的mdx小鼠16。由于其薄交织和易于访问的纤维组成，排泄肌代表理想的候选肌肉，用于使用光或荧光显微镜作为整个坐骑进行研究。白细胞的招募和外征主要发生在毛细管后静脉，这可以很容易地识别在连续肌肉层在排骨肌肉。
与其他体外检测相比，体内成像的优点是其生物环境在活的有机体中。同时，对改变的白细胞招募进行细胞特异性贡献可能需要额外的体外模型，如流室或内皮测定。多种方法的组合将产生最令人信服的数据。科学家应该意识到排泄剂模型的局限性，因为任何手术操作都会导致白细胞贩运和招募的增加。因此，很难用这种方法估计基线征聘。尽管它有着广泛的应用，但 cremaster 的 IVM 可能具有挑战性，而一个新设置可能需要时间和资源才能建立。现在，我们提供了一个简单的协议，这将有助于避免IVM中的一些常见错误。此外，还将讨论限制，并在适用时突出显示免费方法。
排泄物的IVM是炎症和传染性研究领域实施的理想方法。更具体地说，在炎症性疾病的背景下，研究骨骼肌生物学的科学家可能对此非常感兴趣。
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Protocol
在海德堡的IBF（国际生物梅迪辛里切福辛里希通），动物在受控和特定的无病原体条件下饲养。这里描述的所有程序都得到当地IRB和德国巴登-符腾堡市卡尔斯鲁厄市的批准。
1. 麻醉管理
- 通过腹内注射125毫克/千克氯胺酮和12.5毫克/千克木拉辛对小鼠进行麻醉。
- 将鼠标放在加热垫上的背部固定位置，以保持鼠标的体温 （36.5-38 °C）。使用不可吸收的无菌缝合线 （6/0） 在前牙周围绕一个简单的回路，并将缝合线的连接端胶带到加热垫上。这种固定的目的是保持嘴张，以避免在呼吸干扰。
- 通过数字间脚趾捏合检查鼠标的麻醉深度是否适当（不应看到回退）。
- 一旦达到足够的麻醉，继续手术准备。每30分钟反复确认一次正在进行的实验麻醉，如果需要，请按上述方式重新服药。
- 平衡生理盐溶液（PSS，成分：132 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgS0 4，2.0 mmol/L CaCl2，18 mmol/L NaHCO3），5%CO2/95% N2，15分钟。4在整个实验过程中，持续用5%CO2/95% N2对PSS进行气泡，并保持在37°C。
2. 气管和胡萝卜动脉的外科准备（可选）
- 通过在中线用钳子轻轻拉扯皮肤，从颈部区域分离皮肤。使用剪刀应用直径为 1-2 厘米的圆形切口，为手术准备提供足够的空间。
- 使用钳子仔细解剖周围的肌肉、脂肪和结缔组织。
- 使用小型手术剪刀将横向切割（± 1.3 mm）放入气管，并在气管的caudal端引入聚乙烯管（I.D x O.D.0.034" x 0.050"），以固定上气道。
- 用单个圆形结缝合线（6/0 USP）固定位于气管中的管。
- 沿着气管右侧找到胡萝卜动脉，并从胡萝卜动脉壁解剖周围的组织。或者，壶状或尾静脉可用于 i.v. 访问。尽量避免对血管神经造成伤害，因为它位于紧要处。
- 通过两块缝合线 （6/0） 下胡萝卜动脉。放置第一个颅骨缝合线，靠近胡萝卜动脉的分叉，并永久地系上它。第二个缝合线将位于约5-8毫米远从第一个，后来用于固定管在胡萝卜动脉。不要绑它。
- 通过将端部弯曲到充满盐水（0.9% NaCl）的 1 mL 注射器针，制备长度为 30 厘米的聚乙烯管（I.D x O.D.0.011" x 0.024"），从而制备聚乙烯管。严格冲洗对于防止在制备过程中空气栓塞非常重要。
- 使用 7 mm 容器夹夹夹第二个缝合的胡萝卜动脉。
- 在胡萝卜动脉中执行一个小的横向切割（±0.5 mm），并引入无菌聚乙烯管。使用之前准备的第二个缝合线将管固定在动脉中。
- 拆下容器夹，轻轻对连接到聚乙烯管的注射器施加一点张力。这种胡萝卜导管现在可用于管理药物或在需要时采集血液样本，即使通过相关设备监测血压或脉搏率也是可能的。
3. 排泄物肌肉的外科准备
- 将加热垫上的鼠标（连同加热垫）转移到手持舞台的定制塑料框架，以便以后进行显微镜检查。将鼠标的阴囊面向显微镜阶段。
- 在继续之前重新评估麻醉的深度;如果需要，重新施用四分之一至半剂量的麻醉剂。
- 将阴囊本地化，使用钳子将其放在最远端处，轻轻拉起阴囊皮肤的圆形部分，直径约为 5 mm。确保不要伤害基础结构，如排泄物肌肉。确保用盐水溶液使开放式组织充分滋润。
- 使用两个钳子分解松散的结缔组织，并本地化两个睾试验。
- 按住一个睾酮，轻轻地开始拉出它，一步一步地去除周围的结缔组织。
- 一旦睾口被外部化，将其远端固定到舞台周围的橡胶环上。外部化后，在整个过程中用盐水溶液滋润组织。
- 关键步骤：小心地去除结缔组织，而不会损害底层的肌肉。过多的结缔组织可能会阻碍以后显微镜中的视力，并可能产生模糊的图像。
- 将睾酮的远端固定下来，然后通过一个小的横向切口（约 1 mm）打开排泄器肌肉，然后从非常远端到近端纵向切口。因此，排泄物的肌肉应该以球形打开。宏观可见的容器不应被切断，因为这可能会影响力学。
- 小心地将肌肉铺在玻璃舞台上，并将其固定到橡胶圈上。确保不要触摸或伤害中心区域，因为显微镜将在这里进行。
注意：过度拉伸可能会阻碍血流。 - 将剩余的睾脚放在一边，以便访问感兴趣的区域。确保反复使用 PSS 滋润，以防止干燥。安装的肌肉现在已准备好进行显微镜检查。
4. 宫内显微镜
- 将安装的排长肌置于直立显微镜中，并使用 40x 目标进行显微镜检查。
- 使用高通量成像光谱采集数据并导出。
- 使用预热 （35-37 °C） PSS17在连续超灌下执行录制。通过一个被贴在显微镜直立目标上的小管子进行超级灌注，使PSS在目标旁边连续滴到肌肉组织上。
- 识别毛细管后静脉（两个较小容器的汇合），并测量直径为 20-40 μm 的静脉间微循环。
- 记录从火葬肌肉的微循环的高分辨率图像在30s的时间范围内。由于在录制期间肌肉组织可能有轻微的收缩和放松，请确保持续调整焦点。一般来说，鼠标往往表现出稳定的循环约2小时。有可能从不同地区获取不同船只的几种记录。一个或两个睾酮可以随后使用。
注：由于这是炎症的模型，诱导的常见方式是：系统应用或局部阴囊注射亲炎症调子，以及超级灌注与例如N-福基乙酰-苯丙氨酸（fMLP）。局部TNF-β刺激通常用于触发白细胞招募;LPS诱发的内膜血症是SIRS严重全身炎症的一个模型。
5. 白细胞可视化
注： 粘附和滚动白细胞可以很容易地看到没有进一步的可视化。要确定自由移动白细胞的中心线速度，执行差分染色。
- 如果使用 eGFP 标记小鼠，请直接通过荧光显微镜分析它们。
- 对于非 eGFP 标记的小鼠菌株，请使用红胺染色。
- 在 0.2 mg/kg 体重下施用红胺 6G。可能需要重复剂量才能达到足够的染色强度。确保保留小卷，因为较大的卷可能会影响血液动力学参数。
- 对于白细胞的即时染色，通过胡萝卜动脉管理污渍。如果胡萝卜动脉解剖尚未进行，使用相同剂量18的i.p.应用可以达到足够的染色。作为胡萝卜动脉导管的替代方案，可以执行任何其他静脉导管。
注：请记住，与 eGFP 标签不同，红胺染色显示荧光强度的时间衰减，以及浓度较高的白细胞总染色最大值约为 80%。 - 通过荧光显微镜想象自由移动的红胺染色白细胞。
6. 实验结束
注： 执行此协议的总估计时间应为 90 - 150 分钟。
- 通过宫颈错位结束安乐死实验。
- 对于进一步的分析，如迁移，修复PFA的排泄体肌肉，同时仍然伸展在舞台上，并染色组织学根据需要。
7. 离线分析
- 在视频播放期间，将以下参数分析为简单计数。
- 计算滚动通量 [数量/分钟]：通过虚线/分钟滚动单元数
- 计算附着力 [数量/mm2]：在视场内粘附到血管壁上的细胞数 = 30 s/血管表面 [mm2]。
- 使用 ImageJ 测量以下血液动力学和微血管参数。
- 将容器直径 [μm] 计算为内壁直径。
- 将容器长度 [μm] 计算为容器的中心线长。
- 计算从中心线
中自由移动白细胞的帧到帧视频分析中获得的中心线速度。
- 使用以下方程作为估计值。
- 计算 [mm2] 中的血管表面：血管长度 [μm] x 容器直径 [μm] x x x 10-6。
- 计算壁剪切速率
：4.9 x （8 x中心线速度 x 0.625/容器直径 [μm]）。 - 计算平均血流速度：中心线速度x 0.625。
- 计算白
细胞总通量：系统性白细胞计数
x （平均血流速度x 60/1000） x 
× x . - 计算滚动通量分数 [%]：滚动通量/总白细胞通量 x 100。
中自由移动白细胞的帧到帧视频分析中获得的中心线速度。
：4.9 x （8 x
细胞总通量：系统性白细胞计数
x （平均血流速度
× x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
根据所提供的协议，IVM将产生独特的见解，在骨骼肌中白细胞招募的级联。结果部分将侧重于 IVM 获得的典型结果，并重点介绍可能遇到的潜在问题。
在图1中概述了生命内显微镜的实验设置。准备肌肉和去除结缔组织对于获得具有均匀表面的聚焦显微图像至关重要。执行IVM时，多余的结缔组织最终导致模糊的显微图像（补充视频1）。图 2显示了可以使用 IVM 获得的具有代表性的微观图像。首先，毛细管后静脉，直径应在20-40μm之间，通过两个较小的容器的汇合物进行识别。只有粘附和滚动白细胞才能可视化，循环白细胞只能在录制的视频的慢动作重播中跟踪。粘附白细胞的数量被定义为固定白细胞，在30秒内，每毫米2的血管表面表示（图2）。计算通过先前定义的横截面的滚动白细胞的数量;滚动速度可以在离线分析中获得。滚动可以表示为滚动通量（RF = 预定义线路/分钟的滚动单元数）或滚动通量分数（RFF 以 % = RF/总白细胞通量通过容器）。射频高度依赖于循环细胞的数量，而RFF受白细胞计数（WBC）变化的影响较小。请注意，在许多情况下，白细胞依从性和滚动是相反的;大量粘附白细胞可以减少自由循环细胞池，从而抑制白细胞滚动。
技术挑战和潜在陷阱
排长肌肉包裹睾土，并组装球形结构。要将肌肉安装到录制阶段，需要纵向切口才能打开球体。这可能会影响整体微血管，因为小容器可能会被切断。为了避免对改变的血流有偏见，建议选择重新排序的中心区域。这一区域既不应被触摸，也不应纵。此外，微烧可以预防出血和微血管血动力学的变化。如果由于感兴趣领域的制剂而影响血液循环，周围毛细血管的血流通常会提供有价值的提示。一般来说，更多的近端血管（向老鼠的身体倾斜）往往表现出更好的微循环，但是图像捕捉可能因动物呼吸引起的运动和干扰增加而变得复杂。
为了防止排泄物在显微记录期间使肌肉干燥，组织永久超融合是突出的。保湿不足或中断将导致组织干燥和实验失败。
固定的裂缝组织是必要的，以保持它拉伸和到位。要平展体状的肌肉，需要柔和的拉伸。拉伸太少会导致组织不均匀，使显微镜复杂化，过度拉伸会限制血液流动并损害组织。毛细血管血流再次为组织的整体循环状况提供了可靠的状态。需要经验和实践来确定安装组织时的拉伸程度。
长时间的准备会影响生物体的整体炎症状态和偏置数据。因此，在设计实验时，一定要关注感兴趣的问题，并根据需要缩短准备时间。如果没有药物管理，监测或血液测试是必需的，单次制备的排泄物组织可能就足够了。
在大多数环境中，不同的实验组将被比作野生类动物。确保血液动力学和微血管参数在实验组之间相似至关重要（表1）。多种参数可能会影响白细胞在体内的招募，包括心脏输出、血管直径、中心线速度、壁剪切率和循环白细胞的数量。表 1显示了两条不同转基因小鼠线的数据，即营养不良的 mdx 小鼠和 lys-eGFP 小鼠（在嗜中性粒细胞和巨噬细胞中的 lys 促进剂下表达 eGFP）。而血管直径等参数可以由研究者控制，中心线速度和剪切速率取决于单个实验组或小鼠应变的力学。显然，mdx 和 lys-eGFP 小鼠之间的中心线速度和壁剪切速率明显不同（表 1），使得对 IVM 数据进行有意义的比较是不可能的（通过 t 检验进行与韦尔奇校正进行统计分析，显著性设置为 P < 0.05）。中心线速度受心脏输出、周围血管阻力和血管内体积的影响。例如，大量的红胺或任何其他实验物质通过胡萝卜素导管增加后毛细管中心线速度，并抑制白细胞捕获和滚动（补充视频2）。相反，心脏衰竭、深度麻醉或体温过低可能会减少毛细管后流动。在接近IVM数据的离线分析之前，应定义数据质量要求（例如生理范围内的血液动力学参数），以便得出有意义的结论并减少偏差。
要确定中心线速度，需要可视化自由循环白细胞。要么，荧光白细胞（如在lys-eGFP小鼠）可以使用或白细胞必须染色荧光试剂，如罗达明（图3）。罗达明可以通过胡萝卜开管或作为注射剂施用。由于红胺也逐渐被其他细胞类型所占用，剂量和时间的滴定是必不可少的。过量的量量和长时间的间隔将在显微镜期间产生显著的背景。
最后，我们喜欢指出不同小鼠菌株的生物多样性。除了基因改变的菌株外，也普遍接受的野生型菌株可能表现出生理差异。图 4将常用的黑色 6 （C57BL/6） 与黑色 10 （C57BL/10ScSn） 小鼠进行比较。黑6小鼠明显显示白细胞的滚动、粘附和迁移与黑色10小鼠相比增强（通过Tukey的后临时测试进行单向ANOVA的统计分析;显著性设定在P< 0.05），尽管两种菌株都称为野生类型。因此，应考虑正确的遗传背景，特别是在利用转基因小鼠时。在我们的实验环境中，比较黑色6小鼠和转基因mdx小鼠（黑色10背景）将在很大程度上掩盖肌营养不良mdx小鼠在正确的黑色10野生类型背景（图4）上增强的炎症状态。
图1：在肌肉上IVM的原理图实验设置。麻醉后，气管被气管切开，导管被放置在胡萝卜动脉中。使用光学显微镜或荧光显微镜，在直立显微镜上暴露和准备进行宫内显微镜检查。获取视频以进行后续脱机分析。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：具有顺序框架的体内显微镜中代表的后毛细管片段。左列显示光显微图像，为了更好地可视化容器用虚线勾勒出。锥形由汇合容器（用红色星号标记）和直径为 <40 μm 的容器识别。右列描绘相应左图的示意图表示形式，以红色显示白细胞。前四行显示同一容器随时间顺序显示的图像。底部行表示粘附白细胞。在原理图表示中，标记了单个白细胞及其滚动距离。在离线分析中，每平方毫米的依从性，可以计算滚动通量和滚动速度。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：滚动白细胞可以通过荧光标记的转基因表达或使用红胺的二次染色来可视化。代数显微图像的白细胞招募 eGFP 白细胞和红胺标签白细胞从 n = 3 动物每个。通过免疫荧光显微镜（左列），可以直接检测出在裂变-eGFP转基因小鼠的裂变剂促进剂下表达eGFP的滚动中性粒细胞。没有荧光剂的白细胞可能通过静脉注射或腹内注射红胺（右柱）染色。值得注意的是，红胺并非只被嗜中性粒细胞所占用，因此背景明显更多。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：不同转基因和野生小鼠菌株白细胞招募的比较。（A） 滚动通量分数（B） 粘附和 （C） 白细胞的迁移在黑色 6 （C57BL/6J）， 黑色 10 （C57BL/10ScSnJ） 和 mdx 小鼠 （C57BL/10ScSnnnj） 之间比较， 显示平均 = SEM. 黑色 6 小鼠显示增强的白细胞招募与黑色 10 小鼠相比.mdx同样，与黑色10相比，mdx小鼠的招募程度更高，但与黑色6种野生小鼠相比则没有。这些数据证明了分配正确的基因控制的重要性。来自每组至少 n = 3 个动物的数据。单向ANOVA与图基的事后分析进行统计分析。显著性设置为 P < 0.05。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 鼠标应变 | 不。小鼠 | 不。的静脉 | 容器直径 | 中心线速度 | 壁剪切率 | 系统性WBC |
| N | n | 微米 | μm/s | s-1 | /μl | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 × 4 | 1150 × 50 | 1010 × 100 | 5200 × 300 |
| 莱斯-eGFP | 3 | 15 | 27 × 2 | 2220 × 90 | 2030 × 90 | 5800 × 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
表1：两条不同转基因小鼠线的相关血液动力学和微血管参数。对于缺乏肌阵痛的mdx小鼠和乳胶素小鼠，血管直径、中心线速度、壁剪切速率和系统WBC均显示。在此示例中，mdx 小鼠（C57BL/10J，黑色 10 背景）和 lys-eGFP 小鼠（C57BL/6J，黑色 6 背景）显示统计上不同的中线速度和壁剪切率，不应使用 IVM 进行比较。每组至少n = 3只动物的示范数据以均值和SEM的形式呈现， 通过未配对的t测试与韦尔奇的修正进行统计分析。显著性设置为 P < 0.05。
补充视频1：结缔组织去除不足对排强肌的微观作用。请点击此处查看此视频（右键单击以下载）。
补充视频2：通过高血症或低血压改变血流。请点击此处查看此视频（右键单击以下载）。
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Discussion
IVM作为一种研究不同器官不同细胞类型的方法得到了广泛的应用，并被广泛地描述和讨论了19。本研究的主要目的是提供一种有效的方法，在肌肉的肌肉中设置和执行IVM。实践该方法会产生可靠且可重现的结果。因此，规划和标准化是掌握该技术的关键因素。最重要的是，该技术非常依赖于血液动力学和微血管参数，需要密切监测和控制。因此，不同组之间的系统动力学会产生误导性的结果。
尽管它在研究生理和病理状况中的作用，单靠IVM可能无法完全消除特定细胞类型对白细胞在炎症中招募个体的贡献。为此，其他补充方法可与 IVM 结合使用。例如，流室实验等实验方法可以划定内皮或白细胞的作用。此外，流室是将啮齿动物发现转化为人类白细胞的极佳设置，例如新生儿20。此外，外体方法，如FACS或免疫系统化学应补充IVM实验。每种方法可以添加从受控环境获取的特定信息，而这些要素很少。
这里介绍的创伤性排泄物制剂尽可能类似于炎症的生理基线条件。然而，强制性的手术准备本身是炎症的刺激，必须考虑解释。药理学TNF刺激的排泄组织可能提供一个额外的模式，以促进炎症招募超越创伤性手术刺激16。此外，不同的小鼠菌株可能对标准化刺激表现出改变的反应。我们已经证明，即使是常见的野生类型菌株也可能表现出不同的白细胞招募基线状态。这表明在规划实验时，必须分配正确的基因控制，并为新的实验组建立基线数据。由于转基因菌株目前非常丰富，因此，即使相同的菌株也可能因繁殖而随时间而变化。
综合来看，IVM是监测小鼠生物环境中白细胞招募的有力工具，应伴有前活体和体外技术。此外，cremaster IVM 允许各种不同的模式，包括特定的细胞染色、炎症刺激或药理操作和预处理。因此，它可以作为一个平台，以评估不同的药理媒介及其生物影响，在临床前研究，特别是在炎症领域，更具体地说，在炎症性肌肉病。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了德国联邦教育和研究部（BMBF）01GL1746E的支持，作为PRIMAL联盟的一部分。作者承认布里塔·赫克曼和西尔维娅·佩泽提供了娴熟的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
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