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Immunology and Infection

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

Published: April 15, 2020 doi: 10.3791/60509
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Abstract

La microscopía intravital (IVM) se utiliza ampliamente para monitorear los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El protocolo actual representa un método práctico y reproducible para visualizar la interacción del leucocito endotelio que conduce al reclutamiento de leucocitos en el tejido derivado del músculo esquelético dentro del organismo intacto del ratón. El modelo es aplicable a todos los campos de investigación que se centran en la activación de granulocitos y su papel en la enfermedad.

Proporcionamos un protocolo paso a paso para guiar a través del método y resaltar posibles escollos y dificultades técnicas. El protocolo cubre los siguientes aspectos: ajustes experimentales y material requerido, anestesia del ratón, disección del músculo cremaestro, así como cánula traqueal y carótida, grabaciones de IVM y análisis fuera de línea. Los formatos de datos como leucocitos adherentes, flujo rodante (RF) y fracción de flujo rodante (RFF) se explican en detalle y se discuten las aplicaciones adecuadas. Los resultados representativos de los ratones mdx con deficiencia de distrofina se proporcionan en la sección de resultados.

IVM es una poderosa herramienta para evaluar el reclutamiento de leucocitos en un entorno in vivo; sin embargo, la delinear, por ejemplo, la función endotelial y leucocito puede requerir una combinación con configuraciones ex vivo como experimentos de cámara de flujo. Además, los antecedentes genéticos de los animales de interés pueden influir en gran medida en el reclutamiento de líneas de base, lo que requiere una afinación individual del protocolo proporcionado. A pesar de sus limitaciones, IVM puede servir como una plataforma para traducir fácilmente los hallazgos in vitro en un organismo vertebrado vivo.

Introduction

La microscopía intravital (IVM) es una herramienta comúnmente aplicada en el campo de la biología de leucocitos. El reclutamiento de leucocitos sigue una cascada de eventos bien definidos iniciados por la captura de leucocitos, laminación y adhesión a la pared endotelial, y finalmente la transmigración y extravasación de leucocitos al sitio real de la inflamación1. Cada paso está mediado y controlado por varias quimioquinas (por ejemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por ejemplo, LFA-1, Mac-1) y las moléculas de adhesión de células endoteliales correspondientes (por ejemplo, ICAM-1, VCAM-1 y E-Selectin)2,3. La interacción de diferentes sitios reguladores, factores de control y mediadores de la cascada de reclutamiento de leucocitos como receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), ligando de motivo C-X-C (CXCL)1/2 y su receptor CXCR2 fueron descubiertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.

El método de La iVM se ha descrito para muchos órganos y tejidos diferentes como el intestino10,la piel11,los ganglios linfáticos12,el saco de yema embrionaria13 y otros. Sin embargo, el método más ampliamente estudiado de IVM es el modelo cremaster, descrito por primera vez en ratas14. Mientras que todavía se utiliza en ratas15, el método se aplica hoy en día principalmente en ratones debido a la alta abundancia de diferentes líneas transgénicas. Nuestro grupo ha destacado recientemente el papel potencial de la iVM de cremaster en el campo de las muscolopatías inflamatorias como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) estudiando ratones mdx deficientes en distrofina16. Debido a su composición delgada entretejida y de fácil acceso de fibra, el músculo cremaestro representa el músculo candidato ideal para ser estudiado como un montaje completo utilizando la microscopía ligera o fluorescente. El reclutamiento y la extravasación de leucocitos se llevan a cabo principalmente en los ventosos post-capilares, que se pueden identificar fácilmente en una capa muscular continua en el músculo cremaestro.

La ventaja de la imagen in vivo en comparación con otros ensayos in vitro es su contexto biológico en un organismo vivo. Al mismo tiempo, la delinear contribuciones específicas de las células al reclutamiento alterado de leucocitos puede requerir modelos in vitro adicionales como cámaras de flujo o ensayos endoteliales. La combinación de múltiples métodos producirá datos más convincentes. Los científicos deben ser conscientes de las limitaciones del modelo cremaster, ya que cualquier manipulación quirúrgica conducirá a un aumento del tráfico y reclutamiento de leucocitos. Por lo tanto, el reclutamiento de referencia es difícil de estimar con este método. A pesar de su amplia aplicación, IVM del cremaster puede ser difícil y una configuración novedosa puede tomar tiempo y recursos para establecer. Ahora proporcionamos un protocolo fácil que ayudará a evitar algunos de los errores comunes en IVM. Además, se discutirán las limitaciones y se resaltarán los métodos complementarios cuando corresponda.

IVM del cremaster representa un enfoque ideal para ser implementado en el campo de los estudios inflamatorios e infecciosos. Más específicamente, el modelo cremaster puede ser de alto interés para los científicos que estudian la biología del músculo esquelético en el contexto de la enfermedad inflamatoria.

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Protocol

Los animales fueron alojados bajo condiciones controladas y específicas libres de patógenos en el IBF (Interfakult-re Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el IRB local y el Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Alemania.

1. Administración de anestesia

  1. Anestetizar el ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de bolo de 125 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina.
  2. Coloque y fije el ratón en una posición dorsal reclinada en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal del ratón (36,5-38 oC). Utilice una sutura estéril no absorbible (6/0) para enrollar un simple bucle alrededor de los dientes frontales y tape los extremos de unión de la sutura a la almohadilla de calentamiento. Esta fijación tiene como objetivo mantener la boca abierta con el fin de evitar perturbaciones en la respiración.
  3. Compruebe que el ratón esté en la profundidad adecuada de la anestesia mediante pellizco interdigital del dedo del dedo del dedo del dedo del sol (no se debe ver la retirada).
  4. Una vez que se alcanza suficiente anestesia proceder a la preparación quirúrgica. Confirme repetidamente la anestesia a lo largo del experimento en curso cada 30 minutos. Vuelva a administrar los medicamentos como se describió anteriormente si es necesario.
  5. Solución de sal fisiológica de equilibrio (PSS, composición: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) con 5% CO2/95% N2 durante 15 minutos. Burbuja continuaps con 5% CO2/95% N2 a lo largo del experimento y mantener a 37 oC.

2. Preparación quirúrgica de la tráquea y la arteria carótida (opcional)

  1. Disecciona la piel de la zona del cuello tirando suavemente de la piel con pinzas en la línea media. Utilice tijeras para aplicar un corte circular de 1-2 cm de diámetro para dar suficiente espacio para la preparación quirúrgica.
  2. Disecciona cuidadosamente el músculo circundante, la grasa y los tejidos conectivos usando pinzas.
  3. Haga un corte transversal (1,3 mm) en la tráquea utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas e introduzca un tubo de polietileno (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") dentro del extremo caudal de la tráquea para asegurar las vías respiratorias superiores.
  4. Fijar el tubo situado en la tráquea por una sola sutura circular de nudo (6/0 USP).
  5. Localice la arteria carótida a lo largo del lado derecho de la tráquea y diseque el tejido circundante de la pared de la arteria carótida. Alternativamente, la yugular o también la vena de la cola podría ser utilizada para el acceso i.v. Trate de evitar lesiones en el nervio vagal, ya que se encuentra de cerca.
  6. Pasar dos piezas de sutura (6/0) debajo de la arteria carótida. Coloque la primera sutura craneal proximal, cerca de la bifurcación de las arterias carótidas y atarla permanentemente. La segunda sutura se ubicará a unos 5-8 mm de distal de la primera y más tarde se utilizará para asegurar el tubo en la arteria carótida. No lo ates todavía.
  7. Preparar un tubo de polietileno (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") con una longitud de 30 cm doblando la parte final a una aguja de jeringa de 1 ml llena de salina (0,9% NaCl). El lavado riguroso es importante para evitar la embolización de aire durante la preparación.
  8. Utilice un clip de recipiente de 7 mm para sujetar la arteria carótida distalmente de la segunda sutura.
  9. Realice un pequeño corte transversal (0,5 mm) en la arteria carótida e introduzca el tubo de polietileno estéril. Fije el tubo en la arteria usando la segunda sutura preparada antes.
  10. Retire el clip del recipiente y aplique suavemente un poco de tensión a la jeringa conectada al tubo de polietileno. Este catéter carótida ahora se puede utilizar para administrar medicamentos o tomar muestras de sangre si es necesario, incluso es posible controlar la presión arterial o la frecuencia del pulso con los dispositivos respectivos.

3. Preparación quirúrgica del músculo cremaestro

  1. Transfiera el ratón en la almohadilla de calentamiento (junto con la almohadilla de calentamiento) al marco de plástico hecho a medida que sostiene el escenario para la microscopía posterior. Oriente el ratón con su escroto mirando hacia la etapa del microscopio.
    1. Reevaluar la profundidad de la anestesia antes de continuar; volver a administrar una dosis de anestesia de cuarto a medio si es necesario.
  2. Localizar el escroto, sosteniéndolo en su parte más distal usando pinzas, tirar suavemente y cortar una sección circular de la piel escrotal con aproximadamente 5 mm de diámetro. Asegúrese de no dañar las estructuras subyacentes como el músculo cremaestro. Asegúrese de mantener el tejido abierto bien hidratado con solución salina.
  3. Diseccione el tejido conectivo suelto con dos pinzas y localice ambas testículos.
  4. Sostenga un testículo distalmente y comience a sacarlo suavemente, eliminando el tejido conectivo circundante paso a paso.
  5. Una vez que el testis está exteriorizado, fijar su extremo distal al anillo de goma que rodea el escenario. Tras la exteriorización, hidratar el tejido con solución salina durante todo el proceso.
  6. Paso crítico: Retire cuidadosamente el tejido conectivo sin dañar el músculo cremaestro subyacente. El exceso de tejido conectivo puede obstruir la visión en la microscopía posterior y puede producir imágenes borrosas.
  7. Ancle la parte distal del testis hacia abajo y abra el músculo cremaestro con un pequeño corte transversal (aproximadamente 1 mm), seguido de una incisión longitudinal desde el extremo distal hasta el extremo proximal. Como resultado, el músculo cremaster debe abrirse esféricamente. El recipiente visible macroscópicamente no debe ser cortado, ya que esto puede afectar a la hemodinámica.
  8. Extienda cuidadosamente el músculo sobre la etapa de vidrio y anclelo al anillo de goma. Asegúrese de no tocar o dañar la región central, ya que la microscopía se realizará aquí.
    Precaución: El exceso de estiramiento puede obstruir el flujo sanguíneo.
  9. Ancle el testis restante a un lado para dar acceso a la región de interés. Asegúrese de humedecer con PSS repetidamente para evitar el secado. El músculo montado ya está listo para la microscopía.

4. Microscopía intravital

  1. Coloque el músculo cremaestro montado en el microscopio vertical y realice la microscopía utilizando un objetivo de 40x.
  2. Adquiera datos y exporte utilizando espectrografía de imágenes de alto rendimiento.
  3. Realizar grabaciones bajo superfusión continua con PSS17precalentado (35-37 oC). Aplicar la superfusión por un pequeño tubo que ha sido pegado al objetivo vertical del microscopio para permitir el goteo continuo de PSS junto con el objetivo hacia abajo sobre el tejido muscular.
  4. Identificar los venudios post-capilares (confluencia de dos vasos más pequeños) y medir la microcirculación en los venáculos con un diámetro de 20-40 m.
  5. Grabar imágenes de alta resolución de la microcirculación desde el músculo cremaestro en un rango de tiempo de 30 s. Como puede haber una ligera contracción y relajación del tejido muscular durante la grabación, asegúrese de ajustar continuamente el enfoque. Generalmente, el ratón tiende a exhibir una circulación estable durante aproximadamente 2 horas. Es posible adquirir varias grabaciones de diferentes buques de diferentes regiones. Uno o ambos testículos se pueden utilizar posteriormente.
    NOTA: Como se trata de un modelo de inflamación, las formas comunes de inducción son: aplicación sistémica o inyección escrotal local de mediadores pro inflamatorios, así como superfusión con por ejemplo N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). La estimulación local de TNF-- se utiliza comúnmente para desencadenar el reclutamiento de leucocitos; La endotoxemia inducida por LPS es un modelo de inflamación sistémica grave de SIRS.

5. Visualización de leucocitos

NOTA: Los leucocitos adherentes y rodantes se pueden ver fácilmente sin más visualización. Para determinar la velocidad de la línea central de los leucocitos que se mueven libremente, realice la tinción diferencial.

  1. Si se utilizan ratones etiquetados con eGFP, analícelos directamente mediante microscopía de fluorescencia.
  2. Para cepas de ratón no etiquetadas con eGFP, utilice la tinción de rodamina.
    1. Administrar rodamina 6G a 0,2 mg/kg de peso corporal. Pueden ser necesarias dosis repetidas para lograr suficientes intensidades de tinción. Asegúrese de mantener volúmenes pequeños, ya que los volúmenes más grandes pueden afectar a los parámetros hemodinámicos.
    2. Para la tinción instantánea de leucocitos, administre la mancha a través de la arteria carótida. Si no se ha realizado la disección de la arteria carótida, se puede lograr una tinción suficiente mediante la aplicación, es decir, con la misma dosis18. Como alternativa al cateterismo de la arteria carótida, se puede realizar cualquier otro cateterismo venoso.
      NOTA: Tenga en cuenta que la tinción de rodamina, a diferencia del etiquetado eGFP, muestra la decaimiento del tiempo de la intensidad de la fluorescencia, así como un máximo general de tinción de alrededor del 80% de los leucocitos a concentraciones más altas.
    3. Visualice leucocitos manchados de rodamina en movimiento libre mediante microscopía de fluorescencia.

6. Fin del experimento

NOTA: El tiempo estimado total para realizar este protocolo debe ser de 90 a 150 minutos.

  1. Terminar el experimento con la eutanasia por dislocación cervical.
  2. Para análisis posteriores, como la transmigración, fije el músculo cremaestro en PFA mientras todavía se estira en el escenario y se tiñe para la histología según sea necesario.

7. Análisis fuera de línea

  1. Analice los siguientes parámetros como recuentos simples durante la reproducción de vídeo.
    1. Calcular flujo rodante [number/min]: número de celdas rodantes que pasan por una línea imaginaria/min
    2. Calcular la adhesión [número/mm2]: número de células adhesivas a la pared del recipiente dentro del campo de visión 30 s/superficie vascular [mm2].
  2. Mida los siguientes parámetros hemodinámicos y microvasculares que se miden utilizando ImageJ.
    1. Calcule el diámetro del recipiente como el diámetro de la pared interior.
    2. Calcule la longitud del recipiente como la longitud de la línea central del recipiente.
    3. Calcule la Equation 1 velocidad de la línea central obtenida del análisis de vídeo de fotograma a fotograma de leucocitos en movimiento libre en la línea central.
  3. Utilice las siguientes ecuaciones como estimación.
    1. Calculate vascular surface in [mm2]: vessel length [μm] x vessel diameter [μm] x π x 10-6.
    2. Calcular la velocidad Equation 2 de cizallamiento de Equation 1 la pared: 4,9 x (8 x velocidad de línea central x 0,625/diámetro del recipiente [m]).
    3. Calcular la velocidad Equation 1 media del Equation 1 flujo sanguíneo: velocidad de la línea central x 0,625.
    4. Calcular Equation 4 el flujo total de leucocitos: recuento Equation 5 sistémico Equation 1 de leucocitos x (velocidad Equation 6 media de flujo sanguíneo x 60/1000) x x x .
    5. Calcular la fracción de flujo rodante [%]: flujo rodante/flujo de leucocitos total x 100.

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Representative Results

IVM según el protocolo proporcionado proporcionará información única sobre la cascada de reclutamiento de leucocitos en el músculo esquelético. La sección de resultados se centrará en los resultados típicos obtenidos por IVM y resaltará los posibles problemas que puedan surgir.

La configuración experimental para la microscopía intravital se describe en la Figura 1. La preparación del músculo cremaestro y la eliminación del tejido conectivo es crucial para obtener imágenes microscópicas enfocadas con una superficie uniforme. El exceso de tejido conectivo eventualmente conduce a imágenes microscópicas borrosas(Vídeo Suplementario 1) al realizar IVM. La Figura 2 muestra imágenes microscópicas representativas que se pueden obtener mediante IVM. En primer lugar, los ventrílos post-capilares, que deben tener entre 20-40 m de diámetro, se identifican por confluencia de dos recipientes más pequeños. Sólo se pueden visualizar leucocitos adherentes y rodantes, los leucocitos circulantes sólo pueden ser rastreados en cámara lenta de reproducción de videos grabados. El número de leucocitos adherentes se define como leucocitos estacionarios durante un tiempo de 30 segundos y se expresa por mm2 de superficie del vaso(Figura 2). Se cuenta el número de leucocitos rodantes que pasan por una sección transversal previamente definida del recipiente; las velocidades rodantes se pueden obtener en el análisis fuera de línea. La rodadura puede expresarse como flujo rodante (RF - número de células rodantes sobre una línea predefinida/min) o como fracción de flujo rodante (RFF en % - flujo de leucocitos totales/RF que pasa por el recipiente). La RF depende en gran medida del número de células circulantes, mientras que la RFF se ve menos afectada por los cambios en los recuentos de glóbulos blancos (CMB). Tenga en cuenta que en muchos casos la adherencia y la rodadura de leucocitos están relacionadas inversamente; un alto número de leucocitos adherentes puede reducir la piscina de células que circulan libremente y, por lo tanto, amortiguar la minación de leucocitos.

Desafíos técnicos y posibles escollos
El músculo cremaster encierra los testículos y ensambla una estructura esférica. Para montar el músculo en la etapa de registro, se requiere una incisión longitudinal para abrir la esfera. Esto puede afectar a la microvasculatura general, ya que los vasos pequeños pueden ser cortados. Para evitar el sesgo al flujo sanguíneo alterado, es aconsejable elegir el área central para reordenar. Esta área no debe ser tocada ni manipulada. Además, la microcauterización puede prevenir el sangrado y los cambios en la hemodinámica microvascular. El flujo sanguíneo de los capilares circundantes generalmente proporciona una valiosa pista si la circulación se ve afectada debido a la preparación dentro del campo de interés. En general, los vasos más proximales (hacia el cuerpo del ratón) tienden a mostrar una mejor microcirculación, sin embargo, la captura de imágenes puede ser complicada por el aumento del movimiento y las perturbaciones que resultan de la respiración del animal.

Para evitar que el músculo cremaestro se seque durante la grabación microscópica, la superfusión permanente del tejido es eminente. La humectación insuficiente o interrumpida dará lugar al secado del tejido y a la falla del experimento.

La fijación del tejido cremaster es necesaria para mantenerlo estirado y en su lugar. Para aplanar el músculo estriado, se requiere un estiramiento suave. El estiramiento demasiado poco resulta en tejido desigual, que complica la microscopía, el estiramiento excesivo restringirá el flujo sanguíneo y dañará el tejido. Una vez más el flujo sanguíneo capilar proporciona un estado confiable de la condición circulatoria general del tejido. Se requiere experiencia y práctica para determinar el grado de estiramiento al montar el tejido.

Los largos tiempos de preparación afectarán el estado inflamatorio general del organismo y los datos de sesgo. Por lo tanto, asegúrese de centrarse en la cuestión del interés mientras diseña el experimento y mantenga los tiempos de preparación tan cortos como sea necesario. Si no se requiere administración de medicamentos, monitor o análisis de sangre, una preparación singular del tejido cremaster puede ser suficiente.

En la mayoría de los entornos, se compararán diferentes grupos experimentales con animales de tipo salvaje. Es de vital importancia asegurarse de que los parámetros hemodinámicos y microvasculares son similares entre los grupos experimentales (Tabla 1). Una multitud de parámetros puede afectar el reclutamiento in vivo de leucocitos, incluyendo la salida cardíaca, el diámetro del vaso, la velocidad de la línea central, la tasa de cizallamiento de la pared y el número de leucocitos circulantes. La Tabla 1 muestra datos de dos líneas de ratón transgénicas diferentes, el ratón mdx con deficiencia de distrofina y el ratón lys-eGFP (expresando eGFP bajo el promotor de lys en neutrófilos y macrófagos). Mientras que los parámetros como el diámetro del recipiente pueden ser controlados por el investigador, la velocidad de la línea central y la velocidad de cizallamiento dependen de la hemodinámica del grupo experimental individual o de la tensión del ratón. Es evidente que la velocidad de la línea central y la velocidad de cizallamiento de la pared son significativamente diferentes entre los ratones mdx y lys-eGFP(Tabla 1),lo que hace imposible la comparación significativa de los datos de IVM (análisis estadístico mediante prueba t con la corrección de Welch, la significancia se estableció en P < 0,05). La velocidad de la línea central está influenciada por la salida cardíaca, la resistencia vascular periférica y el volumen intravasal. Por ejemplo, un gran volumen de rodamina o cualquier otra sustancia experimental dada a través del catéter carótida aumenta la velocidad de la línea central capilar posterior e inhibe la captura y laminación de leucocitos (Video Suplementario 2). Por el contrario, la insuficiencia cardíaca, la anestesia profunda o la hipotermia pueden disminuir el flujo post-capilar. Antes de abordar el análisis fuera de línea de los datos de IVM, deben definirse los requisitos de calidad de los datos (por ejemplo, parámetros hemodinámicos dentro de los rangos fisiológicos), con el fin de extraer conclusiones significativas y reducir el sesgo.

Para determinar la velocidad de la línea central, es necesario visualizar los leucocitos que circulan libremente. Se pueden utilizar leucocitos fluorescentes (como en ratones lys-eGFP) o los leucocitos deben ser temitizados con reactivos fluorescentes como la rodamina(Figura 3). Rhodamine se puede aplicar a través del catéter carótido o como una inyección i.p. Puesto que la rodamina se toma gradualmente por otros tipos de células, así, una valoración de la dosis y el tiempo es esencial. El exceso de dosificación y los intervalos largos producirán un fondo significativo durante la microscopía.

Por último, nos gusta señalar la diversidad biológica de diferentes cepas de ratón. Además de las cepas alteradas genéticamente, las cepas de tipo silvestre generalmente aceptadas pueden mostrar varianza fisiológica. La Figura 4 compara los ratones negros 6 (C57BL/6) comúnmente empleados con los ratones negros 10 (C57BL/10ScSn). Los ratones negros 6 muestran claramente una mayor laminación, adhesión y transmigración de leucocitos en comparación con los ratones negros 10 (análisis estadístico por ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey; la importancia se estableció en P < 0.05), aunque ambas cepas se denominarían tipo salvaje. Por lo tanto, se deben considerar los antecedentes genéticos correctos, especialmente cuando se utilizan ratones transgénicos. En nuestro entorno experimental, una comparación de 6 ratones negros y ratones mdx transgénicos (fondo negro 10) ocultaría en gran medida el estado inflamatorio mejorado de los ratones mdx deficientes de distrofina sobre su fondo negro 10 salvaje correcto(Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Configuración experimental esquemática de IVM en el músculo cremaestro. Después de la anestesia, la tráquea se canina y se coloca un catéter en la arteria carótida. El músculo cremaestro está expuesto y preparado para la microscopía intravital en un microscopio vertical utilizando microscopía de luz o microscopía fluorescente. Los vídeos se obtienen para su posterior análisis sin conexión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Segmento representativo de la venulo post-capilar de la microscopía intravital con marcos secuenciales. La columna izquierda muestra imágenes microscópicas ligeras, para una mejor visualización el recipiente se delinea con líneas punteadas. El venule se identifica mediante recipientes confluentes (marcados por asteriscos rojos) y un diámetro de recipiente de <40 m. La columna derecha representa una representación esquemática de la imagen izquierda correspondiente, que muestra los leucocitos en rojo. Las primeras cuatro filas muestran imágenes secuenciales del mismo recipiente a lo largo del tiempo. La fila inferior indica leucocitos adherentes. En la representación esquemática, se marcan los leucocitos individuales y su distancia de rodadura. En la adherencia al análisis fuera de línea por milímetro cuadrado, se puede calcular el flujo de rodadura, así como la velocidad de rodadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los leucocitos rodantes pueden visualizarse mediante la expresión transgénica de marcadores fluorescentes o por la tinción secundaria con rodamina. Imágenes microscópicas representativas del reclutamiento de leucocitos de leucocitos eGFP y radáninas etiquetadas como leucocitos de n a 3 animales cada una. Los neutrófilos rodantes que expresan eGFP bajo el promotor de lys de ratones transgénicos lys-eGFP pueden detectarse directamente mediante microscopía inmunofluorescente (columna izquierda). Los leucocitos sin fabricantes fluorescentes pueden ser manchados por inyección intravenosa o intraperitoneal de rodamina (columna derecha). En particular, la rodamina no es exclusivamente tomada por los neutrófilos, dando sustancialmente más antecedentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparación del reclutamiento de leucocitos en diferentes cepas de ratón transgénicas y silvestres. (A) Fracción de flujo rodante, (B) adhesión y (C) la transmigración de leucocitos se compara entre negro 6 (C57BL/6J), negro 10 (C57BL/10ScSnJ) y ratones mdx (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), mostrado como media + SEM. Del mismo modo, los ratones mdx tienen un mayor reclutamiento en comparación con el negro 10, pero no en comparación con los ratones negros de 6 tipos salvajes. Estos datos demuestran la importancia de asignar controles genéticos correctos. Datos de al menos n 3 animales por grupo. Análisis estadístico por ANOVA unidireccional con el análisis post-hoc de Tukey. La importancia se estableció en P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tensión de ratón No. de ratones No. de los venules Diámetro del buque Velocidad de la línea central Tasa de cizallamiento de pared WBC sistémico
N N Μm M/s s-1 /l
Mdx 3 12 28 x 4 1150 x 50 1010 a 100 5200 x 300
lys-eGFP 3 15 27 x 2 2220 x 90 2030 a 90 5800 x 100
P 0.83 0.0005 0.0016 0.13

Tabla 1: Parámetros hemodinámicos y microvasculares relevantes de dos líneas de ratón transgénicas diferentes. El diámetro del recipiente, la velocidad de la línea central, la velocidad de cizallamiento de la pared y los CMB sistémicos se muestran para ratones mdx que carecen de ratones distrofina y lys-eGFP. En este ejemplo, los ratones mdx (C57BL/10J, fondo negro 10) y los ratones lys-eGFP (C57BL/6J, fondo negro 6) muestran una velocidad de línea central y una velocidad de cizallamiento de pared estadísticamente diferentes y no deben compararse con IVM. Los datos ejemplares de al menos n 3 animales por grupo se presentan como media s SEM. Análisis estadístico mediante prueba t no emparejada con la corrección de Welch. La importancia se estableció en P < 0.05.

Vídeo suplementario 1: Efecto microscópico de la eliminación insuficiente del tejido conectivo en el músculo cremaestro. Haga clic aquí para ver este video (haga clic con el botón derecho para descargarlo).

Video Suplementario 2: Flujo sanguíneo alterado por hipervolemia o hipotensión. Haga clic aquí para ver este video (haga clic con el botón derecho para descargarlo).

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Discussion

IVM como método se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de células en diferentes órganos y ha sido ampliamente descrito y discutido19. El objetivo principal de este estudio es proporcionar un enfoque eficiente para configurar y realizar IVM en el músculo cremaestro. La práctica del método producirá resultados fiables y reproducibles. Por lo tanto, la planificación y la estandarización son factores clave para dominar la técnica. Sobre todo, la técnica es muy dependiente de los parámetros hemodinámicos y microvasculares, que necesitan ser monitoreados y controlados de cerca. Como tal, la diferentes hemodinámicas entre grupos producirán resultados engañosos.

A pesar de su papel en el estudio de las condiciones fisiológicas y patológicas, IVM por sí solo puede no desentrañar completamente la contribución individual de tipos de células específicas al reclutamiento de leucocitos en la inflamación. Para ello, otros métodos complementarios pueden combinarse con IVM. Por ejemplo, métodos ex vivo como experimentos de cámara de flujo pueden delinear entre los efectos del endotelio o el leucocito. Además, las cámaras de flujo son excelentes configuraciones para traducir los hallazgos de roedores a leucocitos humanos, por ejemplo en recién nacidos20. Además, los métodos in vitro como el FACS o la inmunohistoquímica deben complementar los experimentos de la vma de la iniVM. Cada método puede agregar información específica adquirida de un entorno controlado con pocos factores de confunción.

La preparación traumática del cremaster presentada aquí se asemeja a las condiciones basales fisiológicas de inflamación lo más cerca posible. Sin embargo, la preparación quirúrgica obligatoria en sí es un estímulo de inflamación, que debe ser considerado para la interpretación. La estimulación farmacológica del TNF del tejido cremaster puede proporcionar un modo adicional para impulsar el reclutamiento inflamatorio más allá del estímulo quirúrgico traumático16. Además, diferentes cepas de ratón pueden mostrar respuestas alteradas hacia estímulos estandarizados. Hemos demostrado que incluso cepas comunes de tipo silvestre pueden exhibir diferentes estados de referencia de reclutamiento de leucocitos. Esto muestra la importancia de asignar controles genéticos correctos y establecer datos de referencia para nuevos grupos experimentales al planificar experimentos. Como las cepas transgénicas son muy abundantes en estos días, es probable que incluso las mismas cepas pueden diferir con el tiempo dependiendo de la cría.

En conjunto, IVM es una poderosa herramienta para monitorear el reclutamiento de leucocitos en el contexto biológico del ratón y debe ir acompañada de técnicas ex vivo e in vitro. Además, cremaster IVM permite una variedad de modos diferentes, incluyendo la tinción celular específica, estimulación inflamatoria o manipulación farmacológica y pretratamiento. Como tal puede servir como una plataforma para evaluar diferentes mediadores farmacológicos y sus efectos biológicos en estudios preclínicos especialmente en el campo de la inflamación y más específicamente en las musculoopatías inflamatorias.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) 01GL1746E como parte del Consorcio PRIMAL. Los autores reconocen a Britta Heckmann y Silvia Pezer por su hábil asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Ketanest S Pfizer Pharma GmbH PZN: 08509909 anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine
Xylazine CP-Pharma GmbH Article-nr.: 1205  anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)
Saline Solution B. Braun Melsungen  PZN 02737756 surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride
Syringe needle Omnican F B. Braun Melsungen  REF 9161502 surgical preparation 
Suture 6/0 USP Resorba REF 4217 surgical preparation 
Polyethylene tube #10  BD GmbH Supplier No. 427401 surgical preparation 
Polyethylene tube #90  BD GmbH Supplier No. 427421 surgical preparation 
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich Chemie GmbH CAS Number 989-38-8  leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
Setup Equipment
Upright microscope  Olympus  BX51W1 microscopy
40-fold objective  Zeiss Achroplan 40 × /0.80 W microscopy
ImSpector software Lavision Biotec GmbH ver. 4.0.469 software
ImageJ National Institute of Health, USA ver. 1.51j8 software

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References

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Inmunología e infección número 158 microscopía intravital leucocitos maestro cremaestro adhesión inflamación músculo esquelético mdx
Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital
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Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada,More

Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada, R., Braun, M., Kuss, N., Pöschl, J., Hudalla, H. Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (158), e60509, doi:10.3791/60509 (2020).

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