Summary
Ici, nous montrons comment effectuer la microscopie intravitale sur les venules post-capillaires du muscle de cremaster de souris. Communément appliqués à différents modèles d’inflammation et de septicémie, en particulier ceux induits par les chimiothérapeutiques et les cytokines, nous soulignons sa pertinence dans l’étude des muscolopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte.
Abstract
La microscopie intravitale (IVM) est largement utilisée pour surveiller les processus physiologiques et pathophysiologiques dans la cascade de recrutement de leucocytes in vivo. Le protocole actuel représente une méthode pratique et reproductible pour visualiser l’interaction endothélium leucocyte menant au recrutement de leucocytes dans le tissu dérivé du muscle squelettique dans l’organisme intact de la souris. Le modèle s’applique à tous les domaines de recherche qui mettent l’accent sur l’activation des granulocytes et leur rôle dans la maladie.
Nous fournissons un protocole étape par étape pour guider à travers la méthode et pour mettre en évidence les pièges potentiels et les difficultés techniques. Le protocole couvre les aspects suivants : réglages expérimentaux et matériel requis, anesthésie de la souris, dissection du muscle cremaster ainsi que cannulation trachéale et carotide, enregistrements IVM et analyse hors ligne. Les formats de données comme les leucocytes adhérents, le flux roulant (RF) et la fraction de flux roulant (RFF) sont expliqués en détail et les applications appropriées sont discutées. Les résultats représentatifs des souris de mdx déficientes de dystrophine sont fournis dans la section des résultats.
IVM est un outil puissant pour évaluer le recrutement de leucocytes dans un cadre in vivo; cependant, la délimitation par exemple la fonction endothéliale et leucocyte peut nécessiter une combinaison avec des configurations ex vivo comme des expériences de chambre de flux. En outre, le contexte génétique des animaux d’intérêt peut grandement influencer le recrutement de base, nécessitant un réglage individuel du protocole fourni. Malgré ses limites, IVM peut servir de plate-forme pour traduire facilement les résultats in vitro en un organisme vertébré vivant.
Introduction
La microscopie intravitale (IVM) est un outil couramment appliqué dans le domaine de la biologie du leucocyte. Le recrutement de leukocyte suit une cascade d’événements bien définis initiés par la capture de leucocyte, le roulement et l’adhésion au mur endothélial, et enfin la transmigration et l’extravasation des leucocytes au site réel de l’inflammation1. Chaque étape est médiatisée et contrôlée par diverses chimiothéines (p. ex., IL-8/CXCL8), les récepteurs (p. ex., LFA-1, Mac-1) et les molécules correspondantes d’adhérence cellulaire endothéliale (p. ex., ICAM-1, VCAM-1 et E-Selectin)2,,3. L’interaction de différents sites de régulation, les facteurs de contrôle et les médiateurs de la cascade de recrutement de leucocytes comme le récepteur des produits finaux avancés de glycation (RAGE), la molécule d’adhérence intercellulaire 1 (ICAM-1), C-X-C motif ligand (CXCL)1/2 et leur récepteur CXCR2 ont été découverts en utilisant IVM4,5,6,7,8,9.
La méthode de la MIV a été décrite pour de nombreux organes et tissus différents tels que l’intestin10, la peau11, les ganglions lymphatiques12, le sac de jaune embryonnaire13 et d’autres. Cependant, la méthode la plus largement étudiée de la MIV est le modèle de cremaster, décrit pour la première fois chez les rats14. Bien qu’elle soit encore utilisée chez les rats15,la méthode est aujourd’hui principalement appliquée chez la souris en raison de la forte abondance de différentes lignées transgéniques. Notre groupe a récemment mis en évidence le rôle potentiel de cremaster IVM dans le domaine des muscolopathies inflammatoires comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) étudiant les souris mdx dystrophine-déficientes16. En raison de sa composition fine de fibre entrelacée et facilement accessible, le muscle de cremaster représente le muscle candidat idéal pour être étudié dans son ensemble de montage utilisant la microscopie légère ou fluorescente. Le recrutement et l’extravasation de Leukocyte ont principalement lieu dans les venules post-capillaires, qui peuvent facilement être identifiés sur une couche musculaire continue dans le muscle de cremaster.
L’avantage de l’imagerie in vivo par rapport à d’autres essais in vitro est son contexte biologique dans un organisme vivant. Dans le même temps, la délimitation des contributions spécifiques aux cellules à l’analyse altérée du leucocyte peut nécessiter des modèles in vitro supplémentaires comme les chambres de débit ou les essais endothéliaux. La combinaison de plusieurs méthodes donnera des données les plus convaincantes. Les scientifiques doivent être conscients des limites du modèle de crémaster car toute manipulation chirurgicale conduira à une augmentation du trafic et du recrutement de leucocytes. Par conséquent, le recrutement de base est difficile à estimer avec cette méthode. Malgré son application large, IVM du cremaster peut être difficile et une configuration nouvelle peut prendre du temps et des ressources à établir. Nous fournissons maintenant un protocole facile qui aidera à éviter certaines des erreurs courantes dans IVM. En outre, les limitations seront discutées et des méthodes complémentaires seront mises en évidence le cas échéant.
L’IVM du cremaster représente une approche idéale à mettre en œuvre dans le domaine des études inflammatoires et infectieuses. Plus précisément, le modèle de cremaster peut être d’un grand intérêt pour les scientifiques qui étudient la biologie du muscle squelettique dans le contexte de la maladie inflammatoire.
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Protocol
Des animaux ont été logés dans des conditions contrôlées et spécifiques exemptes d’agents pathogènes à l’IBF (Interfakultàre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par la CISR locale et le Regierungspraesidium Karlsruhe, Bade-Wurtemberg, Allemagne.
1. Administration d’anesthésie
- Anesthésiez la souris par injection intraperitoneal (c.-à-d.) de 125 mg/kg de kétamine et de 12,5 mg/kg de xylazine.
- Placer et fixer la souris dans une position couchée dorsale sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris (36,5-38 oC). Utilisez une suture stérile non absorbable (6/0) pour enrouler une boucle simple autour des dents frontales et ruban adhésif les extrémités de jointure de la suture à la garniture de chauffage. Cette fixation vise à garder la bouche ouverte afin d’éviter les perturbations de la respiration.
- Vérifiez la souris pour la profondeur appropriée de l’anesthésie par pincement interdigital d’ateil (retrait ne doit pas être vu).
- Une fois qu’une anesthésie suffisante est atteinte procéder à la préparation chirurgicale. Confirmer à plusieurs reprises l’anesthésie le long de l’expérience en cours tous les 30 min. Réutilisez les médicaments décrits ci-dessus si nécessaire.
- Solution de sel physiologique d’équilibre (PSS, composition : 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04, 2.0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) avec 5% DE CO2/95% N2 pendant 15 minutes. Bulle continue PSS avec 5% de CO2/95% N2 tout au long de l’expérience et de garder à 37 oC.
2. Préparation chirurgicale de la trachée et de l’artère carotide (facultatif)
- Disséquer la peau de la région du cou en tirant doucement la peau avec des pincettes dans la ligne médiane. Utilisez des ciseaux pour appliquer une coupe circulaire de 1 à 2 cm de diamètre pour donner suffisamment d’espace pour la préparation chirurgicale.
- Disséquez soigneusement les tissus musculaires, graisseux et conjonctifs environnants à l’aide de pinces à épiles.
- Faire une coupe transversale (1,3 mm) dans la trachée à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux et introduire un tube de polyéthylène (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") à l’intérieur de l’extrémité caudale de la trachée pour sécuriser les voies respiratoires supérieures.
- Fixer le tube situé dans la trachée par une seule suture circulaire de noeud (6/0 USP).
- Localiser l’artère carotide le long du côté droit de la trachée et disséquer le tissu environnant de la paroi de l’artère carotide. Alternativement, la jugulaire ou aussi la veine de queue pourrait être employée pour l’accès d’i.v. Essayez d’éviter les blessures au nerf vagal, car il est situé de près.
- Passer deux morceaux de suture (6/0) sous l’artère carotide. Placez la première suture crânienne proximal, près de la bifurcation des artères carotides et attachez-la définitivement. La deuxième suture sera située à environ 5-8 mm distal de la première et plus tard être utilisé pour sécuriser le tube dans l’artère carotide. Ne l’attachez pas encore.
- Préparer un tube de polyéthylène (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") d’une longueur de 30 cm en pliant la partie de fin à une aiguille de seringue de 1 mL remplie de saline (0,9% NaCl). Le rinçage rigoureux est important pour prévenir l’embolisation de l’air pendant la préparation.
- Utilisez un clip de navire de 7 mm pour serrer l’artère carotide de la deuxième suture.
- Effectuer une petite coupe transversale (0,5 mm) dans l’artère carotide et introduire le tube de polyéthylène stérile. Fixez le tube dans l’artère à l’aide de la deuxième suture préparée auparavant.
- Retirez le clip du navire et appliquez doucement un peu de tension sur la seringue reliée au tube de polyéthylène. Ce cathéter carotide peut maintenant être utilisé pour administrer des médicaments ou prélever des échantillons de sang si nécessaire, même la surveillance de la pression artérielle ou le pouls est possible avec les dispositifs respectifs.
3. Préparation chirurgicale du muscle de cremaster
- Transférer la souris sur le coussin chauffant (avec le coussin chauffant) dans le cadre en plastique sur mesure tenant la scène pour une microscopie ultérieure. Orientez la souris avec son scrotum face à l’étape du microscope.
- Réévaluer la profondeur de l’anesthésie avant de procéder; ré-administrer un quart à la demi-dose d’anesthésie si nécessaire.
- Localiser le scrotum, le tenant à sa partie la plus distale à l’aide de pincettes, tirez-le doucement et coupez une section circulaire de peau scrotale d’environ 5 mm de diamètre. Assurez-vous de ne pas nuire aux structures sous-jacentes telles que le muscle cremaster. Assurez-vous de garder le tissu ouvert bien hydraté avec une solution saline.
- Disséquez le tissu conjonctif lâche à l’aide de deux pincettes et localisez les deux testicules.
- Tenez un testicule distally et commencez doucement à le retirer, en enlevant le tissu conjonctif environnant étape par étape.
- Une fois que le testicule est extériorisé, épinglez son extrémité distale à l’anneau en caoutchouc entourant la scène. Lors de l’extériorisation, hydrater le tissu avec une solution saline pendant tout le processus.
- Étape critique : Enlevez soigneusement le tissu conjonctif sans nuire au muscle de cremaster sous-jacent. L’excès de tissu conjonctif peut obstruer la vision dans la microscopie ultérieure et peut produire des images floues.
- Épingler la partie la plus détale des testicules vers le bas et ouvrir le muscle de cremaster par une petite coupe transversale (environ 1 mm), suivie d’une incision longitudinale de l’extrémité très distale à l’extrémité proximal. En conséquence, le muscle cremaster devrait s’ouvrir sphériquement. Le vaisseau macroscopiquement visible ne doit pas être coupé, car cela peut avoir un impact sur l’hémodynamique.
- Étendre soigneusement le muscle sur le stade de verre et l’épingler à l’anneau en caoutchouc. Assurez-vous de ne pas toucher ou nuire à la région centrale, car la microscopie sera effectuée ici.
Attention : L’excès d’étirement peut obstruer le flux sanguin. - Épinglez les testicules restants de côté pour donner accès à la région d’intérêt. Assurez-vous d’humidifier avec PSS à plusieurs reprises pour éviter le séchage. Le muscle monté est maintenant prêt pour la microscopie.
4. Microscopie intravitale
- Placez le muscle de cremaster monté dans le microscope droit et effectuez la microscopie à l’aide d’un objectif 40x.
- Acquérir des données et exporter à l’aide d’une spectrographie d’imagerie à haut débit.
- Effectuez des enregistrements sous superfusion continue avec PSS17préchauffé (35-37 oC). Appliquer la superfusion par un petit tube qui a été scotché à l’objectif droit du microscope pour permettre un dégoulinement continu de PSS à côté de l’objectif vers le bas sur le tissu musculaire.
- Identifiez les venusles post-capillaires (confluence de deux petits vaisseaux) et mesurez la microcirculation sur les venusles d’un diamètre de 20-40 m.
- Enregistrez des images haute résolution de la microcirculation du muscle cremaster dans une plage temporelle de 30 s. Comme il peut y avoir une légère contraction et la relaxation du tissu musculaire pendant l’enregistrement, assurez-vous d’ajuster continuellement la mise au point. En général, la souris a tendance à afficher une circulation stable pendant environ 2 heures. Il est possible d’acquérir plusieurs enregistrements de différents navires de différentes régions. Un ou les deux testicules peuvent être utilisés par la suite.
REMARQUE : Comme il s’agit d’un modèle d’inflammation, les moyens communs d’induction sont : l’application systémique ou l’injection scrotale locale des médiateurs pro-inflammatoires aussi bien que la superfusion avec par exemple N-Formylmethionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP). N La stimulation locale de TNF-MD est couramment utilisée pour déclencher le recrutement de leucocytes ; LPS-induit endotoxemia est un modèle de l’inflammation systémique grave SIRS.
5. Visualisation de Leukocyte
REMARQUE : Les leucocytes adhérents et roulants peuvent facilement être vus sans autre visualisation. Pour déterminer la vitesse de la ligne centrale des leucocytes en mouvement libre, effectuez des taches différentielles.
- Si des souris étiquetées eGFP sont utilisées, analysez-les directement par microscopie à fluorescence.
- Pour les souches de souris non étiquetées par eGFP, utilisez la coloration de rhodamine.
- Administrer la rhodamine 6G à 0,2 mg/kg de poids corporel. Des doses répétées peuvent être nécessaires pour atteindre des intensités de coloration suffisantes. Assurez-vous de conserver de petits volumes, car de plus grands volumes peuvent affecter les paramètres hémodynamiques.
- Pour la coloration instantanée des leucocytes, administrer la tache par l’artère carotide. Si la dissection carotide d’artère n’a pas été exécutée, la coloration suffisante peut être réalisée par application d’i.p. utilisant la même dose18. Comme alternative au cathétérisme carotide, tout autre cathétérisme veineux peut être effectué.
REMARQUE : Gardez à l’esprit que la coloration de rhodamine, contrairement à l’étiquetage eGFP, montre la carie temporelle de l’intensité de fluorescence ainsi qu’un maximum global de coloration d’environ 80% des leucocytes à des concentrations plus élevées. - Visualisez les leucocytes tachés de rhodamine en mouvement libre par microscopie fluorescence.
6. Fin de l’expérience
REMARQUE : Le temps total estimé pour exécuter ce protocole devrait être de 90 à 150 minutes.
- Mettre fin à l’expérience avec l’euthanasie par dislocation cervicale.
- Pour d’autres analyses, telles que la transmigration, fixer le muscle cremaster en PFA tout en restant étiré sur la scène et taché pour l’histologie au besoin.
7. Analyse hors ligne
- Analyser les paramètres suivants comme des comptes simples lors de la lecture vidéo.
- Calculer le flux roulant [nombre/min] : nombre de cellules roulantes passant une ligne imaginaire/min
- Calculer l’adhérence [nombre/mm2]:nombre de cellules adhésives à la paroi du navire dans le champ de vision de 30 s/surface vasculaire [mm2].
- Mesurer les paramètres hémodynamiques et microvasculaires suivants sont mesurés à l’aide d’ImageJ.
- Calculer le diamètre du navire [m] comme diamètre de la paroi interne.
- Calculer la longueur du navire [m] comme longueur de ligne centrale du navire.
- Calculez la
vitesse de la ligne centrale obtenue à partir de l’analyse vidéo image à cadre des leucocytes en mouvement libre dans la ligne centrale.
- Utilisez les équations suivantes comme estimation.
- Calculer la surface vasculaire en [mm2]:longueur du navire [m] x diamètre du navire [m] x x x 10-6.
- Calculez le
taux de cisaillement mural : 4,9 x (8 x vitesse de ligne centrale x 0,625/diamètre du navire [m]). - Calculer la vitesse moyenne de flux sanguin : vitesse de ligne centrale x 0.625.
- Calculer le
flux total de leucocytes : compte 
de leucocyte systémique x (vitesse moyenne 
de flux sanguin x 60/1000) x x . - Calculez la fraction de flux roulant [%] : flux roulant/flux total de leucocyte x 100.
vitesse de la ligne centrale obtenue à partir de l’analyse vidéo image à cadre des leucocytes en mouvement libre dans la ligne centrale.
taux de cisaillement mural : 4,9 x (8 x vitesse de ligne centrale 
flux total de leucocytes : compte 
de 
de flux sanguin x 60/1000) x x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM selon le protocole fourni donnera un aperçu unique de la cascade de recrutement de leucocytes dans le muscle squelettique. La section des résultats se concentrera sur les résultats typiques obtenus par IVM et mettra en évidence les problèmes potentiels qui peuvent rencontrer.
La configuration expérimentale de la microscopie intravitale est décrite dans la figure 1. La préparation du muscle de cremaster et l’ablation du tissu conjonctif sont cruciales pour obtenir des images microscopiques ciblées avec une surface uniforme. L’excès de tissu conjonctif conduit finalement à des images microscopiques floues(vidéo supplémentaire 1) lors de l’exécution de la MIV. La figure 2 montre des images microscopiques représentatives qui peuvent être obtenues à l’aide de la MIV. Tout d’abord, les venusles post-capillaires, qui devraient avoir entre 20 et 40 m de diamètre, sont identifiés par confluence de deux petits navires. Seuls les leucocytes adhérents et roulants peuvent être visualisés, les leucocytes circulants ne peuvent être suivis que dans la rediffusion au ralenti des vidéos enregistrées. Le nombre de leucocytes adhérents est défini comme des leucocytes stationnaires sur une période de 30 secondes et exprimés par mm2 de surface du navire(figure 2). Le nombre de leucocytes roulants passant une section transversale du navire précédemment définie est compté; les vitesses de roulement peuvent être obtenues dans l’analyse hors ligne. Le roulement peut être exprimé sous forme de flux roulant (RF - nombre de cellules roulantes sur une ligne prédéfinie/min) ou comme fraction de flux roulant (RFF en % - flux de leucocytes RF/total qui passent le navire). La RF dépend fortement du nombre de cellules circulantes, tandis que le RFF est moins affecté par les changements dans le nombre de globules blancs (CMC). Notez que, dans de nombreux cas, l’adhérence et le roulement des leucocytes sont inversement liés; un nombre élevé de leucocytes adhérents peuvent réduire la piscine de cellules circulant librement et ainsi amortir le roulement de leucocyte.
Défis techniques et pièges potentiels
Le muscle cremaster renferme les testicules et assemble une structure sphérique. Pour monter le muscle sur la scène d’enregistrement, une incision longitudinale est nécessaire pour ouvrir la sphère. Cela peut affecter la microvasculature globale que les petits navires pourraient être coupés. Pour éviter les biais à l’évolution du flux sanguin, il est conseillé de choisir la zone centrale pour la réorganisation. Cette zone ne doit ni être touchée ni manipulée. En outre, la microcautérie peut prévenir les saignements et les changements dans l’hémodynamique microvasculaire. Le flux sanguin des capillaires environnants fournit généralement un indice précieux si la circulation est affectée en raison de la préparation dans le domaine d’intérêt. En général, les vaisseaux plus proximales (vers le corps de la souris) ont tendance à montrer une meilleure microcirculation, mais la capture d’image peut être compliquée par l’augmentation du mouvement et des perturbations qui résultent de la respiration de l’animal.
Pour empêcher le muscle de cremaster de sécher pendant l’enregistrement microscopique, la superfusion permanente du tissu est éminente. L’humidifier insuffisant ou interrompu entraînera le séchage du tissu et l’échec de l’expérience.
L’épinglage du tissu de cremaster est nécessaire pour le maintenir étiré et en place. Pour aplatir le muscle striated, des étirements doux sont nécessaires. Trop peu d’étirement entraîne des tissus inégaux, ce qui complique la microscopie, des étirements excessifs limiteront le flux sanguin et nuisent aux tissus. Encore une fois le flux sanguin capillaire fournit un état fiable de l’état circulatoire global du tissu. L’expérience et la pratique sont nécessaires pour déterminer le degré d’étirement lors du montage du tissu.
Les longs temps de préparation affecteront l’état inflammatoire global de l’organisme et les données de biais. Par conséquent, assurez-vous de vous concentrer sur la question d’intérêt tout en concevant l’expérience et de garder les temps de préparation aussi courts que nécessaire. Si aucune administration de drogue, moniteur ou des analyses de sang sont nécessaires une préparation singulière du tissu de cremaster peut être suffisante.
Dans la plupart des milieux, différents groupes expérimentaux seront comparés aux animaux de type sauvage. Il est d’une importance capitale de s’assurer que les paramètres hémodynamiques et microvasculaires sont similaires entre les groupes expérimentaux(tableau 1). Une multitude de paramètres peuvent affecter le recrutement de leucocytes in vivo, y compris la sortie cardiaque, le diamètre du vaisseau, la vitesse de la ligne centrale, le taux de cisaillement mural et le nombre de leucocytes circulants. Le tableau 1 affiche les données de deux lignées de souris transgéniques différentes, la souris mdx déficiente en dystrophine et la souris lys-eGFP (exprimant eGFP sous le promoteur lys dans les neutrophiles et les macrophages). Alors que les paramètres tels que le diamètre du navire peuvent être contrôlés par l’investigateur, la vitesse de la ligne centrale et le taux de cisaillement dépendent de l’hémodynamique du groupe expérimental individuel ou de la souche de souris. De toute évidence, la vitesse de la ligne centrale et le taux de cisaillement des parois les bras de fer des murs sont significativement différents entre les souris mdx et lys-eGFP(tableau 1) rendant impossible la comparaison significative des données de la MIV (analyse statistique par t-test avec la correction de Welch, l’importance a été fixée à P 'lt; 0,05). La vitesse de la ligne centrale est influencée par le rendement cardiaque, la résistance vasculaire périphérique et le volume intravasal. Par exemple, un grand volume de rhodamine ou toute autre substance expérimentale donnée par l’intermédiaire du cathéter carotide augmente la vitesse post-capillaire de la ligne centrale et inhibe la capture et le roulement du leucocyte(Vidéo supplémentaire 2). Au contraire, l’insuffisance cardiaque, l’anesthésie profonde ou l’hypothermie peuvent diminuer le flux post-capillaire. Avant d’aborder l’analyse hors ligne des données IVM, les exigences de qualité des données (par exemple les paramètres hémodynamiques dans les plages physiologiques) doivent être définies, afin de tirer des conclusions significatives et de réduire les biais.
Pour déterminer la vitesse de la ligne centrale, les leucocytes circulant librement doivent être visualisés. Soit, les leucocytes fluorescents (comme chez les souris lys-eGFP) peuvent être utilisés, soit les leucocytes doivent être teints avec des réactifs fluorescents comme la rhodamine(figure 3). La rhodamine peut être appliquée par le cathéter carotide ou par injection i.p. Puisque la rhodamine est progressivement prise par d’autres types de cellules aussi bien, une titration de dosage et de temps est essentielle. L’excès de dosage et les longs intervalles produiront un fond significatif pendant la microscopie.
Enfin, nous tenons à souligner la diversité biologique des différentes souches de souris. Outre les souches génétiquement modifiées, les souches de type sauvage généralement acceptées peuvent montrer des écarts physiologiques. La figure 4 compare les souris noires 6 (C57BL/6) couramment utilisées à des souris noires 10 (C57BL/10ScSn). Les souris noires 6 montrent clairement le roulement amélioré, l’adhérence et la transmigration des leucocytes par rapport aux souris noires de 10 (analyse statistique par ANOVA à sens unique avec le test post-hoc de Tukey; l’importance a été fixée à P 'lt; 0.05), même si les deux souches seraient appelées type sauvage. Par conséquent, le contexte génétique correct devrait être considéré, particulièrement en utilisant des souris transgéniques. Dans notre cadre expérimental, une comparaison de souris noires 6 et de souris mdx transgéniques (fond noir 10) dissimulerait en grande partie l’état inflammatoire amélioré des souris mdx déficientes en dystrophine sur leur fond noir correct de type 10 sauvage(figure 4).
Figure 1: Configuration expérimentale schématique de L’IVM sur le muscle cremaster. Après anesthésie, la trachée est cannulée et un cathéter est placé dans l’artère carotide. Le muscle de cremaster est exposé et préparé pour la microscopie intravitale sur un microscope droit utilisant la microscopie légère ou la microscopie fluorescente. Les vidéos sont obtenues pour une analyse hors ligne ultérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Segment représentatif post-capillaire de la microscopie intravitale avec cadres séquentiels. La colonne de gauche montre des images microscopiques légères, pour une meilleure visualisation du navire est décrit avec des lignes pointillées. Le venule est identifié par des navires confluents (marqués par des astérisques rouges) et un diamètre de navire de l’île de 40 m. La colonne de droite représente une représentation schématique de l’image gauche correspondante, montrant des leucocytes en rouge. Les quatre premières rangées montrent des images séquentielles du même navire au fil du temps. La rangée inférieure indique des leucocytes adhérents. Dans la représentation schématique, les leucocytes individuels et leur distance roulante sont marqués. Dans l’analyse hors ligne, l’adhérence par millimètre carré, le flux de roulement ainsi que la vitesse de roulement peuvent être calculés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les leucocytes roulants peuvent être visualisés par l’expression transgénique de marqueurs fluorescents ou par coloration secondaire avec de la rhodamine. Images microscopiques représentatives du recrutement de leucocytes d’eGFP et de leucocytes étiquetés rhodamine à partir de n 3 animaux chacun. Les neutrophiles roulants exprimant l’eGFP sous le promoteur de lys-eGFP peuvent être directement détectés par microscopie immunofluorescente (colonne gauche). Les leucocytes sans fabricants fluorescents peuvent être tachés par injection intraveineuse ou intrapéritoétoique de rhodamine (colonne droite). Notamment, la rhodamine n’est pas exclusivement prise par les neutrophiles, donnant beaucoup plus de fond. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Comparaison du recrutement de leucocytes dans différentes souches de souris transgéniques et sauvages. (A) Fraction de flux roulant, (B) l’adhésion et (C) la transmigration des leucocytes est comparée entre le noir 6 (C57BL/6J), le noir 10 (C57BL/10ScSnJ) et les souris mdx (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), montrés comme moyennes - SEM. Black 6 souris montrent un recrutement de leukocyte amélioré par rapport aux souris noires 100. De même, les souris mdx ont un plus grand recrutement par rapport à noir 10, mais pas comparé à noir 6 souris sauvages de type. Ces données démontrent l’importance d’allouer des contrôles génétiques corrects. Données d’au moins 3 animaux par groupe. Analyse statistique par ANOVA à sens unique avec l’analyse post-hoc de Tukey. L’importance a été fixée à P 'lt; 0.05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Souche de souris | non. de souris | non. de venules | Diamètre du navire | Vitesse De ligne centrale | Taux de cisaillement de mur | WBC systémique |
| ¡n | ¡n | Μm | m/s | s-1 | /L | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 à 4 | 1150 à 50 | 1010 à 100 | 5200 à 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 à 2 | 2220 à 90 | 2030 à 90 | 5800 à 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tableau 1 : Paramètres hmodynamiques et microvasculaires pertinents de deux lignées de souris transgéniques différentes. Le diamètre du navire, la vitesse de la ligne centrale, le taux de cisaillement mural et les WBC systémiques sont affichés pour les souris mdx dépourvues de dystrophine et de souris lys-eGFP. Dans cet exemple, les souris mdx (C57BL/10J, fond noir 10) et les souris lys-eGFP (C57BL/6J, noir 6 fond) montrent statistiquement différentes vitesse de ligne centrale et le taux de cisaillement de la paroi et ne devraient pas être comparés à l’aide d’IVM. Les données exemplaires d’au moins 3 animaux par groupe sont présentées comme moyennes et SEM. Analyse statistique par t-test non appréré avec la correction de Welch. L’importance a été fixée à P 'lt; 0.05.
Vidéo supplémentaire 1 : Effet microscopique de l’enlèvement insuffisant du tissu conjonctif sur le muscle de cremaster. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Right-click pour télécharger).
Vidéo supplémentaire 2 : Flux sanguin altéré par hypervolemia ou hypotension. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Right-click pour télécharger).
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Discussion
IVM comme méthode a été largement utilisé pour étudier différents types de cellules dans différents organes et a été largement décrit et discuté19. L’objectif principal de cette étude est de fournir une approche efficace pour mettre en place et effectuer IVM dans le muscle cremaster. La pratique de la méthode produira des résultats fiables et reproductibles. Ainsi, la planification et la normalisation sont des facteurs clés pour maîtriser la technique. Par-dessus tout, la technique est très dépendante des paramètres hémodynamiques et microvasculaires, qui doivent être étroitement surveillés et contrôlés. En tant que tel, différentes hémodynamiques entre les groupes donneront des résultats trompeurs.
En dépit de son rôle dans l’étude des conditions physiologiques et pathologiques, IVM seul ne peut pas démêler complètement la contribution individuelle des types spécifiques de cellules au recrutement de leucocytes dans l’inflammation. Pour ce faire, d’autres méthodes complémentaires peuvent être combinées avec IVM. Par exemple, les méthodes ex vivo comme les expériences de chambre de débit peuvent délimiter entre les effets de l’endothélium ou le leucocyte. En outre, les chambres de débit sont d’excellentes configurations pour traduire les résultats de rongeurs en leucocytes humains, par exemple chez les nouveau-nés20. En outre, les méthodes in vitro comme FACS ou immunohistochimie devraient compléter les expériences IVM. Chaque méthode peut ajouter des informations spécifiques acquises à partir d’un environnement contrôlé avec peu de facteurs de confusion.
La préparation traumatique de cremaster présentée ici ressemble aux conditions physiologiques de base de l’inflammation aussi étroitement que possible. Pourtant, la préparation chirurgicale obligatoire elle-même est un stimulus de l’inflammation, qui doit être considéré pour l’interprétation. La stimulation pharmacologique de TNF du tissu de cremaster peut fournir un mode additionnel pour amplifier le recrutement inflammatoire au-delà du stimulus chirurgical traumatique16. En outre, différentes souches de souris peuvent montrer des réponses modifiées vers des stimuli standardisés. Nous avons démontré que même les souches de type sauvage courants peuvent présenter différents états de référence du recrutement de leucocytes. Cela montre l’importance d’assigner des contrôles génétiques corrects et d’établir des données de base pour les nouveaux groupes expérimentaux lors de la planification d’expériences. Comme les souches transgéniques sont très abondantes de nos jours, il est probable que même les mêmes souches peuvent différer au fil du temps selon la reproduction.
Pris ensemble, IVM est un outil puissant pour surveiller le recrutement de leucocytes dans le contexte biologique de la souris et doit être accompagné de techniques ex vivo et in vitro. En outre, cremaster IVM permet une variété de différents modes, y compris la coloration cellulaire spécifique, la stimulation inflammatoire ou la manipulation pharmacologique et le prétraitement. En tant que tel, il peut servir de plate-forme pour évaluer différents médiateurs pharmacologiques et leurs effets biologiques dans les études précliniques en particulier dans le domaine de l’inflammation et plus particulièrement dans les musculopathies inflammatoires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche (BMBF) 01GL1746E dans le cadre du Consortium PRIMAL. Les auteurs reconnaissent Britta Heckmann et Silvia Pezer pour leur assistance technique habile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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