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Immunology and Infection

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

Published: April 15, 2020 doi: 10.3791/60509
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Abstract

A microscopia intravital (IVM) é amplamente utilizada para monitorar processos fisiológicos e fisiopatológicos dentro da cascata de recrutamento de leucócitos in vivo. O protocolo atual representa um método prático e reprodutível para visualizar a interação com o endotélio leucócito, levando ao recrutamento de leucócitos no tecido derivado do músculo esquelético dentro do organismo intacto do camundongo. O modelo é aplicável a todos os campos de pesquisa que se concentram na ativação de granulócitos e seu papel na doença.

Fornecemos um protocolo passo a passo para orientar através do método e destacar possíveis armadilhas e dificuldades técnicas. O protocolo abrange os seguintes aspectos: configurações experimentais e material necessário, anestesia do camundongo, dissecção do músculo cremaster, bem como cânula traqueal e carótida, gravações ivm e análise off-line. Formatos de dados como leucócitos aderentes, fluxo de rolamento (RF) e fração de fluxo de rolamento (RFF) são explicados detalhadamente e aplicativos apropriados são discutidos. Os resultados representativos dos camundongos mdx deficientes de distrofina são fornecidos na seção de resultados.

O IVM é uma ferramenta poderosa para avaliar o recrutamento de leucócitos em um ambiente in vivo; no entanto, delinear, por exemplo, a função endotelial e leucócito pode exigir uma combinação com configurações ex-vivo, como experimentos de câmara de fluxo. Além disso, o histórico genético de animais de interesse pode influenciar muito o recrutamento de base, exigindo ajuste fino individual do protocolo fornecido. Apesar de suas limitações, o IVM pode servir como uma plataforma para traduzir prontamente achados in vitro em um organismo vertebrado vivo.

Introduction

A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta comumente aplicada no campo da biologia leucócito. O recrutamento de leucócitos segue uma cascata de eventos bem definidos iniciados pela captura de leucócitos, rolamento e adesão à parede endotelial, e finalmente transmigração e extravasação de leucócitos para o local real de inflamação1. Cada passo é mediado e controlado por várias quimiocinas (por exemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por exemplo, LFA-1, Mac-1) e moléculas de adesão celular endotelial correspondentes (por exemplo, ICAM-1, VCAM-1 e E-Selectin)2,3. A interação de diferentes locais reguladores, fatores de controle e mediadores da cascata de recrutamento de leucócitos como receptor de produtos finais de glicação avançada (RAGE), molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), liga de motivos C-X-C (CXCL)1/2 e seu receptor CXCR2 foram descobertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.

O método do IVM tem sido descrito para muitos órgãos e tecidos diferentes, como o intestino10,pele11,linfonodos12,o saco de gema embrionária13 e outros. No entanto, o método mais estudado do IVM é o modelo cremaster, descrito pela primeira vez em ratos14. Embora ainda seja usado em ratos15,o método é hoje aplicado principalmente em camundongos devido à alta abundância de diferentes linhas transgênicas. Nosso grupo destacou recentemente o papel potencial do cremaster IVM no campo das muscolopatias inflamatórias como a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) estudando camundongos mdx deficientes de distrofina16. Devido à sua fina composição de fibras entrelaçadas e de fácil acesso, o músculo cremaster representa o músculo candidato ideal a ser estudado como um conjunto de montagem usando microscopia leve ou fluorescente. O recrutamento e extravasação de leucócitos ocorre principalmente em venules pós-capilar, que podem ser facilmente identificados em uma camada muscular contínua no músculo cremaster.

A vantagem da imagem in vivo em comparação com outros ensaios in vitro é seu contexto biológico em um organismo vivo. Ao mesmo tempo, delinear contribuições específicas de células para o recrutamento alterado de leucócitos pode exigir modelos adicionais in vitro, como câmaras de fluxo ou ensaios endoteliais. A combinação de múltiplos métodos produzirá dados mais convincentes. Os cientistas devem estar cientes das limitações do modelo cremaster, pois qualquer manipulação cirúrgica levará ao aumento do tráfico e recrutamento de leucócitos. Portanto, o recrutamento de base é difícil de estimar com este método. Apesar de sua ampla aplicação, o IVM do cremaster pode ser desafiador e uma nova configuração pode levar tempo e recursos para estabelecer. Agora fornecemos um protocolo fácil que ajudará a evitar alguns dos erros comuns no IVM. Além disso, serão discutidas limitações e os métodos complementares serão destacados quando aplicável.

O IVM do cremaster representa uma abordagem ideal a ser implementada no campo dos estudos inflamatórios e infecciosos. Mais especificamente, o modelo cremaster pode ser de alto interesse para os cientistas que estudam biologia muscular esquelética no contexto da doença inflamatória.

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Protocol

Os animais foram alojados sob condições controladas e específicas sem patógenos no IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo IRB local e pelo Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemanha.

1. Administração de anestesia

  1. Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal (i.p.) de 125 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina.
  2. Coloque e fixar o mouse em uma posição dorsais reclinada em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse (36,5-38 °C). Use uma sutura estéril não absorvível (6/0) para enrolar um laço simples ao redor dos dentes frontais e fixar as extremidades de junção da sutura à almofada de aquecimento. Esta fixação visa manter a boca aberta, a fim de evitar distúrbios respiratórios.
  3. Verifique se o mouse tem a profundidade apropriada da anestesia por meio de uma pitada interdigital do dedo do dedo (a retirada não deve ser vista).
  4. Uma vez que a anestesia suficiente é alcançada, prossiga para a preparação cirúrgica. Confirmar repetidamente a anestesia ao longo do experimento em andamento a cada 30 min. Re-administrar drogas como descrito acima, se necessário.
  5. Solução de sal fisiológico equilibrado (PSS, composição: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) com 5% de CO2/95% N2 durante 15 minutos. Bolha contínua pss com 5% CO2/95% N2 durante todo o experimento e manter a 37 °C.

2. Preparação cirúrgica da traqueia e artéria carótida (opcional)

  1. Disseque a pele da área do pescoço puxando suavemente a pele com pinças na linha média. Use uma tesoura para aplicar um corte circular de 1-2 cm de diâmetro para dar espaço suficiente para a preparação cirúrgica.
  2. Disseque cuidadosamente os tecidos musculares, gorduras e conjuntivos ao redor usando pinças.
  3. Faça um corte transversal (~ 1,3 mm) na traquéia usando uma pequena tesoura cirúrgica e introduza um tubo de polietileno (I.D. x O.D. 0,034" x 0,050") dentro da extremidade caudal da traqueia para fixar as vias aéreas superiores.
  4. Fixar o tubo localizado na traqueia por uma única sutura circular (6/0 USP).
  5. Localize a artéria carótida ao longo do lado direito da traqueia e disseque o tecido circundante da parede da artéria carótida. Alternativamente, a jugular ou também a veia traseira poderia ser usada para acesso i.v. Tente evitar lesões no nervo vagal, pois ele está localizado de perto.
  6. Passe duas peças de sutura (6/0) por baixo da artéria carótida. Coloque a primeira sutura craniana proximal, perto da bifurcação das artérias carótidas e amarre-a permanentemente. A segunda sutura será localizada a cerca de 5-8 mm distal da primeira e depois será usada para fixar o tubo na artéria carótida. Não amarre ainda.
  7. Prepare um tubo de polietileno (I.D. x O.D. 0,011" x 0,024") com um comprimento de 30 cm, dobrando a parte final a uma agulha de seringa de 1 mL cheia de salina (0,9% NaCl). Descarga rigorosa é importante para evitar a embolização do ar durante a preparação.
  8. Use um grampo de vaso de 7 mm para fixar a artéria carótida distalmente da segunda sutura.
  9. Realize um pequeno corte transversal (~0,5 mm) na artéria carótida e introduza o tubo de polietileno estéril. Fixar o tubo na artéria usando a segunda sutura preparada antes.
  10. Remova o clipe do vaso e aplique delicadamente um pouco de tensão na seringa conectada ao tubo de polietileno. Este cateter carótida agora pode ser usado para administrar drogas ou colher amostras de sangue, se necessário, até mesmo o monitoramento da pressão arterial ou da freqüência de pulso é possível com os respectivos dispositivos.

3. Preparação cirúrgica do músculo cremaster

  1. Transfira o mouse na almofada de aquecimento (juntamente com a almofada de aquecimento) para a estrutura de plástico feita sob medida que segura o palco para microscopia posterior. Oriente o rato com seu escroto voltado para o estágio do microscópio.
    1. Reavaliar a profundidade da anestesia antes de prosseguir; re-administrar uma dose de meio quarto a meia de anestesia, se necessário.
  2. Localize o escroto, segurando-o em sua parte mais distal usando pinças, puxe-o suavemente e corte uma seção circular de pele escrotal com cerca de 5 mm de diâmetro. Certifique-se de não prejudicar as estruturas subjacentes, como o músculo cremaster. Certifique-se de manter o tecido aberto bem hidratado com solução salina.
  3. Disseque tecido conjuntivo solto usando duas pinças e localize ambos os testículos.
  4. Segure um testículo distalmente e comece a puxá-lo suavemente, removendo o tecido conjuntivo circundante passo a passo.
  5. Uma vez que o testículo é exteriorizado, fixe sua extremidade distal para o anel de borracha ao redor do palco. Após a exteriorização, hidrate o tecido com solução salina durante todo o processo.
  6. Passo crítico: Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo sem prejudicar o músculo cremaster subjacente. O excesso de tecido conjuntivo pode obstruir a visão em microscopia posterior e pode produzir imagens embaçadas.
  7. Fixar a parte distal do testículo para baixo e abrir o músculo cremaster por um pequeno corte transversal (cerca de 1 mm), seguido de incisão longitudinal do muito distal para a extremidade proximal. Como resultado, o músculo cremaster deve abrir esfericamente. O vaso macroscopicamente visível não deve ser cortado, pois isso pode afetar a hemodinâmica.
  8. Espalhe cuidadosamente o músculo sobre o palco de vidro e fixe-o no anel de borracha. Certifique-se de não tocar ou prejudicar a região central, pois a microscopia será realizada aqui.
    Atenção: O excesso de estiramento pode obstruir o fluxo sanguíneo.
  9. Fixar o teste restante é de lado para dar acesso à região de interesse. Certifique-se de umedecer com PSS repetidamente para evitar a secagem. O músculo montado está pronto para microscopia.

4. Microscopia intravital

  1. Coloque o músculo cremaster montado no microscópio vertical e realize a microscopia usando um objetivo de 40x.
  2. Adquira dados e exporte usando espectrografia de imagem de alto throughput.
  3. Executar gravações em superfusão contínua com PSS17pré-aquecidos (35-37 °C) Aplique superfusão por um pequeno tubo que foi colado ao objetivo vertical do microscópio para permitir gotejamento contínuo de PSS ao lado do objetivo até o tecido muscular.
  4. Identificar venulos pós-capilar (confluência de dois vasos menores) e medir a microcirculação em venos com diâmetro de 20-40 μm.
  5. Registre imagens de alta resolução da microcirculação do músculo cremaster em um intervalo de tempo de 30 s. Como pode haver uma leve contração e relaxamento do tecido muscular durante a gravação, certifique-se de ajustar continuamente o foco. Geralmente, o mouse tende a apresentar circulação estável por cerca de 2 horas. É possível adquirir várias gravações de diferentes embarcações de diferentes regiões. Um ou ambos testis podem ser usados posteriormente.
    NOTA: Como este é um modelo de inflamação, as formas comuns de indução são: aplicação sistêmica ou injeção escrotal local de mediadores pró-inflamatórios, bem como superfusão com, por exemplo, N-Formylmethionyl-leucil-fenilanilinina (fMLP). A estimulação tnf-α local é comumente usada para desencadear o recrutamento de leucócitos; A endotoxemia induzida pelo LPS é um modelo de inflamação sistêmica grave do SIRS.

5. Visualização de leucócitos

NOTA: Leucócitos aderentes e rolamentos podem ser facilmente vistos sem maior visualização. Para determinar a velocidade da linha central dos leucócitos em movimento livre, realize a coloração diferencial.

  1. Se os camundongos rotulados eGFP forem usados, analise-os diretamente por microscopia de fluorescência.
  2. Para cepas de mouse não-eGFP rotuladas, use coloração de rhodamina.
    1. Administrar a rhodamina 6G a 0,2 mg/kg de peso corporal. Doses repetidas podem ser necessárias para alcançar intensidades de coloração suficientes. Certifique-se de manter pequenos volumes, pois volumes maiores podem afetar parâmetros hemodinâmicos.
    2. Para coloração instantânea de leucócitos, administre a mancha através da artéria carótida. Se a dissecção da artéria carótida não tiver sido realizada, pode ser obtida uma coloração suficiente pela aplicação i.p. utilizando a mesma dose18. Como alternativa ao cateterismo da artéria carótida, qualquer outro cateterismo venoso pode ser realizado.
      NOTA: Tenha em mente que a coloração de rhodamina, ao contrário da rotulagem eGFP, mostra a decomposição temporal da intensidade da fluorescência, bem como um máximo de coloração global de cerca de 80% dos leucócitos em concentrações mais elevadas.
    3. Visualize livremente a rhodamina manchada de leucócitos por microscopia de fluorescência.

6. Fim do experimento

NOTA: O tempo total estimado para executar este protocolo deve ser de 90 a 150 minutos.

  1. Acabar com o experimento com eutanásia por luxação cervical.
  2. Para análises posteriores, como a transmigração, fixe o músculo cremaster em PFA enquanto ainda se estica no palco e manchado para histologia conforme necessário.

7. Análise offline

  1. Analise os seguintes parâmetros como contagens simples durante a reprodução do vídeo.
    1. Calcular fluxo de rolamento [número/min]: número de células de rolamento passando por uma linha imaginária/min
    2. Calcular adesão [número/mm2]: número de células adesivos à parede do vaso dentro do campo de visão ≥ 30 s/superfície vascular [mm2].
  2. Meça os seguintes parâmetros hemodinâmicos e microvasculares medidos utilizando-se imageJ.
    1. Calcule o diâmetro do vaso [μm] como o diâmetro da parede interna.
    2. Calcule o comprimento do vaso [μm] como o comprimento da linha central do vaso.
    3. Calcule a Equation 1 velocidade da linha central obtida a partir da análise de vídeo quadro-a-quadro de leucócitos em movimento livre na linha central.
  3. Use as seguintes equações como uma estimativa.
    1. Calcular a superfície vascular em [mm2]: comprimento do vaso [μm] x diâmetro do vaso [μm] x π x 10-6.
    2. Calcular a taxa Equation 2 de cisalhamento da Equation 1 parede: 4,9 x (velocidade da linha central de 8 x x 0,625/diâmetro do vaso [μm]).
    3. Calcular a velocidade Equation 1 média do Equation 1 fluxo sanguíneo : velocidade da linha central x 0,625.
    4. Equation 4 Calcular fluxo total de leucócitos: contagem de leucócitos sistêmicos Equation 5 x (velocidade média de Equation 1 fluxo sanguíneo x 60/1000) x π x Equation 6 .
    5. Calcular fração de fluxo de rolagem [%]: fluxo de fluxo de rolagem/fluxo total de leucócitos x 100.

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Representative Results

IvM de acordo com o protocolo fornecido produzirá insights únicos sobre a cascata de recrutamento de leucócitos no músculo esquelético. A seção de resultados se concentrará nos resultados típicos obtidos pelo IVM e destacará possíveis problemas que podem encontrar.

A configuração experimental para microscopia intravital está descrita na Figura 1. A preparação do músculo cremaster e a remoção do tecido conjuntivo são cruciais para obter imagens microscópicas focadas com uma superfície uniforme. O excesso de tecido conjuntivo eventualmente leva a imagens microscópicas embaçadas (Vídeo Suplementar 1) ao realizar IVM. A Figura 2 mostra imagens microscópicas representativas que podem ser obtidas usando IVM. Primeiro, os venulos pós-capilar, que devem ter entre 20-40 μm de diâmetro, são identificados pela confluência de dois vasos menores. Apenas leucócitos aderentes e rolamentos podem ser visualizados, os leucócitos circulantes só podem ser rastreados em câmera lenta replay de vídeos gravados. O número de leucócitos aderentes é definido como leucócitos estacionários ao longo de um tempo de 30 segundos e expresso por mm2 da superfície do vaso(Figura 2). O número de leucócitos que passam por uma seção transversal previamente definida do navio é contado; velocidades de rolamento podem ser obtidas em análise off-line. A rolagem pode ser expressa como fluxo de rolamento (RF = número de células de rolamento sobre uma linha/min predefinida) ou como fração de fluxo de rolagem (RFF em % = RF /fluxo total de leucócitos passando pelo vaso). A RF é altamente dependente do número de células circulantes, enquanto a RFF é menos afetada por alterações na contagem de glóbulos brancos (CSM). Observe que, em muitos casos, a adesão e o rolamento de leucócitos estão inversamente relacionados; um alto número de leucócitos aderentes pode reduzir o pool de células de circulação livre e, assim, amortecer o rolamento de leucócitos.

Desafios técnicos e potenciais armadilhas
O músculo cremaster inclui o testículo e monta uma estrutura esférica. Para montar o músculo no estágio de gravação, é necessária uma incisão longitudinal para abrir a esfera. Isso pode afetar a microvasculatura global, uma vez que pequenos vasos podem ser cortados. Para evitar viés de alteração do fluxo sanguíneo, é aconselhável escolher a área central para reordenação. Esta área não deve ser tocada nem manipulada. Além disso, o microcauterismo pode prevenir sangramentos e alterações na hemodinâmica microvascular. O fluxo sanguíneo dos capilares circundantes geralmente fornece uma dica valiosa se a circulação é afetada devido à preparação dentro do campo de interesse. Em geral, vasos mais proximais (em direção ao corpo do camundongo) tendem a apresentar melhor microcirculação, porém a captura de imagem pode ser complicada pelo aumento do movimento e distúrbios que resultam da respiração do animal.

Para evitar que o músculo cremaster seque durante a gravação microscópica, a superfusão permanente do tecido é eminente. Umedecimento insuficiente ou interrompido resultará na secagem do tecido e na falha do experimento.

Fixação do tecido cremaster é necessário para mantê-lo esticado e no lugar. Para achatar o músculo estriado, é necessário um alongamento suave. Muito pouco estiramento resulta em tecido irregular, o que complica a microscopia, o alongamento excessivo irá restringir o fluxo sanguíneo e prejudicar o tecido. Novamente o fluxo sanguíneo capilar fornece um status confiável da condição circulatória geral do tecido. A experiência e a prática são necessárias para determinar o grau de estiramento ao montar o tecido.

Longos tempos de preparação afetarão o estado inflamatório geral do organismo e os dados de viés. Portanto, certifique-se de focar na questão do interesse enquanto projeta o experimento e mantenha os tempos de preparação tão curtos quanto necessário. Se não for necessário qualquer administração de drogas, o monitor ou os exames de sangue, uma preparação singular do tecido cremaster pode ser suficiente.

Na maioria dos cenários, diferentes grupos experimentais serão comparados com animais do tipo selvagem. É de fundamental importância garantir que os parâmetros hemodinâmicos e microvasculares sejam semelhantes entre os grupos experimentais (Tabela 1). Uma infinidade de parâmetros pode afetar o recrutamento de leucócitos in vivo, incluindo saída cardíaca, diâmetro do vaso, velocidade da linha central, taxa de cisalhamento da parede e o número de leucócitos circulantes. A Tabela 1 exibe dados de duas linhas transgênicas diferentes do mouse, o mouse mdx deficiente de distrofina e o mouse lys-eGFP (expressando eGFP sob o promotor lys em neutrófilos e macrófagos). Considerando que parâmetros como o diâmetro do vaso podem ser controlados pelo pesquisador, a velocidade central e a taxa de cisalhamento dependem da hemodinâmica do grupo experimental individual ou da cepa do camundongo. Claramente, a velocidade central e a taxa de cisalhamento da parede são significativamente diferentes entre os camundongos mdx e lys-eGFP(Tabela 1)tornando impossível a comparação significativa dos dados ivm (análise estatística por t-teste com correção de Welch, significância foi definida em P < 0,05). A velocidade da linha central é influenciada pela saída cardíaca, resistência vascular periférica e volume intravasal. Por exemplo, um grande volume de rhodamina ou qualquer outra substância experimental dada através do cateter carótida aumenta a velocidade da linha central pós-capilar e inibe a captura e o rolamento de leucócitos(Vídeo Suplementar 2). Pelo contrário, insuficiência cardíaca, anestesia profunda ou hipotermia podem diminuir o fluxo pós-capilar. Antes de abordar a análise off-line dos dados ivm, devem ser definidos os requisitos de qualidade dos dados (por exemplo, parâmetros hemodinâmicos dentro das faixas fisiológicas), a fim de tirar conclusões significativas e reduzir o viés.

Para determinar a velocidade da linha central, os leucócitos de circulação livre precisam ser visualizados. Ou, os leucócitos fluorescentes (como em camundongos lys-eGFP) podem ser usados ou os leucócitos devem ser dinares com reagentes fluorescentes como a rhodamina(Figura 3). A rhodamina pode ser aplicada através do cateter carótida ou como uma injeção i.p. Uma vez que a rhodamina é gradualmente tomada por outros tipos de células também, uma titulação de dosagem e tempo é essencial. O excesso de dosagem e intervalos longos produzirão um fundo significativo durante a microscopia.

Finalmente, gostamos de apontar a diversidade biológica de diferentes cepas de camundongos. Além das cepas geneticamente alteradas, também cepas de tipos selvagens geralmente aceitas podem apresentar variância fisiológica. A Figura 4 compara camundongos pretos comumente empregados 6 (C57BL/6) com os camundongos pretos 10 (C57BL/10ScSn). Os camundongos negros 6 mostram claramente a rolagem, a adesão e transmigração aprimorada de leucócitos em comparação com os camundongos negros 10 (análise estatística por ANOVA unidirecional com o teste pós-hoc de Tukey; significância foi definida em P < 0,05), embora ambas as cepas sejam referidas como tipo selvagem. Portanto, deve-se considerar o histórico genético correto, especialmente quando se utiliza camundongos transgênicos. Em nosso cenário experimental, uma comparação de camundongos pretos 6 e camundongos mdx transgênicos (fundo preto 10) esconderia em grande parte o estado inflamatório aprimorado de camundongos mdx deficientes de distrofina sobre seu fundo de tipo selvagem 10 preto(Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Configuração experimental esquemática de IVM no músculo cremaster. Após a anestesia, a traqueia é canonizada e um cateter é colocado na artéria carótida. O músculo cremaster é exposto e preparado para microscopia intravital em um microscópio vertical usando microscopia de luz ou microscopia fluorescente. Os vídeos são obtidos para análise offline posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Segmento representativo de venule pós-capilar a partir de microscopia intravital com quadros seqüenciais. A coluna esquerda mostra imagens microscópicas leves, para melhor visualização o vaso é delineado com linhas pontilhadas. O venule é identificado por vasos confluentes (marcados por asteriscos vermelhos) e um diâmetro de navio de <40 μm. A coluna direita retrata uma representação esquemática da imagem esquerda correspondente, mostrando leucócitos em vermelho. As quatro primeiras linhas mostram imagens sequenciais do mesmo navio ao longo do tempo. A linha inferior indica leucócitos aderentes. Na representação esquemática, os leucócitos individuais e sua distância de rolamento são marcados. Na análise offline pode ser calculada a adesão à análise offline por milímetro quadrado, pode-se calcular o fluxo de rolagem, bem como a velocidade de rolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Os leucócitos de rolamento podem ser visualizados por expressão transgênica de marcadores fluorescentes ou por coloração secundária com rhodamina. Imagens microscópicas representativas do recrutamento de leucócitos de leucócitos egfp e rhodamina rotuladas de leucócitos de n = 3 animais cada. Os neutrófilos que expressam eGFP sob o promotor lys-eGFP transgênicos podem ser detectados diretamente por microscopia imunofluorescente (coluna esquerda). Leucócitos sem fabricantes fluorescentes podem ser manchados por injeção intravenosa ou intraperitoneal de rhodamina (coluna direita). Notavelmente, a rhodamina não é exclusivamente tomada por neutrófilos, dando substancialmente mais fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparação do recrutamento de leucócitos em diferentes cepas transgênicas e selvagens de camundongos. (A)Fração de fluxo de rolagem, (B) adesão e (C) transmigração de leucócitos é comparada entre preto 6 (C57BL/6J), preto 10 (C57BL/10ScSnJ) e camundongos mdx (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), mostrados como média + SEM. Os 6 ratos mostram melhor recrutamento de leucócitos em comparação com os ratos pretos 10. Da mesma forma, os camundongos mdx têm maior recrutamento em comparação com os 10 negros, mas não comparados com ratos do tipo preto 6 selvagem. Esses dados demonstram a importância de alocar controles genéticos corretos. Dados de pelo menos n = 3 animais por grupo. Análise estatística por ANOVA unidirecional com a análise pós-hoc de Tukey. A significância foi definida em P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cepa de rato Não. de ratos Não. de venules Diâmetro do vaso Velocidade da linha central Taxa de cisalhamento de parede WBC sistêmico
N N Μm μm/s s-1 /μl
Mdx 3 12 28 ± 4 1150 ± 50 1010 ± 100 5200 ± 300
lys-eGFP 3 15 27 ± 2 2220 ± 90 2030 ± 90 5800 ± 100
P 0.83 0.0005 0.0016 0.13

Tabela 1: Parâmetros hemodinâmicos e microvasculares relevantes de duas linhas transgênicas diferentes de camundongos. Diâmetro do vaso, velocidade da linha central, taxa de cisalhamento da parede e WBCs sistêmicos são exibidos para ratos mdx sem distrofina e lys-eGFP. Neste exemplo, os ratos mdx (C57BL/10J, fundo preto 10) e os ratos lys-eGFP (C57BL/6J, fundo preto 6) mostram estatisticamente diferentes velocidade central e taxa de cisalhamento de parede e não devem ser comparados usando IVM. Dados exemplares de pelo menos n = 3 animais por grupo são apresentados como média ± SEM. Análise estatística por t-teste não pareado com a correção de Welch. A significância foi definida em P < 0,05.

Vídeo suplementar 1: Efeito microscópico da remoção insuficiente do tecido conjuntivo no músculo cremaster. Clique aqui para ver este vídeo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

Vídeo suplementar 2: Fluxo sanguíneo alterado por hipervolemia ou hipotensão. Clique aqui para ver este vídeo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

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Discussion

O IVM como método tem sido amplamente utilizado para estudar diferentes tipos de células em diferentes órgãos e tem sido extensivamente descrito e discutido19. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma abordagem eficiente para configurar e executar ivm no músculo cremaster. A prática do método produzirá resultados confiáveis e reprodutíveis. Assim, o planejamento e a padronização são fatores-chave para dominar a técnica. Acima de tudo, a técnica é muito dependente de parâmetros hemodinâmicos e microvasculares, que precisam ser monitorados de perto e controlados. Como tal, diferentes hemodinâmicas entre grupos produzirão resultados enganosos.

Apesar de seu papel no estudo de condições fisiológicas e patológicas, o IVM sozinho pode não desvendar totalmente a contribuição individual de tipos celulares específicos para o recrutamento de leucócitos na inflamação. Para isso, outros métodos complementares podem ser combinados com IVM. Por exemplo, métodos ex vivo como experimentos de câmara de fluxo podem delinear entre efeitos do endotélio ou do leucócito. Além disso, as câmaras de fluxo são excelentes configurações para traduzir achados de roedores para leucócitos humanos, por exemplo, em recém-nascidos20. Além disso, métodos in vitro como FACS ou imunohistoquímica devem complementar experimentos ivm. Cada método pode adicionar informações específicas adquiridas de um ambiente controlado com poucos fatores de confusão.

A preparação traumática do cremaster apresentada aqui se assemelha às condições fisiológicas de inflamação o mais próximo possível. No entanto, a preparação cirúrgica obrigatória em si é um estímulo de inflamação, que deve ser considerado para interpretação. A estimulação farmacológica tnf do tecido cremaster pode fornecer um modo adicional para impulsionar o recrutamento inflamatório além do estímulo cirúrgico traumático16. Além disso, diferentes cepas de camundongos podem apresentar respostas alteradas em relação a estímulos padronizados. Nós demonstramos que mesmo cepas selvagens comuns podem exibir diferentes estados de base de recrutamento de leucócitos. Isso mostra a importância de atribuir controles genéticos corretos e estabelecer dados de linha de base para novos grupos experimentais ao planejar experimentos. Como as cepas transgênicas são altamente abundantes nos dias de hoje, é provável que mesmo as mesmas cepas possam diferir ao longo do tempo dependendo da reprodução.

Em conjunto, o IVM é uma poderosa ferramenta para monitorar o recrutamento de leucócitos no contexto biológico do camundongo e deve ser acompanhado com técnicas ex vivo e in vitro. Além disso, o cremaster IVM permite uma variedade de diferentes modos, incluindo coloração celular específica, estimulação inflamatória ou manipulação farmacológica e pré-tratamento. Como tal, pode servir como uma plataforma para avaliar diferentes mediadores farmacológicos e seus efeitos biológicos em estudos pré-clínicos especialmente no campo da inflamação e mais especificamente em musculopatias inflamatórias.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) 01GL1746E como parte do Consórcio PRIMAL. Os autores reconhecem Britta Heckmann e Silvia Pezer por uma assistência técnica habilidosa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Ketanest S Pfizer Pharma GmbH PZN: 08509909 anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine
Xylazine CP-Pharma GmbH Article-nr.: 1205  anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)
Saline Solution B. Braun Melsungen  PZN 02737756 surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride
Syringe needle Omnican F B. Braun Melsungen  REF 9161502 surgical preparation 
Suture 6/0 USP Resorba REF 4217 surgical preparation 
Polyethylene tube #10  BD GmbH Supplier No. 427401 surgical preparation 
Polyethylene tube #90  BD GmbH Supplier No. 427421 surgical preparation 
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich Chemie GmbH CAS Number 989-38-8  leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
Setup Equipment
Upright microscope  Olympus  BX51W1 microscopy
40-fold objective  Zeiss Achroplan 40 × /0.80 W microscopy
ImSpector software Lavision Biotec GmbH ver. 4.0.469 software
ImageJ National Institute of Health, USA ver. 1.51j8 software

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References

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Imunologia e Infecção Problema 158 Microscopia Intravital Leucócitos Cremaster Adesão Inflamação Músculo Esquelético mdx
Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital
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Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada,More

Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada, R., Braun, M., Kuss, N., Pöschl, J., Hudalla, H. Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (158), e60509, doi:10.3791/60509 (2020).

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