Summary
Her viser vi hvordan du utfører intravital mikroskopi på post-kapillære venules av musen cremaster muskel. Vanligvis brukt på ulike modeller av betennelse og sepsis, spesielt de som er indusert av chemokiner og cytokiner, fremhever vi dens relevans i studiet av muscoloatier som involverer overdrevet muskelleukocytterinfiltrasjon.
Abstract
Intravitalmikroskopi (IVM) er mye brukt til å overvåke fysiologiske og patofysiologiske prosesser innenfor leukocytter rekruttering kaskade in vivo. Den nåværende protokollen representerer en praktisk og reproduserbar metode for å visualisere leukocytterendotelinteraksjonen som fører til leukocytterrekruttering i skjelettmuskulatur avledet vev i musens intakte organisme. Modellen gjelder for alle forskningsområder som fokuserer på granulocytteraktivering og deres rolle i sykdom.
Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å veilede gjennom metoden og for å markere potensielle fallgruver og tekniske problemer. Protokollen dekker følgende aspekter: eksperimentelle innstillinger og nødvendig materiale, anestesi av musen, disseksjon av cremaster muskelsamt trakeal og carotis cannulation, IVM opptak og offline analyse. Dataformater som tilhengerleukocytter, fluks (RF) og rullefluksfraksjon (RFF) forklares i detalj, og passende bruksområder diskuteres. Representative resultater fra dystrophin mangelfullmdx mus er gitt i resultatseksjonen.
IVM er et kraftig verktøy for å vurdere leukocytter rekruttering i en in vivo setting; Delineating kan imidlertid for eksempel endotel- og leukocytterfunksjonen kreve en kombinasjon med ex vivo-oppsett som flytkammereksperimenter. Videre kan den genetiske bakgrunnen til dyr av interesse i stor grad påvirke baseline rekruttering, krever individuell finjustering av protokollen gitt. Til tross for sine begrensninger, kan IVM tjene som en plattform for å lett oversette in vitro funn til en levende virveldyr organisme.
Introduction
Intravitalmikroskopi (IVM) er et vanlig brukt verktøy innen leukocytterbiologi. Leukocytter rekruttering følger en kaskade av veldefinerte hendelser initiert av leukocytter fangst, rullende og vedhende til endotelveggen, og til slutt transmigrasjon og ekstravasasjon av leukocytter til selve stedet for betennelse1. Hvert trinn er mediert og kontrollert av ulike chemokines (f.eks. IL-8/CXCL8), reseptorer (f.eks LFA-1, Mac-1) og tilsvarende endotelcelleadhesjonsmolekyler (f.eks. ICAM-1, VCAM-1 og E-Selectin)2,3. Interaksjonen mellom ulike regulatoriske nettsteder, kontrollerende faktorer og mediatorer av leukocytter rekruttering kaskade som reseptor av avanserte glycation sluttprodukter (RAGE), intercellulær adhesjon molekyl 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 og deres reseptor CXCR2 ble avdekket ved hjelp av IVM4,5,6,7, 8,,9.9
Metoden for IVM har blitt beskrevet for mange forskjellige organer og vev som tarmen10, hud11, lymfeknuter12, embryonale eggeplomme sekk13 og andre. Den mest studerte metoden for IVM er imidlertid cremaster-modellen, først beskrevet hos rotter14. Mens den fortsatt brukes i rotter15,brukes metoden i dag hovedsakelig hos mus på grunn av den høye overfloden av forskjellige transgene linjer. Vår gruppe har nylig fremhevet den potensielle rollen som cremaster IVM innen inflammatoriske muscolopathies som Duchenne Muskeldystrofi (DMD) studerer dystrophin-mangelfullmdx mus16. På grunn av sin tynne sammenvevde og lett tilgjengelige fibersammensetning representerer cremaster muskelen den ideelle kandidatmuskelen som skal studeres som en hel brakett ved hjelp av lys eller fluorescerende mikroskopi. Leukocytter rekruttering og ekstravasasjon hovedsakelig finner sted i post-kapillær venules, som lett kan identifiseres på en kontinuerlig muskellag i cremaster muskel.
Fordelen med in vivo imaging sammenlignet med andre in vitro analyser er dens biologiske kontekst i en levende organisme. Samtidig kan delineating cellespesifikke bidrag til endret leukocytterrekruttering kreve ytterligere in vitro-modeller som strømningskamre eller endotelanalyser. Kombinasjonen av flere metoder vil gi mest overbevisende data. Forskere bør være klar over begrensningene i cremaster modellen som enhver kirurgisk manipulasjon vil føre til økt leukocytter handel og rekruttering. Derfor er baseline rekruttering vanskelig å anslå med denne metoden. Til tross for sin brede anvendelse, Kan IVM av cremaster være utfordrende og en ny oppsett kan ta tid og ressurser å etablere. Vi tilbyr nå en enkel protokoll som vil bidra til å unngå noen av de vanlige feilene i IVM. Begrensninger vil også bli diskutert, og gratis metoder vil bli fremhevet der det er aktuelt.
IVM av cremaster representerer en ideell tilnærming som skal implementeres innen inflammatoriske og smittsomme studier. Mer spesifikt kan cremaster-modellen være av høy interesse for forskere som studerer skjelettmuskelbiologi i sammenheng med inflammatorisk sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr ble plassert under kontrollerte og spesifikke patogenfrie forhold ved IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av den lokale IRB og Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
1. Anestesi administrasjon
- Bedøve musen ved intraperitoneal (dvs. bolusinjeksjon på 125 mg/kg ketamin og 12,5 mg/kg xylazin.
- Plasser og fest musen i en dorsal liggende stilling på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen på musen (36,5-38 °C). Bruk en ikke-absorberbar steril sutur (6/0) til å vikle en enkel sløyfe rundt fortennene og tape de sammenkoblede endene av suturen til varmeputen. Denne fikseringen tar sikte på å holde munnen åpen for å unngå forstyrrelser i pusten.
- Kontroller musen for riktig dybde av anestesi ved interdigital tå klemme (uttak bør ikke ses).
- Når tilstrekkelig anestesi er nådd, fortsett til kirurgisk preparat. Gjentatte ganger bekrefte anestesi langs det pågående eksperimentet hver 30 min. Administrere legemidler som beskrevet ovenfor om nødvendig.
- Likevekten fysiologisk saltoppløsning (PSS, sammensetning: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04,2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) med 5 % CO2/95 % N2 i 15 minutter. Kontinuerlig boble PSS med 5% CO2/95% N2 gjennom hele eksperimentet og holde på 37 °C.
2. Kirurgisk fremstilling av luftrøret og halspulsåren (valgfritt)
- Disseker huden fra nakkeområdet ved å trekke huden forsiktig med pinsett i midtlinjen. Bruk saks til å bruke et sirkulært kutt på 1-2 cm i diameter for å gi nok plass til kirurgisk forberedelse.
- Disseker forsiktig de omkringliggende muskel-, fett- og bindevevene ved hjelp av pinsett.
- Lag et tverrgående snitt (~ 1,3 mm) i luftrøret ved hjelp av liten kirurgisk saks og introduser et polyetylenrør (I.D x O.D. 0,034" x 0,050") inne i den haleformede enden av luftrøret for å sikre de øvre luftveiene.
- Fest røret i luftrøret med en enkelt sirkulær knutesutur (6/0 USP).
- Finn halspulsåren langs høyre side av luftrøret og disseker det omkringliggende vevet fra halspulsåren veggen. Alternativt kan halspulsåren eller halevenen brukes til i.v. tilgang. Prøv å unngå skade på vagal nerve, som det ligger tett.
- Pass to stykker sutur (6/0) under halspulsåren. Plasser den første kraniale suturen proksimal, nær bifurcation av carotis arterier og knytte den permanent. Den andre suturen vil bli plassert ca 5-8 mm distal fra den første og senere brukes til å sikre røret i halspulsåren. Ikke bind den ennå.
- Forbered et polyetylenrør (I.D x O.D. 0,011" x 0,024") med en lengde på 30 cm ved å bøye endedelen til en 1 ml sprøytekanyse fylt med saltvann (0,9 % NaCl). Streng spyling er viktig for å forhindre luftembolisering under forberedelse.
- Bruk en 7 mm karklemme til å klemme halspulsåren distalt av den andre suturen.
- Utfør et lite tverrgående snitt (~0,5 mm) i halspulsåren og introduser det sterile polyetylenrøret. Fest røret i arterien ved hjelp av den andre suturen som er tilberedt før.
- Fjern karklemmen og påfør forsiktig litt spenning på sprøyten som er koblet til polyetylenrøret. Dette carotis kateteret kan nå brukes til å administrere narkotika eller ta blodprøver om nødvendig, selv overvåking av blodtrykk eller pulsrate er mulig med respektive enheter.
3. Kirurgisk fremstilling av cremaster muskel
- Overfør musen på varmeputen (sammen med varmeputen) til den skreddersydde plastrammen som holder scenen for senere mikroskopi. Orienter musen med pungen vendt mot mikroskopstadiet.
- Revurdere dybden av anestesi før du fortsetter; administrere en kvart til en halv dose anestesi om nødvendig.
- Lokaliser pungen, hold den på sitt mest distale del ved hjelp av pinsett, trekk den forsiktig og klipp av en sirkulær del av skrotal hud med ca 5 mm i diameter. Pass på at du ikke skader de underliggende strukturene som cremaster muskelen. Sørg for å holde det åpne vevet godt hydrert med saltoppløsning.
- Dissekere løs bindevev ved hjelp av to pinsett og lokalisere begge testiklene.
- Hold en test is distally og forsiktig begynne å trekke den ut, fjerne omkringliggende bindevev trinnvis.
- Når testis er eksteriør, fest sin distale ende til gummiringen rundt scenen. Ved eksteriør, hydrerve vevet med saltvannsløsning under hele prosessen.
- Kritisk trinn: Fjern forsiktig bindevev uten å skade den underliggende cremaster muskelen. Overflødig bindevev kan hindre synet i senere mikroskopi og kan produsere uklare bilder.
- Fest den distale delen av testis ned og åpne cremaster muskelen med en liten tverrgående kutt (ca 1 mm), etterfulgt av langsgående snitt fra selve distale til den proksimale enden. Som et resultat cremaster muskelen bør åpne sfærisk. Makroskopisk synlig fartøy bør ikke kuttes, da dette kan påvirke hemodynamikk.
- Spre muskelen forsiktig over glassstadiet og fest den til gummiringen. Pass på at du ikke berører eller skader den sentrale regionen, da mikroskopi vil bli utført her.
Forsiktig: Overskytende stretch kan hindre blodstrømmen. - Fest de gjenværende testene til side for å gi tilgang til regionen av interesse. Sørg for å fukte med PSS gjentatte ganger for å unngå tørking. Den monterte muskelen er nå klar for mikroskopi.
4. Intravital mikroskopi
- Plasser den monterte cremaster muskelen i oppreist mikroskop og utføre mikroskopi ved hjelp av en 40x mål.
- Opphente data og eksport ved hjelp av høy gjennomstrømning bildespektrografi.
- Utfør opptak under kontinuerlig superfusjon med forvarmet (35-37 °C) PSS17. Påfør superfusjon av en liten slange som har blitt teipet til det oppreistmålet til mikroskopet for å tillate kontinuerlig drypping av PSS sammen med målet ned på muskelvevet.
- Identifiser post-kapillære venules (samløpet av to mindre kar) og måle mikrosirkulasjonen på venuli med en diameter på 20-40 μm.
- Ta opp høyoppløselige bilder av mikrosirkulasjonen fra cremaster muskelen i en tidsintervall på 30 s. Siden det kan være liten sammentrekning og avslapning av muskelvevet under opptak, må du kontinuerlig justere fokuset. Vanligvis har musen en tendens til å vise stabil sirkulasjon i ca 2 timer. Det er mulig å skaffe flere opptak av forskjellige fartøy fra forskjellige regioner. En eller begge testis kan brukes senere.
MERK: Da dette er en modell av betennelse, er vanlige måter å induksjon på: systemisk påføring eller lokal scrotal injeksjon av pro inflammatoriske mediatorer samt superfusjon med for eksempel N-Formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP). Lokal TNF-α stimulering brukes ofte til å utløse leukocytter rekruttering; LPS-indusert endotosemi er en modell av SIRS alvorlig systemisk betennelse.
5. Leukocytter visualisering
MERK: Tilhengere og rullende leukocytter kan lett ses uten ytterligere visualisering. For å bestemme senterlinjehastigheten til fritt bevegelige leukocytter, utfør differensialfarging.
- Hvis eGFP-merkede mus brukes, analyserer du dem direkte ved fluorescensmikroskopi.
- For ikke-eGFP-merkede musestammer, bruk rhodaminfarfaring.
- Administrer rhodamin 6G ved 0,2 mg/kg kroppsvekt. Gjentatte doser kan være nødvendig for å oppnå tilstrekkeligflekker. Sørg for å beholde små volumer, da større volumer kan påvirke hemodynamiske parametere.
- For umiddelbar farging av leukocytter, administrer flekken via halspulsåren. Hvis halspulsåren ikke er utført, kan det oppnås tilstrekkelig farging ved bruk av samme dose18. Som et alternativ til halspulsåren kateterisering, kan enhver annen venøs kateterisering utføres.
MERK: Husk at rhodaminfarfarfar, i motsetning til eGFP-merking, viser tidsforfall av fluorescensintensitet samt en samlet farging maksimalt ca. 80 % av leukocytter ved høyere konsentrasjoner. - Visualiser fritt bevegelige rhodaminfargede leukocytter ved fluorescensmikroskopi.
6. Slutten av eksperimentet
MERK: Den totale estimerte tiden for å utføre denne protokollen bør være 90 – 150 minutter.
- Avslutt eksperimentet med eutanasi ved livmorhalsforvridning.
- For ytterligere analyser, for eksempel transmigrasjon, fikse cremaster muskelen i PFA mens fortsatt strukket på scenen og farget for histologi etter behov.
7. Frakoblet analyse
- Analyser følgende parametere som enkle tellinger under videoavspilling.
- Beregn rullefluks [tall/min]: antall rullende celler som passerer en imaginær linje/min
- Beregn vedheming [tall/mm2]: antall celler som limer til karveggen innenfor synsfeltet ≥ 30 s/vaskulær overflate [mm2].
- Mål følgende hemodynamiske og mikrovaskulære parametere måles ved hjelp av ImageJ.
- Beregn fartøyets diameter [μm] som den indre veggdiameteren.
- Beregn fartøyets lengde [μm] som fartøyets midtlinjelengde.
- Beregn senterlinjehastighet
hentet fra bilde-til-ramme-videoanalyse av fritt bevegelige leukocytter i midtlinjen.
- Bruk følgende ligninger som en estimering.
- Beregn vaskulær overflate i [mm2]: karlengde [μm] x kardiameter [μm] x π x 10-6.
- Beregn veggskjærhastighet:
4,9 x (8 x midtlinjehastighet x 0,625/kardiameter [μm]). - Beregn gjennomsnittlig blodstrømhastighet: senterlinjehastighet x 0,625.
- Beregn total
leukocytterfluks: 
systemisk leukocyttertall x (gjennomsnittlig blodstrømhastighet x 
60/1000) x π x . - Beregn rullefluksfraksjon [%]: kvalens/total leukocytterstrømx 100.
hentet fra bilde-til-ramme-videoanalyse av fritt bevegelige leukocytter i midtlinjen.
4,9 x (8 
leukocytterfluks: 
systemisk leukocyttertall x (gjennomsnittlig blodstrømhastighet 
60/1000) x π x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM i henhold til den gitte protokollen vil gi unik innsikt i kaskade av leukocytter rekruttering i skjelettmuskulatur. Resultatdelen vil fokusere på typiske resultater oppnådd av IVM og fremheve potensielle problemer som kan oppstå.
Det eksperimentelle oppsettet for intravital mikroskopi er skissert i figur 1. Utarbeidelse av cremaster muskel og fjerning av bindevev er avgjørende for å oppnå fokuserte mikroskopiske bilder med en jevn overflate. Overflødig bindevev fører til slutt til uklare mikroskopiske bilder (Tilleggsvideo 1) når du utfører IVM. Figur 2 viser representative mikroskopiske bilder som kan fås ved hjelp av IVM. For det første identifiseres post-kapillære venules, som skal være mellom 20-40 μm i diameter, ved samløpet av to mindre fartøy. Bare tilhenger og rullende leukocytter kan visualiseres, sirkulerende leukocytter kan bare spores i slow motion replay av innspilte videoer. Antall tilhengerleukocytter er definert som stasjonære leukocytter over en tid på 30 sekunder og uttrykkes per mm2 av karoverflaten (figur 2). Antall rullende leukocytter som passerer et tidligere definert tverrsnitt av fartøyet telles; rullende hastigheter kan oppnås i offline analyse. Rulling kan uttrykkes som rullefluks (RF = antall rullende celler over en forhåndsdefinert linje/min) eller som rullefluksfraksjon (RFF i % = RF/total leukocytter flux passerer fartøyet). RF er svært avhengig av antall sirkulerende celler, mens RFF er mindre påvirket av endringer i antall hvite blodlegemer (WBCer). Legg merke til at i mange tilfeller leukocytter etterlevelse og rullende er omvendt beslektet; et høyt antall tilhengerleukocytter kan redusere bassenget av fritt sirkulerende celler og dermed dempe leukocytter rullende.
Tekniske utfordringer og potensielle fallgruver
Cremaster muskelen omslutter testis og monterer en sfærisk struktur. For å montere muskelen på opptaksstadiet, er det nødvendig med et langsgående snitt for å åpne sfæren. Dette kan påvirke den totale mikrovaskulaturen, da små kar kan bli kuttet. For å unngå skjevhet for å endre blodstrømmen, er det tilrådelig å velge det sentrale området for omorganisering. Dette området bør verken berøres eller manipuleres. I tillegg kan mikrokauteri forhindre blødning og endringer i mikrovaskulær hemodynamikk. Blodstrømmen av omkringliggende kapillærer gir vanligvis et verdifullt hint hvis sirkulasjonen påvirkes på grunn av forberedelse innen interessefeltet. Generelt har mer proksimale kar (mot musens kropp) en tendens til å vise bedre mikrosirkulasjon, men bildeopptak kan bli komplisert av økt bevegelse og forstyrrelser som følge av å puste inn dyret.
For å hindre at cremaster muskelen tørker ut under mikroskopisk opptak, er permanent superfusjon av vevet eminent. Utilstrekkelig eller avbrutt fukting vil resultere i tørking av vevet og svikt i eksperimentet.
Tynning av cremaster-vevet er nødvendig for å holde det strukket og på plass. For å flate den striated muskelen, er det nødvendig med mild strekking. For lite strekk resulterer i ujevnt vev, noe som kompliserer mikroskopi, overdreven strekking vil begrense blodstrømmen og skade vevet. Igjen kapillær blodstrøm gir en pålitelig status for den generelle sirkulasjonstilstanden til vevet. Erfaring og praksis er nødvendig for å bestemme graden av strekk ved montering av vevet.
Lange forberedelsestider vil påvirke den generelle inflammatoriske tilstanden til organismen og bias-dataene. Sørg derfor for å fokusere på spørsmålet av interesse mens du utformer eksperimentet og holde forberedelsestider så kort som nødvendig. Hvis ingen legemiddeladministrasjon, monitor eller blodprøver er nødvendig en entall forberedelse av cremaster vev kan være tilstrekkelig.
I de fleste miljøer vil ulike eksperimentelle grupper bli sammenlignet med villtypedyr. Det er av avgjørende betydning å sørge for at hemodynamiske og mikrovaskulære parametere er like mellom eksperimentelle grupper (Tabell 1). En rekke parametere kan påvirke leukocytter rekruttering in vivo, inkludert hjerteutgang, fartøydiameter, senterlinjehastighet, veggskjærhastighet og antall sirkulerende leukocytter. Tabell 1 viser data fra to forskjellige transgene muselinjer, dystrophin-mangelfull mdx-mus og lys-eGFP-musen (uttrykker eGFP under lys-promotoren i nøytrofiler og makrofager). Mens parametere som fartøydiameter kan kontrolleres av undersøkeren, avhenger midtlinjehastighet og skjærhastighet av hemodynamikken til den enkelte eksperimentelle gruppen eller musestammen. Det er klart at den midtlinjede hastigheten og veggskjærhastigheten er signifikant forskjellig mellom mdx- og lys-eGFP-mus (tabell 1) noe som gjør meningsfull sammenligning av IVM-data umulig (statistisk analyse ved t-test med Welchs korreksjon ble signifikans satt til P < 0,05). Den midtlinjehastigheten påvirkes av hjerteutgang, perifer vaskulær motstand og intravasalvolum. For eksempel øker et stort volum rhodamin eller andre eksperimentelle stoffer gitt via halspulskateteret post kapillær midtlinjehastighet og hemmer leukocytterfangst og rulling (Supplerende Video 2). Tvert imot kan hjertesvikt, dyp anestesi eller hypotermi redusere post-kapillær strømning. Før du nærmer deg offline analyse av IVM-data, bør kravene til datakvalitet (for eksempel hemodynamiske parametere innenfor fysiologiske områder) defineres, for å trekke meningsfulle konklusjoner og redusere skjevhet.
For å bestemme midtlinjehastigheten må fritt sirkulerende leukocytter visualiseres. Enten kan fluorescerende leukocytter (som i lys-eGFP-mus) brukes eller leukocytter må dytt med fluorescerende reagenser som rhodamin (figur 3). Rhodamin kan påføres via carotis kateteret eller som en i.p. injeksjon. Siden rhodamin gradvis tas opp av andre celletyper også, er en titrering av dosering og tid viktig. Overflødig dosering og lange intervaller vil gi betydelig bakgrunn under mikroskopi.
Til slutt liker vi å påpeke biologisk mangfold av forskjellige musestammer. Foruten genetisk endrede stammer, kan også allment aksepterte vill type stammer vise fysiologisk varians. Figur 4 sammenligner vanlige sysselsatte svarte 6 (C57BL/6) med svarte 10 (C57BL/10ScSn) mus. Svarte 6 mus viser tydelig forbedret rullende, vedhende og transmigrasjon av leukocytter sammenlignet med svarte 10 mus (statistisk analyse av enveis ANOVA med Tukeys posthoc-test; signifikans ble satt til P < 0,05), selv om begge stammene ville bli referert til som vill type. Derfor bør riktig genetisk bakgrunn vurderes, spesielt ved bruk av transgene mus. I vår eksperimentelle setting ville en sammenligning av svarte 6 mus og transgene mdx mus (svart 10 bakgrunn) i stor grad skjule den forbedrede inflammatoriske tilstanden til dystrophin mangelfullmdx mus over deres korrekte svarte 10 vill type bakgrunn (Figur 4).
Figur 1: Skjematisk eksperimentelt oppsett av IVM på cremaster muskel. Etter anestesi er luftrøret kanylert og et kateter er plassert i halspulsåren. Cremaster muskelen er utsatt og forberedt for intravital mikroskopi på et oppreist mikroskop ved hjelp av enten lys mikroskopi eller fluorescerende mikroskopi. Videoer er hentet for senere offline analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativt post-kapillær venulesegment fra intravital mikroskopi med sekvensielle rammer. Den venstre kolonnen viser lyse mikroskopiske bilder, for bedre visualisering er fartøyet skissert med stiplede linjer. Venule er identifisert av konfluent fartøy (preget av røde stjerner) og en fartøy diameter på <40 μm. Høyre kolonne viser en skjematisk representasjon av det tilsvarende venstre bildet, som viser leukocytter i rødt. De fire første radene viser sekvensielle bilder av samme fartøy over tid. Den nederste raden indikerer tilhengerleukocytter. I den skjematiske representasjonen er individuelle leukocytter og deres rulleavstand merket. I offline analyse etterlevelse per kvadratmillimeter kan rullestrøm samt rullehastighet beregnes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Rullende leukocytter kan visualiseres ved transgen uttrykk for fluorescerende markører eller ved sekundær farging med rhodamin. Representative mikroskopiske bilder av leukocytter rekruttering av eGFP leukocytter og rhodamin merket leukocytter fra n = 3 dyr hver. Rullende nøytrofiler som uttrykker eGFP under lys-promotoren fra lys-eGFP transgene mus, kan oppdages direkte ved immunofluorescerende mikroskopi (venstre kolonne). Leukocytter uten fluorescerende beslutningstakere kan være farget ved intravenøs eller intraperitoneal injeksjon av rhodamin (høyre kolonne). Spesielt er rhodamin ikke utelukkende tatt opp av nøytrofiler, noe som gir betydelig mer bakgrunn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av leukocytterrekruttering i ulike transgene og ville musestammer. (A) Rullefluksfraksjon, (B) adhesjon og (C) transmigrasjon av leukocytter sammenlignes mellom svart 6 (C57BL/6J), svart 10 (C57BL/10ScSnJ) og mdx mus (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), vist som gjennomsnittlig + SEM. Black 6 mus viser forbedret leukocytter rekruttering sammenlignet med svart 10 mus. På samme måte har mdx-mus større rekruttering sammenlignet med svart 10, men ikke sammenlignet med svarte 6 ville type mus. Disse dataene viser viktigheten av å tildele korrekte genetiske kontroller. Data fra minst n = 3 dyr per gruppe. Statistisk analyse på en vei ANOVA med Tukeys posthoc-analyse. Betydning ble satt til P < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mus belastning | nei. av mus | nei. av venules | Fartøyets diameter | Midtlinje hastighet | Veggskjærhastighet | Systemisk WBC |
| N | N | Μm | μm/s | S-1 | /μl (andre er i seg selv) | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| i 2009 ble det | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tabell 1: Relevante hemodynamiske og mikrovaskulære parametere fra to forskjellige transgene muselinjer. Fartøyets diameter, senterlinjehastighet, veggskjærhastighet og systemiske WBCer vises for mdx-mus som mangler dystrophin og lys-eGFP-mus. I dette eksemplet mdx mus (C57BL/10J, svart 10 bakgrunn) og lys-eGFP mus (C57BL/6J, svart 6 bakgrunn) viser statistisk forskjellig midtlinje hastighet og vegg skjær hastighet og bør ikke sammenlignes ved hjelp av IVM. Eksemplariske data fra minst n = 3 dyr per gruppe presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Statistisk analyse ved uparet t-test med Welchs korreksjon. Betydning ble satt til P < 0,05.
Supplerende video 1: Mikroskopisk effekt av utilstrekkelig fjerning av bindevev på cremaster muskel. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsvideo 2: Endret blodstrøm ved enten hypervolemi eller hypotensjon. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVM som en metode har blitt mye brukt til å studere ulike celletyper i forskjellige organer og har blitt grundig beskrevet og diskutert19. Hovedmålet med denne studien er å gi en effektiv tilnærming til å sette opp og utføre IVM i cremaster muskelen. Praktisere metoden vil gi pålitelige og reproduserbare resultater. Dermed er planlegging og standardisering viktige faktorer for å mestre teknikken. Fremfor alt er teknikken svært avhengig av hemodynamiske og mikrovaskulære parametere, som må overvåkes nøye og kontrolleres for. Som sådan vil ulike hemodynamikk mellom grupper gi villedende resultater.
Til tross for sin rolle i å studere fysiologiske og patologiske forhold, kan IVM alene ikke helt rakne individuelle bidrag av spesifikke celletyper til leukocytterrekruttering i betennelse. For å gjøre dette kan andre komplementære metoder kombineres med IVM. For eksempel kan ex vivo-metoder som flytkammereksperimenter avgrense mellom effekter av endotelet eller leukocytter. Også flytkamre er gode oppsett for å oversette gnagerfunn til menneskelige leukocytter, for eksempel hos nyfødte spedbarn20. Videre bør in vitro-metoder som FACS eller immunohistokjemi utfylle IVM-eksperimenter. Hver metode kan legge til spesifikk informasjon hentet fra et kontrollert miljø med små forvirrende faktorer.
Det traumatiske cremasterpreparatet som presenteres her, ligner fysiologiske grunnsammenhenger for betennelse så nært som mulig. Likevel er det obligatoriske kirurgiske preparatet i seg selv en stimulans av betennelse, som må vurderes for tolkning. Farmakologisk TNF stimulering av cremaster vev kan gi en ekstra modus for å øke inflammatorisk rekruttering utover traumatisk kirurgisk stimulans16. Videre kan ulike musestammer vise endrede svar mot standardiserte stimuli. Vi har vist at selv vanlige villtypestammer kan vise ulike baseline tilstander av leukocytter rekruttering. Dette viser viktigheten av å tildele riktige genetiske kontroller, og etablere baselinedata for nye eksperimentelle grupper når du planlegger eksperimenter. Som transgene stammer er svært rikelig i disse dager, er det sannsynlig at selv samme stammer kan variere over tid avhengig av avl.
Tatt sammen er IVM et kraftig verktøy for å overvåke leukocytter rekruttering i den biologiske konteksten av musen og bør ledsages med ex vivo og in vitro teknikker. Videre tillater cremaster IVM en rekke forskjellige moduser, inkludert spesifikk cellefarging, inflammatorisk stimulering eller farmakologisk manipulasjon og forbehandling. Som sådan kan det tjene som en plattform for å evaluere ulike farmakologiske meklere og deres biologiske effekter i prekliniske studier, spesielt innen betennelse og mer spesifikt i inflammatoriske muskulittater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF) 01GL1746E som en del av PRIMAL Consortium. Forfatterne anerkjenner Britta Heckmann og Silvia Pezer for dyktig teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
