Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تلطيخ المناعية باستخدام IBA1 و TMEM119 لكثافة Microglial ، المورفولوجية والطرفية الخلية النخاعية تحليل تسلل في الدماغ الماوس

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف هذا البروتوكول سير العمل خطوه بخطوه للحصول علي التكلفة المناعية لIBA1 و TMEM119 ، بالاضافه إلى تحليل الكثافة الصغرى والتوزيع والتشكل ، فضلا عن تسلل الخلايا النقوي الطرفية في انسجه المخ الماوس.

Abstract

هذا هو بروتوكول لتصور مزدوج من الخلايا الصغيرة والتسلل الضامة في انسجه المخ الماوس. TMEM119 (التي تسمي الميكروبات الصغيرة بشكل انتقائي) ، عندما يقترن IBA1 (الذي يوفر التصور استثنائيه من المورفولوجية) ، يسمح التحقيق في التغيرات في الكثافة والتوزيع والتشكل. التحديد الكمي لهذه المعلمات أمر مهم في توفير رؤى حول الأدوار التي تمارسها الخلايا الصغيرة ، الضامة المقيمة في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم توزيع الخلايا الصغيرة بانتظام في نمط يشبه الفسيفساء وتقدم سوما صغيره مع العمليات الدقيقة. ومع ذلك ، وكاستجابة للعوامل البيئية (اي الصدمات ، والعدوى ، والمرض ، أو الاصابه) ، يتم تغيير الكثافة الصغرى ، والتوزيع ، والمورفولوجية في مختلف الآداب ، اعتمادا علي الاهانه. بالاضافه إلى ذلك ، فان طريقه التلطيخ المزدوج الموصوفة تسمح بتصور الضامة التسلل في الدماغ استنادا إلى التعبير عن IBA1 ودون التنظير مع TMEM119. التالي فان هذا النهج يسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة المتسللة ، وهو أمر مطلوب لتوفير رؤى وظيفية لمشاركتها المتميزة في توازن الدماغ في مختلف سياقات الصحة والمرض. يدمج هذا البروتوكول أحدث النتائج في المناعة العصبية التي تتعلق بتحديد علامات انتقائية. كما انها بمثابه أداه مفيده لكل من خبراء المناعة العصبية ذوي الخبرة والباحثين الذين يسعون إلى دمج المناعة العصبية في المشاريع.

Introduction

سواء الحاده أو المزمنة ، ويتاثر التهاب العصبي باحكام من الخلايا الصغيرة ، والضامة المقيمين في الدماغ. يعتبر تصور الخلايا الصغيرة من خلال المناعة أمرا قيما لدراسة التهاب العصبي مع استخدام المجهر الضوئي ، وهي تقنيه يمكن الوصول اليها بشكل كبير. في ظروف التماثل المنزلي ، يتم عاده توزيع الخلايا الصغيرة في نمط غير متراكب يشبه الفسيفساء. هم يبديون [سومد] صغيره ان يمدد عمليات [رفيد]1, اي أحيانا اتصلت واحده آخر2. العمليات المجهرية التي يتم مسحها بشكل حيوي الدماغ parenchyma ، والتفاعل مع الخلايا العصبية ، وغيرها من الكريات الدبقيه ، والاوعيه الدموية خلال الظروف الفسيولوجية العادية3. وقد تم تجهيز ميكروليا مع ترسانة من المستقبلات التي تسمح لهم بأداء المهام المناعية والاستجابة للتغيرات في وسط الدماغ, لموت الخلايا, أو لتلف الانسجه. الاضافه إلى ذلك ، فانها تمارس الوظائف الفسيولوجية الرئيسية ، ولا سيما في تشكيل متشابك ، والصيانة ، والقضاء علي4،5.

ومن بين العلامات المتاحة المستخدمة لدراسة الخلايا الصغيرة ، المتاينه الكالسيوم ملزمه محول جزيء 1 (IBA1) هي واحده من أكثر استخداما علي نطاق واسع. IBA1 هو بروتين ملزم للكالسيوم يوفر تصورا استثنائيا لمورفولوجية المجهرية ، بما في ذلك العمليات البعيدة الدقيقة ، كما يؤكد ذلك المجهر الكتروني6. وقد كانت هذه الاداه مفيده في توصيف التحول ميكروجليال ، وكان يسمي سابقا "التنشيط" ، في مجموعه واسعه من الامراض الحيوانية نماذج7،8،9. في وجود التهاب عصبي ، وتشمل الاستجابة ميكروجليال: ميكروجليسيس التي يتم تعريفها بأنها زيادة في كثافة الخلوية ، والتغيرات في التوزيع التي تؤدي في بعض الأحيان إلى التكتل ، وتوسيع جسم الخلية ، وكذلك سماكه تقصير العمليات المرتبطة بالاشكال الأكثر اميبويد10،11،12،13.

المناعة محدوده بتوافر الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات محدده. الأهم من ذلك ، يتم التعبير عن IBA1 من قبل ميكروليا ولكن أيضا من قبل الضامة الطرفية التي تخترق الدماغ14. في حين أصبحت مراقبه الخلايا الايجابيه الIBA1ه داخل المخ علامة علي الميكروبات في هذا المجال البحثي ، تم الإبلاغ عن تسلل الضامة المحيطيه تحت ظروف مختلفه ، حتى هامشيا في الدماغ صحية15،16 و17و18. التالي ، فان استخدام IBA1 وحده لا يسمح التصور الانتقائي من الخلايا الصغيرة. الاضافه إلى ذلك ، تعتمد الضامة السمات الجزيئية والمورفولوجية من الخلايا الدقيقة المقيمة بمجرد انها تسللت إلى الدماغ ، التالي عرقله التمايز19. وهذا يمثل تحديا عند التحقيق في وظيفة كل من الخلايا الصغيرة والضامة التسلل.

في حين ان الخلايا الصغرى والضامة الطرفية لها أصول متميزة (علي سبيل المثال ، من كيس الصفار الجنيني ونخاع العظم ، علي التوالي20،21) ، هناك عدد متزايد من النتائج التي تشير إلى ان اثنين من السكان الخلية تمارس ادوار مختلفه في الدماغ19. التالي فمن الاهميه بمكان استخدام الأساليب التي تميز بين هذين الشعبين دون تلاعبات الغازية (اي النخاع العظمي الشمبانزي أو بارابيوسيس) التي يمكن ان تعدل كثافتها ، والتوزيع ، والشكل ، والوظيفة. وقد برزت TMEM119 كعلامة خاصه بالخلايا الصغيرة في جميع الحالات الصحية والامراض22. عند دمجها مع IBA1 ، يصبح هذا المؤشر مفيدا للتمييز بين هذه الخلايا وبين الضامة التي يتم التسلل اليها ، والتي هي TMEM119 سالبه و IBA1 موجبه. وفي حين انها تخضع للتنظيم التنموي ، فانه يتم التعبير عن TMEM119 في وقت مبكر من أيام ما بعد الولادة 3 (P3) و 6 (الرؤساء الستة) ، وتزداد باطراد حتى تصل إلى مستويات الكبار بين P10 و P1422. ويعبر عن IBA1 في وقت مبكر من اليوم الجنيني 10.5 (E 10.5)23. ولذلك فان البروتوكول المقترح لوضع العلامات المزدوجة مفيد لدراسة هذين النوعين من السكان طوال فتره ما بعد الولادة.

يوفر هذا البروتوكول إجراءات مناعية خطوه بخطوه تسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة الطرفية. كما يشرح كيفيه اجراء تحليل كمي لكثافة ميكروجليال ، والتوزيع ، والمورفولوجية ، فضلا عن تحليل تسلل الضامة المحيطيه. في حين ان التحقيق في الخلايا الصغيرة والضامة الطرفية هو مفيد من تلقاء نفسها, هذا البروتوكول كذلك يسمح توطين الاجنه التهابيه العصبية; التالي ، فانه يعمل أيضا كمنبر لتحديد مناطق معينه للتحقيق فيها ، مع استخدام تقنيات تكميليه (ولكنها أكثر استهلاكا للوقت والموارد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية للجان المؤسسية للأخلاقيات الحيوانية ، وفقا للمجلس الكندي لرعاية الماشية ولجنه الرعاية الحيوانية التابعة لجامعه لافال.

1-التحصين المناعي

  1. حدد ثلاثه أقسام الدماغ الماوس التي تحتوي علي منطقه الفائدة (ROI) (اي ، الحصين) مع مساعده من أطلس الدماغ. ضع الأقسام في صفيحه بلاستيكية متعددة الآبار وغطيها ب350 μL من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (الجدول 1).
    ملاحظه: للحصول علي أفضل النتائج ، يجب ان يكون perfused العقول مع 4 ٪ بارافورمالدهيد وقطع إلى سمك 50 μm مع الذبذبات. للحصول علي لوحه متعددة الآبار 24 ، كل بئر يمكن ان تعقد ما يصل إلى سته أقسام. الحجم الموصي به للحل لكل بئر هو 350 μL (لمده تصل إلى ثلاثه أقسام) و 500 μL لآبار تحتوي علي سته أقسام. لعدد أكبر من الأقسام ، فمن المستحسن استخدام 12 لوحه متعددة الآبار. تاكد من ان حجم الحل المحدد لكل بئر يغطي الانسجه تماما ويسمح للأقسام بالطفو. تنطبق وحدات التخزين الموصي بها علي كل الحلول المستخدمة في بقية البروتوكول.
  2. غسل العينات من خلال تغطيتها مع 350 μL من تلفزيوني والسماح لهم الراحة عن طريق وضع لوحه متعددة البئر علي راس شاكر متعددة الأغراض في درجه حرارة الغرفة (RT). أزاله التلفزيونية بعد 5 دقائق واستبدالها 5x مع تلفزيونيه الطازجة.
    ملاحظه: لأزاله الحلول ، ينصح باستخدام ماصه النقل. عندما تتدفق في اي حل ، تاكد من وضع غيض من ماصه ضد جدار البئر لحماية سلامه الانسجه. تاكد أيضا من استخدام ماصه جديده لكل حل جديد.
  3. أزاله تلفزيوني وأضافه 350 μL من 10 مم الصوديوم سترات العازلة مع الرقم الهيدروجيني = 6.0 (الجدول 1).
  4. ختم لوحه متعددة البئر مع فيلم البارافين والسماح لها تطفو علي حمام مياه مسخن مسبقا ل 40 دقيقه في 70 درجه مئوية.
  5. السماح للوحه متعددة البئر تهدئه لمده 15 دقيقه تقريبا.
  6. أزاله العازلة سيترات الصوديوم وغسل الأقسام في الاذاعه التلفزيونية كما فعلت في الخطوة 1.2.
  7. أزاله تلفزيوني وأضافه 350 μL من الطازجة المصنوعة 0.1 ٪ نابه4 (الجدول 1) واسمحوا احتضان لمده 30 دقيقه في RT.
  8. أزاله الحل من 0.1 ٪ NaBH4 وغسل الأقسام في التلفزيونية كما فعلت في الخطوة 1.2.
  9. أزاله تلفزيوني وأضافه حظر المخزن المؤقت (الجدول 1) ل 1 ح في RT علي راس شاكر متعددة الأغراض.
    ملاحظه: تاكد من اعداد وحدات التخزين المضاعفة من حظر المخزن المؤقت ، كما سيتم استخدام نفس الحل في الخطوة التالية.
  10. أزاله المخزن المؤقت حظر واستبدال عن طريق حظر العازلة التي تحتوي علي خليط من الأجسام المضادة الاوليه (1:150 الماوس IBA1 + 1:300 TMEM119). ختم لوحه مع الفيلم البارافين والسماح لها احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  11. في اليوم التالي ، عينات دافئه في RT لمده 15 دقيقه تقريبا.
  12. غسل الأقسام 5x لمده 5 دقائق لكل منها في التلفزيونية مع تريتون (PBST) (الجدول 1).
  13. أزاله PBST وأضافه حظر العازلة التي تحتوي علي خليط من الأجسام المضادة الثانوية (1:300 حمار المضادة للماوس اليكسا 488 ل IBA1; 1:300 الماعز المضادة لأرنب اليكسا 568 ل TMEM119) ل 1.5 ح في RT. بدءا من هذه النقطة فصاعدا ، حماية العينات من الضوء.
  14. أزاله حظر المخزن المؤقت وغسل المقاطع 5x كما فعلت في الخطوة 1.2 ، ما عدا هذه المرة مع PBST.
  15. أزاله PBST وأضافه 4 ′, 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) [1:20000] لمده 5 دقائق في RT.
  16. أزاله DAPI وغسل المقاطع 3x لمده 5 دقائق كل في المخزن المؤقت الفوسفات (PB).
  17. تحميل المقاطع علي شريحة المجهر. دعهم يجفون اثناء الحماية من الضوء.
  18. عندما تجفف ، أضافه بعض قطرات من المتوسطة الفلورية المتصاعدة وتغطي مع coverslip ، وتجنب تشكيل فقاعه.
    ملاحظه: تخزين الشرائح اثناء المحمية من الضوء ، داخل مربع الشرائح النسيجية ، في 4 درجه مئوية. يمكن الحفاظ علي العينات لعده أشهر.

2. التصوير لتحليل الكثافة والتوزيع

  1. مع مساعده من المجهر ويديفيلد العدسة ، واستخدام التكبير منخفضه وقناه DAPI لتحديد العائد علي الاستثمار (اي منطقه CA1 من الحصين).
  2. الحصول علي الصور في 20x ، وذلك باستخدام الفتحة العددية (NA) من 0.5 ، مع DAPI ، 488 ، و 568 القناات والفلاتر ، بقرار من 0.3 μm/بكسل. التقط صوره فسيفسائية تغطي عائد الاستثمار. بدلا من ذلك ، التقط صورا فرديه سيتم مخيطها في صوره أكبر.
    ملاحظه: صوره الفسيفساء هي صوره فائقه تتكون من صور أصغر. وتستخدم الصور الفسيفسائية عاده للتغلب علي المساحة المحدودة لمجال الرؤية من التكبير العالي. وتشمل بعض البرامج وظيفة الفسيفساء. ومع ذلك ، يمكن أيضا ان تكون الصور مخيط يدويا مع غيرها من برامج تحرير الصور عن طريق خياطه الصور الفردية في واحده. تذكر أضافه معلومات المقياس إلى الملف. لهذا النوع من التحليل ، فمن المستحسن ان يكون ما لا يقل عن 300 الخلايا ميكروجليال الذين يعانون منه في العائد علي الاستثمار/الحيوانية (المقابلة ما يقرب من 10 − 15 صور لحصين ، علي سبيل المثال) ، مع الحد الأدنى من خمسه الحيوانية في حاله تجريبية. ويبين الشكل 1ا − ج صور الخلايا الصغيرة المقطوعة.
  3. حفظ الصورة كملف TIFF.

3. التصوير لتحليل المورفولوجية

  1. باستخدام مجهر الاضاءه المنسق أو المنظم ، استخدم قناه DAPI لتحديد عائد الاستثمار عند التكبير المنخفض.
  2. باستخدام هدف 40x (اي ، NA 1.4 النفط) ، حدد موقع IBA1 +/tmem119 + خليه داخل عائد الاستثمار. اثناء التصوير الحي ، تحرك في المحور Z. بمجرد اختفاء اشاره من الخلايا الصغيرة المختارة عشوائيا ، تعيين هذا المستوي Z كبداية Z-المكدس. التحرك علي طول المحور Z في الاتجاه المعاكس حتى تختفي اشاره من الخلايا الصغيرة وتعيين تلك النقطة كنهاية Z-المكدس.
    ملاحظه: يظهر الشكل 2ا − C صورا لIBA1 +/tmem119 + الخلايا الصغيرة.
  3. إنشاء المكدس Z في جميع القناات الثلاث (DAPI ، 488 ، 568) باستخدام 0.33 μm Z-الفاصل الزمني وحجم بكسل 0.15 μm/بكسل. أضافه معلومات المقياس إلى الملف.
    ملاحظه: الموصي بها Z-الفاصل الزمني يعتمد علي قوه حل الهدف (علي سبيل المثال ، لهدف 40x مثل النفط NA 1.4 ، فمن 0.33 μm). للتحليل المورفولوجية ، فمن المستحسن ان يكون ما لا يقل عن 20 خليه لكل الحيوانية مع الحد الأدنى من خمسه الماشية في حاله تجريبية.
  4. حفظ الملف كملف TIFF.

4. تحليل الكثافة والتوزيع

  1. فتح فيجي/ImageJ مع أقرب مسافة الجار (NND) المساعد المثبتة. افتح الصورة 20x.
    ملاحظه: استخدم محرك بحث مع الكلمة الاساسيه "أقرب حساب مسافات الجار مع ImageJ" للعثور علي إرشادات التثبيت. المؤلف المساعد هو يوشيونغ ماو.
  2. لضبط المقياس يدويا استنادا إلى مقياس مطبوع علي الصورة ، حدد أداه الخط المستقيم (الشكل 3E) ، ضع المؤشر علي حافه الميزان ، واثناء الضغط علي مفتاح shift ، ارسم خطا أقرب ما يمكن إلى المقياس علي الصورة (الشكل 3e ) ، حدد تحليل | تعيين المقياس، ثم ادخل المعلومات الصحيحة (الشكل 3j).
    ملاحظه: يمكن في بعض الأحيان تضمين المقياس في بيانات التعريف الخاصة بالملف وتعيينه تلقائيا.
  3. اختر الصورة | لون | جعل مركب لخلق صوره مركبه من جميع القناات.
    ملاحظه: اثناء اكتساب الصور ، ستقوم فيجي/ImageJ تلقائيا بإنشاء مركب بتنسيق RGB.
  4. في شريط القوائم ، حدد تحليل | تعيين القياسات. تحقق من المنطقة، centroid، ومحيط. في علامة التبويب أعاده التوجيه إلى، انقر فوق وحدد الملف المفتوح (الشكل 3k).
  5. انتقل إلى الصورة | لون | أداه القناة لفتح أداه القناة.
    ملاحظه: ستسمح هذه القائمة لون معين ليتم تعطيل. يمكن ان تكون قناه DAPI مفيده لتحديد عائد الاستثمار ولتاكيد الخلايا. ويمكن تعطيله لجعل العد أسهل.
  6. رسم محيط الخام من العائد علي الاستثمار مع أداه اختيار اليد الحرة (الشكل 3D).
  7. قم بتمكين أداه فرشاه التحديد بالنقر المزدوج فوق الاداه البيضاوية علي شريط الاداات وتاكد من تحديد خانه الاختيار تمكين الفرشاة (الشكل 3g). سيتم استخدام هذه الاداه لتحديد عائد الاستثمار بدقه أكبر. حدد حجم فرشاه مناسب بين 200 − 400.
  8. باستخدام فرشاه التحديد ، اضبط المحيط ليتناسب بشكل أفضل مع عائد الاستثمار. اضغط علي T علي لوحه المفاتيح لأضافه إلى مدير ROI (الشكل 3l).
  9. حدد تحليل | قياس أو اضغط علي مفتاح M ، وسوف نافذه النتائج يطفو علي المستوي. انسخ النتائج وألصقها في ورقه بيانات ، ثم احفظ المعلومات المتعلقة بالمنطقة (اي منطقه عائد الاستثمار ؛ الشكل 3 r).
  10. بعد نسخ مساحة العائد علي الاستثمار ، امسح المعلومات من نافذه النتائج بالنقر عليها والضغط علي مفتاح المسافة للخلف .
  11. انتقل إلى اطار أداره عائد الاستثمار (الشكل 3L) ، وانقر بزر الماوس الأيمن علي تتبع عائد الاستثمار ، وقم بتغيير الاسم ليطابق اسم الصورة ، ثم احفظه.
  12. انقر نقرا مزدوجا فوق أداه الفرشاة في شريط الاداات. حدد اللون الأسود وحجم فرشاه 10. تاكد من ان الطلاء الخيار من تراكب غير محدد (الشكل 3h).
  13. في قناه TMEM119 ، ضع بعناية نقطه سوداء علي مركز سوما لكل TMEM119 + ميكروليا. وضع نقطه بيضاء علي مركز الخلايا التي ليست ايجابيه ل TMEM119 (لوضع علامة الضامة التسلل). كرر نفس الاجراء لكافة الخلايا الموجودة في عائد الاستثمار.
    ملاحظه: من المهم ان جميع النقاط (الأبيض والأسود) تقع في نفس القناة. يمكن التحقق من هويه القناة (الأحمر أو الأزرق أو الأخضر) من خلال النظر إلى لون ملصقات نافذه الصورة.
  14. اختر الصورة | لون | قناه الانقسام. ستظهر نافذه لكل قناه. وبعد ذلك ، حدد القناة التي تحتوي علي التعليقات التوضيحية النقطية واغلق الإطارين الآخرين.
  15. أعاده توجيه صوره القناة المنقسمة الجديدة. انتقل إلى تحليل | تعيين القياسات. في علامة التبويب أعاده التوجيه إلى، انقر فوق وحدد صوره القناة المنقسمة (الشكل 3k).
  16. اختر الصورة | نوع | 8 بت. انتقل إلى الصورة | ضبط وتحديد عتبه (الشكل 3o). لضبط العتبة ، مرر زر الشريط الثاني ، كل الطريق إلى اليسار (قيمه العتبة = 0) في كلا الشريطيين.
    ملاحظه: هذا سيترك فقط النقاط السوداء علي الصورة ، تظهر بيضاء.
  17. حدد عائد الاستثمار في اطار أداره عائد الاستثمار. حدد تحليل | تحليل الجسيمات (الشكل 3n). علي الحجم (بوصه ˆ 2): الكتابة 1 − 20. الحفاظ علي وحده بكسل دون رادع ، والتحقق من عرض ، وتلخيص وأضافه إلى مدير، واضغط Ok. ستظهر نافذه الملخص وتعطي عدد النقاط (الشكل 3P). انسخ المعلومات وألصقها في ورقه البيانات.
  18. اختر الإضافات | الطابق الثاني. سوف نافذه NND يطفو عليالجليد (الشكل 3Q). نسخ/لصق كافة المعلومات إلى ورقه البيانات. كل رقم يمثل المسافة كل الخلايا الصغيرة لديها إلى أقرب المجاورة الصغرى.
  19. العودة إلى نافذه عتبه والشريحة الشريط الأول علي طول الطريق إلى اليمين (قيمه عتبه = 255 في كلا القضبان) ، والتي سوف تترك جميع النقاط البيضاء مرئية ، والتي تظهر بيضاء (الشكل 3M).
  20. حدد تحليل | تحليل الجسيمات. نافذه التلخيص التي توفر عدد النقاط سوف يطفو علي الظهور (الشكل 3P). انسخ المعلومات وألصقها في ورقه البيانات.
  21. انتقل إلى مدير عائد الاستثمار حدد جميع النقاط ، انقر بزر الماوس الأيمن ، واحفظه باسم الصورة. وهذا سوف يسمح بحفظ جميع النقاط في ملف مضغوط (الشكل 3L). حدد ملف | احفظ باسم، واحفظ الملف بالأسماء التي تسمح بتعريف الصورة المحللة.
  22. الحصول علي كثافة الخلايا الصغيرة (لكل صوره) عن طريق تقسيم عدد IBA1 +/TMEM119 + خليه مزدوجة الايجابيه من ناحية عائد الاستثمار.
    ملاحظه: يمكن متوسط قيم كل صوره لكل الحيوانية. المعطيات يستطيع بعد ذلك كنت قدمت بما ان يعني ± خطا معياريه من المتوسطة ([سم]) من كل الماشية.
  23. تحديد NND بواسطة الحصول علي متوسط لكل صوره من قيم NND كافة الخلايا TMEM119 +.
    ملاحظه: يمكن بعد ذلك تقديم البيانات كما يعني ± SEM من جميع الكائنات.
  24. حساب فهرس التباعد باستخدام الصيغة: NND2 x الكثافة.
    ملاحظه: يمكن بعد ذلك تقديم البيانات كما يعني ± SEM من جميع الكائنات. ستكون الوحدات الخاصة بهذا القياس وحدات اعتباطية.
  25. القياس الكمي للمجموعات الصغيرة عن طريق تحديد الخلايا التي تحتوي علي NND اقل من 12 ميكرومتر.
    ملاحظه: هنا ، يتم تحديد 12 μm ، لأنه هو المسافة التقريبية بين اثنين من الخلايا الصغيرة متجاورة مباشره لمس بعضها البعض مع الarborizations. إذا كان هناك أكثر من ثلاثه ميكروليا التي تستوفي هذا الشرط ، العودة إلى الصورة والتحقق من ما إذا كانت هذه الخلايا جزءا من مجموعه واحده أو متعددة.
  26. بعد التاكد من عدد الكتل ، اكتب عدد الكتل في ورقه البيانات.
    ملاحظه: يمكن تقسيم عدد الكتل بواسطة منطقه ROI للحصول علي كثافة الخلايا/مم2 لكل الحيوانية. المعطيات يستطيع بعد ذلك كنت قدمت بما ان يعني ± [سم] من كل الماشية.
  27. لتحديد النسبة المئوية للتسلل الخلية النخاعية الطرفية ، حساب ٪ من خلايا IBA1 +/TMEM119-علي العدد الإجمالي للخلايا النخاعية (TMEM119 +/TMEM119-+ + TMEM119-/TMEM119-+) لكل الحيوانية.
    ملاحظه: يمكن بعد ذلك تقديم البيانات كما يعني ± SEM من جميع الكائنات.

5. تحليل المورفولوجية

  1. فتح فيجي/ImageJ.
  2. افتح الصورة 40x باستخدام الصورة J أو فيجي. حدد نافذه منبثقة سوف تظهر يسال إذا كان يجب فتح الصور في كومه. انقر فوق موافق. بعد ذلك ، حدد الصورة | مكدسات | Z المشروع لفتح الإطار z-الإسقاط. تشمل جميع الشرائح ، من الشريحة الاولي إلى الاخيره. تاكد من تحديد الكثافة القصوى ضمن نوع الإسقاط، ثم انقر فوق موافق
  3. انقر علي النافذة الجديدة مع مشروع Z. اختر الصورة | ألوان | قنوات الانقسام. اجراء اثار علي الصور من قناه IBA1.
    ملاحظه: يمكن الحفاظ علي القناات الأخرى (TMEM119 و DAPI) مفتوحة والتشاور حسب الحاجة خلال تحليل المورفولوجية ميكروجليال.
  4. في شريط القوائم ، حدد تحليل | تعيين القياسات. تحقق من المنطقة، centroid، ومحيط. في علامة التبويب أعاده التوجيه إلى، حدد الملف المفتوح (الشكل 3k).
  5. تعيين المقياس كما هو موضح في الخطوات 4.2.
  6. لقياس حجم سوما في قناه IBA1 ، رسم محيط الخام من سوما مع أداه اختيار اليد الحرة (الشكل 3D).
  7. تمكين أداه فرشاه التحديد بالنقر المزدوج فوق الاداه البيضاوية علي شريط الاداات ، متبوعا بالتحقق من تمكين مربع فرشاه التحديد (الشكل 3g). حدد حجم فرشاه التحديد بين 10 − 20 (الشكل 3 ب).
  8. باستخدام فرشاه التحديد ، وضبط التتبع لتناسب أفضل سوما. سيؤدي التكبير إلى تمكين الدقة اثناء هذه الخطوة (الشكل 2I).
  9. اضغط علي المفتاح T لأضافه تتبع سوما إلى مدير العائد علي الاستثمار (الشكل 3l).
  10. حدد تحليل | قياس أو اضغط علي مفتاح M . نافذه النتائج سوف يطفو علي الظهور. انسخ النتائج وألصقها علي ورقه بيانات (الشكل 3R).
  11. لحفظ المعلومات المتعلقة بمنطقه سوما ، انتقل إلى اطار أداره ROI ، انقر بزر الماوس الأيمن علي العائد علي الاستثمار ، وتغيير الاسم لمطابقه اسم الصورة ، وتحديد ان التتبع هو سوما ، ثم حفظ الملف.
  12. لقياس منطقه اربوريشن في قناه IBA1 ، انقر علي اقصي عمليه ميكروجليال مع أداه تحديد المضلع ، والتي سوف تبدا شكل المضلع (الشكل 3C).
  13. بعد نصائح من العمليات ميكروجليال ، انتقل حول الخلايا الصغيرة عن طريق النقر علي نصائح من كل طرف العملية لتشكيل المضلع الذي يمثل أفضل المنطقة التي تغطيها arborizations ميكروجليال (الشكل 2d− H).
    ملاحظه: تاكد من ان المضلع يربط كافة الأطراف العملية ميكروجليال. الخطوط التي تشكل المضلع لا يجب ان تتقاطع أبدا عند النقر حول تلميح عمليه ميكروجليال ، كن حذرا لتجنب قطع اي جزء من العملية. ومن المفيد في بعض الأحيان لأضافه نقاط اضافيه للذهاب حول عمليه. ولا يرتبط عدد النقاط التي تشكل المضلع ارتباطا مباشرا بعدد العمليات البعيدة التالي فهو غير ذي صله بالدراسة.
  14. لإغلاق المضلع ، انقر فوق نقطه البداية للمضلع.
  15. اضغط علي المفتاح T لأضافه التتبع إلى مدير العائد علي الاستثمار (الشكل 3l). حدد تحليل | قياس أو اضغط علي مفتاح M . نافذه النتائج سوف يطفو علي الظهور. انسخ النتائج وألصقها علي ورقه بيانات (الشكل 3R).
  16. لحفظ المعلومات المتعلقة بمنطقه الإدخال ، انتقل إلى اطار أداره عائد الاستثمار ، وانقر بزر الماوس الأيمن علي العائد علي الاستثمار ، وقم بتغيير الاسم ليطابق اسم الصورة ، وحدد لإضفاء الصلة ، ثم احفظ الملف.
  17. تحديد منطقه سوما عن طريق المتوسط جميع مناطق سوما لكل الحيوانية.
    ملاحظه: يمكن تقديم البيانات كما يعني ± SEM من جميع الكائنات.
  18. تحديد منطقه التنقيط عن طريق المتوسط جميع المناطق اربوريشن لكل الحيوانية.
    ملاحظه: يمكن تقديم البيانات كما يعني ± SEM من جميع الكائنات.
  19. حساب مؤشر التشكل باستخدام الصيغة منطقه سوما/منطقه اربوريشن لكل خليه ميكروجليال ومتوسط لكل الحيوانية.
    ملاحظه: يمكن تقديم البيانات كما يعني ± SEM من جميع الكائنات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 المشاركة في وضع العلامات علي الخلايا الصغيرة التي تستخدم IBA1 و TMEM119 في الجزء الإكليلي من الحصين الظهري الذي يبلغ 20x بواسطة المجهر الفلوري. التلطيخ الناجح يكشف عن الأجسام الخلوية الصغيرة وعملياتها الدقيقة (الشكل 1ا − ج). هذا تلطيخ يسمح تحديد كثافة ميكروجليال والتوزيع وتحديد المجموعات الصغيرة (الشكل 1)والضامة التسلل (الشكل 1و).

يظهر الشكل 2 IBA1 +/TMEM119 + الخلايا الصغيرة (الشكل 2ا − ج) في مثال متدرج لاجراء تتبع المسار المجهري (الشكل 2مد − H) ، بالاضافه إلى مثال علي تتبع جسم الخلية (الشكل 2 ) ، علي حد سواء الذين تتراوح أعمارهم في 40x بواسطة المجهر البؤري.

Figure 1
الشكل 1: IBA1 و TMEM119 تلطيخ مزدوج من انسجه المخ الماوس لكثافة ، والتوزيع ، والتكتلات ، وتحليل تسلل الخلايا النخاعية الطرفية. (ا − ج) التوزيع النموذجي ميكروجليال في الحصين من C57BL/6 الكبار الماوس. (مد − واو) الميكروبات التي تعرف باسم IBA1 +/TMEM119 + والتسلل الضامة التي تم تحديدها باسم IBA1 +/TMEM119 (السهم الأبيض) في اللوزة من الماوس الذكور. (خ − ط) مجموعه من اثنين من الخلايا الصغيرة (المربع الأبيض) في الحصين من الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: IBA1 و TMEM119 تلطيخ لتحليل المورفولوجية ميكروجليال. (ا − ج) خلايا الدبقيه. (د − 1) مثال خطوه بخطوه لتتبع المسار الIBA1 باستخدام الاداه المضلعة في فيجي/ImageJ. (ي) مثال علي تتبع الخلايا الصغيرة سوما مع قناه IBA1 باستخدام أداه اختيار اليد الحرة في فيجي/imagej. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: واجهه فيجي/ImageJ والاداات الخاصة بالكثافة المجهرية ، والتوزيع ، والتكتل ، والتشكل ، وتحليل تسلل خلايا النخاع الطرفية. (ا − ر) تجميع كافة الاداات والقوائم والإطارات المستخدمة لتحليلات الكثافة والكتلة والتشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

حلول اعداد
حظر المخزن المؤقت 0.5% الجيلاتين + 5% مصل الماعز الطبيعي + 5% مصل الحمار الطبيعي + 0.01% تريتون X-100 في TBS [0.05 M]
العازلة سيترات 1.92 غرام من حمض الستريك [10 ملم] ، 500 μl من توين 20 [0.05 ٪ (v/v)] ، 700 مل من الماء نقاء ، وضبط درجه الحموضة = 6.0 مع naoh [10 N] ، وملء ما يصل إلى 1 لتر مع المياه الفائقة
الساعة4 [0.01% ث/ث] Disolve 0.01 g من nabh4 في 10 مل من الماء نقاء ، يجب ان يكون الحل مختلطة جيدا. هذا الحل يخلق فقاعه. الإفراج عن الضغط عن طريق فتح الغطاء بعد خلط
Pb [100 مم] Disolve 23.48 g من Na2hpo4 و 4.8 g من الجناح2PO4· H2في 1 لتر من الماء نقاء ، ثم ملء ما يصل إلى 2 لتر ، وضبط درجه الحموضة = 7.4
برنامج تلفزيوني [50 مم] Disolve 5.87 g من Na2hpo4, 1.2 g من الجناح2PO4· H2، 9 غرام من كلوريد الصوديوم في 500 مل من الماء نقاء ، وملء ما يصل إلى 1 لتر مع الماء نقاء ، وضبط درجه الحموضة = 7.4
PBST تلفزيوني + 0.01% تريتون X-100
تبس تمييع تريس hcl [0.5 m] مع المياه نقاء 1:10 [0.05 m] ، واتخاذ 1 لتر من تريس HCl [0.05 M] وأضافه 8.75 غرام من كلوريد الصوديوم
تريس HCl [0.5 M] 950 مل من الماء نقاء ، أضافه 78.8 g من العازلة تريس هيدروكلوريد (C4H11NO3Cl) ضبط درجه الحموضة = 8 وملء ما يصل إلى 1 لتر

الجدول 1: الحلول المستخدمة للمناعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن تقسيم هذا البروتوكول في جزاين الحرجة: نوعيه تلطيخ والتحليل. إذا كان تلطيخ ليس الأمثل ، وسوف تفشل في تمثيل الخلايا الدقيقة بشكل كاف ، التالي تؤثر علي الكثافة ، والتوزيع ، وقياسات المورفولوجية. الاضافه إلى ذلك ، يمكن الاستهانة بنسبه الخلايا النخاعية الطرفية للتسلل. هذا هو الإصدار الأمثل من البروتوكول تلطيخ ، ولكن هناك العديد من العوامل التي قد تؤدي إلى صور دون الأمثل. علي الرغم من ان الانصهار من الحيوانية غير المدرجة في هذا البروتوكول ، إذا كان تثبيت الدماغ ليست جيده التنفيذ ، سيتم اختراق نوعيه تلطيخ. بالاضافه إلى ذلك ، مطلوب ترويه كافيه لضمان عدم وجود الضامة داخل الاوعيه الدموية التي قد تتداخل مع الدراسة.

وفيما يتعلق بالمناعة ، تشمل التفاصيل الأكثر اهميه نوعيه المخازن المؤقتة ، وعرقله الخطوة ، والتخزين السليم للأجسام المضادة ، ومعالجه عينه المخ. الاعداد السليم من المخازن المؤقتة وتخزينها له تاثير مباشر علي نوعيه تلطيخ. ما لم يتم تحديدها ، يمكن تخزين بعض المخازن المؤقتة لفترات طويلة ، ولكن يجب تجنب استخدام اي مخزن مؤقت يظهر علامات التلوث. إذا تم اعداد المخازن المؤقتة أيام أو أسابيع مقدما ، يجب التحقق من درجه الحموضة لكل حل قبل الاستخدام.

بالاضافه إلى ذلك ، فيما يتعلق بالمناعة ، لا يزال وجود تلطيخ الخلفية واحده من المشاكل الأكثر شيوعا. تلطيخ الخلفية يجعل من الصعب تحليل الخلايا الصغيرة ، وخاصه المورفولوجية ، التالي سوف التحيز النتائج. لمنع الخلفية من المهم ان يتم اجراء الخطوة الحظر بشكل صحيح. كما ان ظروف تخزين الأجسام المضادة لها تاثيرات مباشره علي فعاليتها. ينصح باتباع الإرشادات الخاصة بالتخزين التي تقدمها الشركة بدقه وكذلك تجنب دورات التجميد المتكررة. وأخيرا ، خلال العملية برمتها ، من المهم ان تولي اهتماما للسلامة الجسدية للأقسام الدماغ. من المهم توخي الحذر اثناء كل معالجه (تغييرات المخزن المؤقت ، والغسل ، والتركيب) ، خاصه إذا لم يكن المجرب من ذوي الخبرة في هذا الاجراء. وينصح لتجنب ترك العينات دون اي حل السائل عند تغيير الحلول أو المخازن المؤقتة ، والحلول للخطوة اللاحقة يجب ان تكون جاهزه لتصب في البئر مسبقا. يجب ان تكون مختومه لوحه متعددة البئر بشكل صحيح مع فيلم البارافين خلال الخطوة بين عشيه وضحيها لتجنب التبخر التي قد تؤدي إلى العينات لتجف.

التحليل الكمي لكثافة ميكروجليال ، والتوزيع ، والمورفولوجية له عده مزايا علي التقارير النوعية. ولمنع التحيز ، ينبغي ان يعمي الباحث الذي يقوم بالتحليل عن الحالة التجريبية. التالي ، فمن المقترح ان يكون الناس مختلفه تنفيذ التحليل وتغيير اسم الملفات (مع الحفاظ علي الأسماء الاصليه والجديدة في ورقه الرئيسية). يجب ان الأسماء الجديدة لا تلميحات الشرط التجريبي. ويمكن اجراء التحليل بأكمله علي هذه الملفات العمياء ، ويتم الكشف عن هويه الصورة الاصليه فقط بعد تجميع البيانات وقبل التحليل الإحصائي. علي الرغم من ان العمي يمارس بالفعل من قبل الباحثين ذوي الخبرة ، فانه لا يزال نصيحه قيمه لأولئك الذين يؤدون هذا النوع من التحليل للمرة الاولي.

يتم التحكم في منطقه الدماغ اثناء اختيار قسم الدماغ وتتبع عائد الاستثمار اثناء التحليل. تاكد من استخدام مقاطع من نفس النطاق من مستويات Bregma عبر الكائنات الحيوانية. وينبغي استخدام نفس عائد الاستثمار في تحليلات الكثافة والتوزيع والصرف. لتحليلات الكثافة والتوزيع ، من المهم بشكل خاص ان تكون دقيقه عند رسم العائد علي الاستثمار في فيجي/Image J. يوصي بشده باستخدام أطلس الدماغ لكل من اختيار القسم وتتبع عائد الاستثمار. كما يسهل استخدام DAPI تحديد المعالم التشريحية العصبية. لتجنب التباين ، من المستحسن رفض الخلايا الصغيرة التي تقع جزئيا فقط في عائد الاستثمار ، لأنها قد تختلف بين بيئتها الصغيرة. عند وضع علامة علي الخلايا الصغيرة لتحليل الكثافة ، يمكن استخدام قناه DAPI كمعيار تحديد. من خلال عد الخلايا الصغيرة التي تحتوي علي نوى DAPI الملونة فقط ، تعتبر جميع الخلايا الصغيرة في نفس المستوي ، مما يقلل من التحيز الشخصي اثناء الاختيار.

ونظرا لان القياسات الخاصة بالمقياس NND ، ومؤشر التباعد ، وتحليل المجموعات تستند إلى مواقع النقاط التي تقوم بوسم الخلايا الفردية ، ونظرا لان المسافات تحسب بواسطة فيجي/ImageJ ، فمن المهم ان تكون متسقة عند وضع هذه النقاط. تاكد من وضع النقاط بدقه في وسط جسم الخلية ، والتي يتم تحديدها بصريا. الاضافه إلى ذلك ، ينبغي ان يظل حجم النقاط متسقا طوال التحليل. وسيسهم ذلك في تحسين تمثيل التوزيع المكاني للسكان المجهريين. النسبة لتحليل المجموعات ، تم اختيار 12 ميكرومتر كعتبه للمسافة استنادا إلى تحليلاتنا السابقة. ومع ذلك ، إذا كان هناك أربعه أو أكثر من الخلايا المختلفة مع NND اقل من 12 μm ، يمكن لجميع هذه الخلايا ان تاخذ جزءا من كتله واحده أو تمثل مجموعتين من خليتين. وهذا يجعل من الضروري العودة إلى الصور وتاكيد العدد الفعلي للمجموعات.

وعلي عكس الكثافة والتوزيع ، حيث يتم تحديد عائد الاستثمار بواسطة الميزات التشريحية العصبية باستخدام أطلس الدماغ ، فان اختيار الخلايا المجهرية لتحليل المورفولوجية يستند إلى القدرة علي تحليل الخلية. يجب تحديد كافة الخلايا التي يمكن تحليلها للتحليل في المكدس Z قبل الانتقال إلى المكدس Z آخر لمنع التحيز التحديد. وتشمل أسباب استبعاد الخلايا المسائل المتعلقة بالتحصين أو قطع الانسجه ، أو المعالجة (مثلا ، التمزق) ، أو التركيب (مثل تشكيل الفقاعات). ومن الناحية المثالية ، ينبغي استبعاد أقسام المخ التي لديها مثل هذه القضايا بصوره منهجيه من التصوير والتحليل. من المهم أيضا ان نلاحظ ان تلطيخ ل TMEM119 و IBA1 لا تظهر 100 ٪ التداخل (الشكل 2ا − ج). لان TMEM119 لا يسمح التصور استمرارية العملية (بالاضافه إلى IBA1) ، وهذا يجعل من الصعب تقييم حيث تنتهي خليه واحده وحيث يبدا آخر. التالي ، يتم تحليل المورفولوجية باستخدام قناه IBA1. الاضافه إلى ذلك ، ينبغي حفظ جميع الآثار والنقاط وتصورها للمراجعة في المستقبل ، مما يسمح بزيادة الشفافية واستنساخ النتائج.

يوفر هذا البروتوكول معلومات قيمه فيما يتعلق بالخلايا الصغيرة والضامة التسلل. وتشمل الامثله علي تطبيقاته الكشف عن علامات التهاب الأعصاب من خلال التغيرات في الخلايا الصغيرة في مناطق الدماغ المختلفة ، ودراسة الآثار المضادة للالتهابات من مركب ، ودراسة العوامل التي تتداخل مع وظيفة السليم من الخلايا الصغيرة. النظر إلى ان هذا البروتوكول يسمح بالكشف عن الضامة التسلل في الدماغ والتمايز من هذه الخلايا من العناصر الصغيرة ، وتشمل التطبيقات الاضافيه: تحديد ما إذا كان تجنيد الضامة يحدث في أهانه معينه أو مع استخدام التقنيات الأخرى (اي الاداات الجينية) ، وتاكيد ودراسة عواقب غياب الضامة المحيطيه في الدماغ اثناء الاهانه. نضع في اعتبارنا ان المجهر الفلوري من تلقاء نفسها ليست كافيه لتاكيد التسلل داخل الدماغ parenchyma. عندما IBA1 +/TMEM119-الخلايا التي لوحظت بالقرب من البطينين أو الفضاء الاوعيه الدموية, وهناك حاجه إلى تقنيات الدقة المكانية اعلي مثل المجهر الكترون لتاكيد توطينهم داخل parenchyma. وفي حين ان التغيرات في الكثافة والتوزيع والتشكل مؤشرات جيده للأدوار الصغرى والضامة ، فان هذا النهج اقوي عندما يقترن بالتحقيقات الوظيفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لناتالي فرناكس علي توجيهها ومساعدتها في التجارب. ونود أيضا ان نشكر السيد ايمانويل بلانيل سيرج ريفيست لاستخدامهما المجاهر والمجهر المحوري ، علي التوالي. وقد مول هذا العمل جزئيا بمنح دراسية من المجلس المكسيكي للعلم والتكنولوجيا (CONACYT ؛ إلى الاتحاد الأعصاب) ، ومؤسسه العائلة المختارة ومركز البحوث العلمية الخاصة (ك) ، وصندوق البحوث في كيبيك-سانتيه (إلى م.) ، معهد shastri الهندي الكندي (إلى K.B.) ، فضلا عن منحه ديسكفري من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا (NSERC) إلى M.E.T. M.E.T. يحمل كرسي البحوث الكندية (الطبقة الثانية) من اللدونة المناعية العصبية في الصحة والعلاج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 152 ، الماوس ، الدماغ ، الخلايا الصغيرة ، الكريات النخاعية ، المناعة العصبية ، المناعي ، IBA1 ، TMEM119 ، المجهر

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

تلطيخ المناعية باستخدام IBA1 و TMEM119 لكثافة Microglial ، المورفولوجية والطرفية الخلية النخاعية تحليل تسلل في الدماغ الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González Ibanez, F., Picard,… More

González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter