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Immunology and Infection

माइक्रोग्लियल घनत्व, मॉर्फोलॉजी और परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ विश्लेषण माउस मस्तिष्क के लिए आईबीए1 और TMEM119 का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसी

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल microglial घनत्व, वितरण, और आकृति विज्ञान, साथ ही माउस मस्तिष्क के ऊतकों में परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ के विश्लेषण के अलावा, आईबीए 1 और TMEM119 के इम्यूनोफ्लोरेसेंट costaining के लिए एक कदम दर कदम कार्यप्रवाह का वर्णन करता है।

Abstract

यह माइक्रोग्लिया के दोहरे दृश्य और माउस मस्तिष्क के ऊतकों में मैक्रोफेज घुसपैठ के लिए एक प्रोटोकॉल है। TMEM119 (जो microglia चुनिंदा लेबल), जब IBA1 के साथ संयुक्त (जो उनके आकृति विज्ञान के एक असाधारण दृश्य प्रदान करता है), घनत्व में परिवर्तन की जांच की अनुमति देता है, वितरण, और आकृति विज्ञान. इन मापदंडों को परिमाणित करना माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क के निवासी मैक्रोफेज द्वारा की गई भूमिकाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में महत्वपूर्ण है। सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत, microglia नियमित रूप से एक मोज़ेक की तरह पैटर्न में वितरित कर रहे हैं और ramified प्रक्रियाओं के साथ एक छोटा सा सोमा मौजूद है. फिर भी, पर्यावरणीय कारकों (यानी, आघात, संक्रमण, रोग, या चोट) के जवाब के रूप में, सूक्ष्म घनत्व, वितरण, और आकृति विज्ञान अपमान के आधार पर विभिन्न शिष्टाचार में बदल रहे हैं। इसके अतिरिक्त, वर्णित डबल दाग विधि आईबीए1 की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर और TMEM119 के साथ सहस्थानन के बिना मस्तिष्क में मैक्रोफेज घुसपैठ के दृश्य की अनुमति देता है। इस प्रकार यह दृष्टिकोण माइक्रोग्लिया और मैक्रोफेज में घुसपैठ के बीच भेदभाव की अनुमति देता है, जो स्वास्थ्य और रोग के विभिन्न संदर्भों में मस्तिष्क homeostasis में अपनी अलग भागीदारी में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल neuroimmunoology में नवीनतम निष्कर्षों को एकीकृत करता है कि चयनात्मक मार्करों की पहचान से संबंधित है. यह भी दोनों अनुभवी neuroimmunoologists और परियोजनाओं में neuroimmunoology एकीकृत करने की मांग शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है.

Introduction

तीव्र या पुरानी, neuroinflammation माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क के निवासी मैक्रोफेज से कसकर प्रभावित है या नहीं। इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से माइक्रोग्लिया को दृश्यित करना प्रकाश माइक्रोस्कोपी, एक अत्यधिक सुलभ तकनीक के उपयोग के साथ न्यूरोसूजन के अध्ययन के लिए मूल्यवान है। homeostatic स्थितियों में, microglia आम तौर पर एक nonoverlapping, मोज़ेक की तरह पैटर्न में वितरित कर रहे हैं. वे छोटे सोमास प्रदर्शित करते हैं जो रामीकृतप्रक्रियाओं 1का विस्तार करते हैं , जो कभी - कभी एक दूसरे सेसंपर्क करते हैं 2. माइक्रोग्लियल रैम्ड प्रक्रियाओं गतिशील रूप से मस्तिष्क पैरेन्काइमा सर्वेक्षण, न्यूरॉन्स के साथ बातचीत, अन्य glial कोशिकाओं, और सामान्य शारीरिक स्थितियों के दौरान रक्त वाहिकाओं3. Microglia रिसेप्टर्स की एक शस्त्रागार है कि उन्हें प्रतिरक्षा कार्य करने के लिए और मस्तिष्क वातावरण में परिवर्तन का जवाब करने के लिए अनुमति देने के साथ सुसज्जित हैं, सेल मौत के लिए, या ऊतक क्षति के लिए. इसके अलावा, वे प्रमुख शारीरिक कार्यों, विशेष रूप से synaptic गठन, रखरखाव, और उन्मूलन4,5में लागू होते हैं.

माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपलब्ध मार्करों में, आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडेप्टर अणु 1 (आईबीए1) सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले में से एक है। आईबीए1 एक कैल्शियम बाइंडिंग प्रोटीन है जो सूक्ष्मजीवी आकृति विज्ञान का असाधारण दृश्य प्रदान करता है, जिसमें सूक्ष्म विक्षिप्त प्रक्रियाएं शामिल हैं, जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी6द्वारा पुष्टि की गई है। यह उपकरण सूक्ष्म जीव परिवर्तन की विशेषता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, पूर्व में कहा जाता है "सक्रियण", पशु रोग मॉडल7,8,9की एक विशाल सरणी में. neuroinflammation की उपस्थिति में, microglial प्रतिक्रिया में शामिल हैं: microgliosis कि सेलुलर घनत्व में वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया है, वितरण में परिवर्तन है कि कभी कभी क्लस्टरिंग में परिणाम, सेल शरीर की वृद्धि, साथ ही मोटाई और अधिक अमीबॉइड आकार के साथ संबद्ध प्रक्रियाओं का छोटा करना10,11,12,13.

इम्यूनोस्टेनिंग विशिष्ट मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी की उपलब्धता द्वारा सीमित है। महत्वपूर्ण बात यह है कि आईबीए1 माइक्रोग्लिया द्वारा व्यक्त किया जाता है लेकिन यह भी परिधीय मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त किया जाता है जो मस्तिष्क में घुसपैठकरते हैं 14. जबकि मस्तिष्क के अंदर आईबीए1-सकारात्मक कोशिकाओं का अवलोकन इस अनुसंधान क्षेत्र में माइक्रोग्लिया का एक मार्कर बन गया है, परिधीय मैक्रोफेज घुसपैठ विभिन्न परिस्थितियों में सूचित किया गया है, यहां तक कि स्वस्थ मस्तिष्क में मामूली15,16 ,17,18. नतीजतन, अकेले आईबीए1 का उपयोग माइक्रोग्लिया के चयनात्मक दृश्य की अनुमति नहीं देता है। इसके अतिरिक्त, मैक्रोफेज एक बार मस्तिष्क में घुसपैठ करने के बाद निवासी माइक्रोग्लिया की आणविक और आकृतिक विशेषताओं को अपनाते हैं, इस प्रकार भेदभावमेंबाधा डालते हैं। यह एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है जब दोनों microglia और मैक्रोफेज घुसपैठ के समारोह की जांच.

जबकि माइक्रोग्लिया और परिधीय मैक्रोफेज का मूल अलग होता है (उदाहरण के लिए, भ्रूणीय जर्दी थैली और अस्थि मज्जा से, क्रमशः20,21), निष्कर्षों की संख्या बढ़ती हुई है जो यह दर्शाता है कि दो कोशिका जनसंख्या एंगल करती है मस्तिष्क में विभिन्न भूमिकाओं19| इस प्रकार यह तरीकों कि इनवेसिव जोड़तोड़ के बिना इन दो आबादी के बीच भेदभाव का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, अस्थि मज्जा chimeras या parabiosis) कि उनके घनत्व, वितरण, आकृति विज्ञान, और समारोह में बदल सकते हैं. TMEM119 स्वास्थ्य और रोग की स्थिति22भर में एक microglia-विशिष्ट मार्कर के रूप में उभरा है. जब IBA1 के साथ संयुक्त, इस मार्कर मैक्रोफेज, जो TMEM119-नकारात्मक और IBA1-सकारात्मक हैं घुसपैठ से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोगी हो जाता है. हालांकि यह विकास विनियमित है, TMEM119 प्रसव के बाद के दिनों के रूप में जल्दी के रूप में व्यक्त किया है 3 (P3) और 6 (P6), तेजी से P10 और P1422के बीच वयस्क स्तर तक पहुँचने तक बढ़ रही है. आईबीए1 को भ्रूणीय दिन 10.5 (ई10.5)23के रूप में व्यक्त किया जाता है। इस प्रकार प्रस्तावित दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर जीवन में इन दो आबादियों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।

यह प्रोटोकॉल एक कदम दर कदम इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया प्रदान करता है जो माइक्रोग्लिया और परिधीय मैक्रोफेज के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। इसमें यह भी बताया गया है कि सूक्ष्म-लघु घनत्व, वितरण और आकारिकी का मात्रात्मक विश्लेषण कैसे किया जाए, साथ ही परिधीय मैक्रोफेज घुसपैठ का विश्लेषण कैसे किया जाए। जबकि microglia और परिधीय मैक्रोफेज की जांच अपने आप उपयोगी है, इस प्रोटोकॉल आगे neuroinflammatory foyers के स्थानीयकरण की अनुमति देता है; इस प्रकार, यह भी विशिष्ट क्षेत्रों की पहचान करने के लिए पूरक (अभी तक, अधिक समय और संसाधन लेने वाली) तकनीकों के उपयोग के साथ, विशिष्ट क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है.

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं संस्थागत पशु आचार समितियों के दिशा निर्देशों के साथ समझौते में प्रदर्शन किया गया, पशु देखभाल पर कनाडा परिषद और Universit के पशु देखभाल समिति के अनुरूप Laval.

1. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. एक मस्तिष्क एटलस की मदद से ब्याज (आरओआई) (यानी, हिप्पोकैम्पस) के क्षेत्र युक्त तीन माउस मस्तिष्क वर्गों का चयन करें। एक प्लास्टिक बहु अच्छी तरह से थाली में वर्गों प्लेस और उन्हें फॉस्फेट-बफर नमकीन के 350 $L के साथ कवर (पीबीएस) (तालिका 1) .
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, दिमाग 4% paraformaldehyde के साथ perfused किया जाना चाहिए और एक vibratome के साथ 50 डिग्री की मोटाई में कटौती. एक 24 बहु अच्छी तरह से थाली के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से छह वर्गों को पकड़ कर सकते हैं. प्रत्येक कुएं के लिए समाधान की सिफारिश की मात्रा 350 डिग्री सेल्सियस (तीन वर्गों तक के लिए) और छह वर्गों वाले कुओं के लिए 500 डिग्री सेल्सियस है। वर्गों की एक उच्च संख्या के लिए, यह एक 12 बहु अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से पूरी तरह से ऊतक को शामिल किया गया है और वर्गों को तैरने की अनुमति देता है के लिए समाधान की चयनित मात्रा. अनुशंसित वॉल्यूम प्रोटोकॉल के शेष में उपयोग किए गए प्रत्येक समाधान के लिए लागू होते हैं।
  2. पीबीएस के 350 डिग्री एल के साथ उन्हें कवर करके नमूनों को धो लें और कमरे के तापमान (आरटी) पर एक बहु-उप-उद्देश्य शेकर के शीर्ष पर बहु-वेल प्लेट रखकर उन्हें आराम दें। 5 मिनट के बाद पीबीएस निकालें और ताजा पीबीएस के साथ 5x बदलें।
    नोट: समाधान को निकालने के लिए, एक स्थानांतरण पिपेट की सिफारिश की है। किसी भी समाधान में डालने के दौरान, ऊतक अखंडता की रक्षा के लिए अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ पिपेट की नोक को रखना सुनिश्चित करें। इसके अलावा प्रत्येक नए समाधान के लिए एक नया पिपेट का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. पीबीएस निकालें और पीएच के साथ 10 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर के 350 डिग्री एल जोड़ें - 6.0(तालिका 1)।
  4. पैराफिन फिल्म के साथ बहु-वेल प्लेट को सील करें और इसे 70 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए पहले से गरम पानी के स्नान पर तैरने दें।
  5. मल्टी-वेल प्लेट को लगभग 15 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
  6. सोडियम साइट्रेट बफर निकालें और चरण 1.2 में किया के रूप में PBS में वर्गों धो लें.
  7. पीबीएस निकालें और ताजा बनाया 0.1% NaBH4 के 350 $L जोड़ें (तालिका 1) और आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करते हैं।
  8. 0.1% NaBH4 के समाधान निकालें और चरण 1.2 में किया के रूप में PBS में वर्गों धो लें.
  9. PBS निकालें और एक बहुउद्देशीय शेकर के शीर्ष पर आरटी पर 1 एच के लिए ब्लॉकिंग बफ़र (तालिका 1) जोड़ें।
    नोट: एक ही समाधान अगले चरण में उपयोग किया जाएगा के रूप में, बफ़र अवरुद्ध की डबल मात्रा तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें।
  10. अवरुद्ध बफर निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी (1:150 माउस IBA1 + 1:300 TMEM119) के मिश्रण युक्त बफर अवरुद्ध द्वारा बदलें. पैराफिन फिल्म के साथ प्लेट को सील करें और इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  11. अगले दिन, लगभग 15 मिनट के लिए आरटी में गर्म नमूने.
  12. पंजाब में 5 मिनट के लिए वर्गों 5x को ट्राइटन (PBST) (तालिका 1) के साथ धोएं।
  13. PBST निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण युक्त अवरुद्ध बफर जोड़ें (1:300 गधा विरोधी माउस Alexa 488 IBA1 के लिए; 1:300 बकरी विरोधी Rabbit Alexa 568 TMEM119 के लिए) के लिए 1.5 एच RT. पर इस बिंदु से शुरू पर प्रकाश से नमूने की रक्षा.
  14. ब्लॉकिंग बफर निकालें और चरण 1.2 में किया के रूप में वर्गों 5x धोने, PBST के साथ इस बार को छोड़कर.
  15. PBST निकालें और 4$,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) [1:20000] RT में 5 मिनट के लिए जोड़ें।
  16. DAPI निकालें और 5 मिनट फॉस्फेट बफ़र (PB) में प्रत्येक के लिए वर्गों 3x धो लें।
  17. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट. उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रहते हुए सूखने दें।
  18. जब सूख, बढ़ते फ्लोरोसेंट मध्यम की कुछ बूँदें जोड़ने और एक coverslip के साथ कवर, बुलबुला गठन से बचने.
    नोट: प्रकाश से सुरक्षित रहते हुए स्लाइड को हिस्टोलॉजिकल स्लाइड बॉक्स के अंदर, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नमूनों को कई महीनों के लिए संरक्षित किया जा सकता है।

2. घनत्व और वितरण विश्लेषण के लिए इमेजिंग

  1. एक widefield epifluorscence माइक्रोस्कोप की मदद से, एक कम आवर्धन और DAPI चैनल का उपयोग करने के लिए ROI (यानी, हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र) का पता लगाने के लिए.
  2. 20x पर छवियों का अधिग्रहण, 0.5 के एक संख्यात्मक एपर्चर (NA) का उपयोग कर, DAPI, 488, और 568 चैनलों और फिल्टर के साथ, 0.3 $m/पिक्सेल के एक संकल्प पर. ROI को कवर करने वाली मोज़ेक चित्र कैप्चर करें. वैकल्पिक रूप से, एक बड़ी छवि में सिले किया जाएगा कि अलग-अलग चित्र ले।
    नोट: एक मोज़ेक छवि एक सुपर छवि छोटे छवियों द्वारा गठित है. मोज़ेक छवियों आमतौर पर उच्च आवर्धन के क्षेत्र के दृश्य के सीमित क्षेत्र पर काबू पाने के लिए उपयोग किया जाता है। कुछ सॉफ्टवेयर एक मोज़ेक समारोह में शामिल हैं; फिर भी, छवियों को भी मैन्युअल रूप से एक में अलग-अलग छवियों सिलाई द्वारा अन्य फोटो संपादन सॉफ्टवेयर के साथ एक साथ सिले जा सकते हैं। फ़ाइल में स्केल जानकारी जोड़ना याद रखें. इस प्रकार के विश्लेषण के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि कम से कम 300 माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को ROI/animal प्रति छवि (उदाहरण के लिए हिप्पोकैम्पस के लिए लगभग 10$15 चित्रों के अनुरूप), प्रयोगात्मक स्थिति के अनुसार कम से कम पांच जानवरों के साथ। चित्र 1ए$सी कोलेबल माइक्रोग्लिया के प्रतिबिंबों को दर्शाता है।
  3. छवि को TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें।

3. आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए इमेजिंग

  1. कॉन्फोकल या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, कम आवर्धन पर ROI का पता लगाने के लिए DAPI चैनल का उपयोग करें.
  2. एक 40x उद्देश्य का उपयोग करना (यानी, एनए 1.4 तेल), ROI के अंदर एक IBA1 + / TMEM119 सेल का पता लगाएं. लाइव इमेजिंग करते समय, $-अक्ष में ले जाएँ. जैसे ही बेतरतीब ढंग से चयनित माइक्रोग्लिया का सिग्नल गायब हो जाता है, इस $ स्तर को जेड-स्टैक की शुरुआत के रूप में सेट करें। जब तक माइक्रोग्लिया का सिग्नल गायब नहीं हो जाता, तब तक जेड-अक्ष के साथ आगे बढ़ें और उस बिंदु को $-स्टैक के अंत के रूप में सेट करें।
    नोट: चित्र 2ए$सी आईबीए1+/TMEM119+ माइक्रोग्लिया की छवियों को दिखाता है।
  3. 0.33 m $-इंटरवल और 0.15 m/पिक्सेल के पिक्सेल आकार का उपयोग करके सभी तीन चैनलों (DAPI, 488, 568) में $-स्टैक बनाएँ. फ़ाइल में स्केल जानकारी जोड़ें।
    नोट: अनुशंसित $-इंटरवल उद्देश्य की समाधान शक्ति पर निर्भर करता है (उदाहरण के लिए, एनए 1ण्4 तेल जैसे 40x उद्देश्य के लिए, यह 0ण्33 $उ है)। आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए, यह प्रयोगात्मक हालत प्रति पांच जानवरों की एक न्यूनतम के साथ प्रति पशु कम से कम 20 कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है।
  4. फ़ाइल को TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें.

4. घनत्व और वितरण विश्लेषण

  1. निकटतम पड़ोसी दूरी (NND) प्लगइन स्थापित के साथ खोलें FIJI/ImageJ. 20x छवि खोलें.
    नोट: स्थापना निर्देशों को खोजने के लिए कीवर्ड "सबसे पास पड़ोसी दूरी गणना ImageJ के साथ" के साथ एक खोज इंजन का उपयोग करें। प्लगइन लेखक Yuxiong माओ है.
  2. छवि पर अंकित स्केल के आधार पर मैन्युअल रूप से स्केल सेट करने के लिए, सीधे पंक्ति उपकरण का चयन करें (चित्र 3E),कर्सर को स्केल के किनारे पर रखें, और, शिफ्ट कुंजी दबाते समय, छवि पर स्केल के लिए जितना संभव हो उतना एक रेखा आरेखित करें (चित्र 3I/c1 [), विश्लेषण का चयन करें | स्केल सेट करें,फिर सही जानकारी दर्ज करें (चित्र 3J) .
    नोट: पैमाने कभी कभी फ़ाइल के मेटाडेटा में शामिल किया जा सकता है और स्वचालित रूप से सेट.
  3. छवि का चयन करें ] रंग ] सभी चैनलों की एक समग्र छवि बनाने के लिए समग्र बनाओ.
    नोट: छवि प्राप्ति के दौरान, FIJI/ImageJ स्वचालित रूप से RGB स्वरूप में एक समग्र पैदा करेगा।
  4. मेनू पट्टी पर, विश्लेषण का चयन करें | सेट माप| क्षेत्र, Centroid, और परिधिकी जाँच करें . टैब पर रीडायरेक्ट करेंपर क्लिक करें और खोली गई फ़ाइल का चयन करें (चित्र 3K).
  5. छवि पर जाएँ | रंग ] चैनल उपकरण चैनल उपकरण खोलने के लिए.
    नोट: यह मेनू एक विशिष्ट रंग अक्षम किया जा करने की अनुमति देगा. DAPI चैनल ROI की पहचान करने के लिए और कक्षों की पुष्टि करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं। यह गिनती आसान बनाने के लिए निष्क्रिय किया जा सकता है.
  6. मुक्तहस्त चयन उपकरण के साथ ROI की किसी न किसी परिधि को ड्रा करें (चित्र 3D)।
  7. उपकरण पट्टी पर अंडाकार उपकरण को डबल-क्लिक करके चयन ब्रश उपकरण सक्षम करें और सुनिश्चित करें कि चयन ब्रश सक्षम करें बॉक्स चेक किया गया है ( चित्र3G). इस उपकरण का उपयोग ROI को अधिक सटीक रूप से रेखांकित करने के लिए किया जाएगा. 200-400 के बीच एक उपयुक्त ब्रश आकार का चयन करें।
  8. चयन ब्रश का उपयोग करके, सबसे अच्छा ROI फिट करने के लिए परिधि समायोजित करें। ROI प्रबंधक में जोड़ने के लिए कुंजीपटल पर T दबाएँ (चित्र 3L).
  9. विश्लेषण का चयन करें ] उपाय या एम कुंजी दबाएँ, और एक परिणाम विंडो पॉप अप होगा. डेटा पत्रक पर परिणामों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ, फिर क्षेत्र के बारे में जानकारी सहेजें (यानी, ROI का क्षेत्र; चित्र 3R) .
  10. ROI के क्षेत्र की प्रतिलिपि बनाने के बाद, उस पर क्लिक करके और बैकस्पेस कुंजी दबाकर परिणाम विंडो से जानकारी मिटाएँ.
  11. ROI प्रबंधक विंडो पर जाएँ (चित्र 3L), ROI ट्रेस पर राइट-क्लिक करें, छवि के नाम से मेल खाने के लिए नाम बदलें, फिर सहेजें.
  12. उपकरण पट्टी पर ब्रश उपकरण को डबल-क्लिक करें। काले रंग और 10 के एक ब्रश आकार का चयन करें. सुनिश्चित करें कि ओवरले का विकल्प पेंट अनियंत्रित है (चित्र 3H) .
  13. TMEM119 चैनल में, ध्यान से प्रत्येक TMEM119 + microglia के लिए केंद्र सोमा पर एक काला डॉट जगह है. उन कक्षों के केंद्र पर एक सफेद बिंदु रखें जो TMEM119 के लिए धनात्मक नहीं हैं (मैक्रोफेज ों में प्रवेश करने के लिए). ROI में शामिल सभी कक्षों के लिए समान प्रक्रिया दोहराएँ.
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सभी डॉट्स (काले और सफेद) एक ही चैनल में स्थित हैं. छवि विंडो लेबल के रंग को देखकर चैनल की पहचान सत्यापित (लाल, नीला या हरा) की जा सकती है.
  14. छवि का चयन करें ] रंग ] स्प्लिट चैनल| प्रत्येक चैनल के लिए एक विंडो दिखाई देगी. उसके बाद, डॉट एनोटेशन है जो चैनल की पहचान करें और अन्य दो windows बंद करें।
  15. नया विभाजित चैनल चित्र पुनर्निर्देशित करें. विश्लेषण करने के लिए जाओ ] सेट माप| टैब पर रीडायरेक्ट करें, क्लिक करें और विभाजित चैनल छवि का चयन करें (चित्र 3K).
  16. छवि का चयन करें ] टाइप करें ] 8-बिट| छवि पर जाएँ | थ्रेशहोल्ड समायोजित करें और चयन करें (चित्र 3O). थ्रेशोल्ड समायोजित करने के लिए, दूसरी पट्टी के बटन को स्लाइड करें, दोनों पट्टियों में बाईं ओर सभी तरह (थ्रेसहोल्ड मान ]0).।
    नोट: यह छवि पर केवल काले डॉट्स छोड़ देंगे, सफेद दिखाई दे.
  17. ROI प्रबंधक विंडो में ROI चुनें. विश्लेषण का चयन करें ] कण का विश्लेषण करें (चित्र 3छ) आकार पर (इंच $2): 1 $20 लिखें. पिक्सेल इकाई को अनचेक रखें, प्रदर्शन जाँचें, प्रबंधक में सारांशितकरें और जोड़ें, और Okदबाएँ. सारांश विंडो पॉप अप होगी और अंकों की संख्या देगी (चित्र 3च ). डेटा पत्रक में जानकारी की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ.
  18. Plugins का चयन करें | एनएनडी| NND विंडो पॉप अप होगा (चित्र 3Q) सभी जानकारी को डेटा पत्रक में कॉपी/पेस्ट करें. प्रत्येक संख्या दूरी प्रत्येक microglia निकटतम पड़ोसी microglia करने के लिए है प्रतिनिधित्व करता है.
  19. थ्रेशोल्ड विंडो पर वापस जाएँ और पहली बार को दाईं ओर स्लाइड करें (थ्रेसहोल्ड मान दोनों पट्टियों में 255) है, जो सभी सफेद बिंदुओं को दृश्यमान छोड़ देगा, सफेद दिखाई देगा (चित्र 3M).।
  20. विश्लेषण का चयन करें ] कण का विश्लेषण करें| अंकों की संख्या प्रदान करने वाली सारांश विंडो पॉप अप होगी (चित्र 3P) . डेटा पत्रक में जानकारी की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ.
  21. ROI प्रबंधक पर जाएँ सभी बिंदुओं का चयन करें, राइट-क्लिक करें, और छवि के नाम के साथ सहेजें। यह एक ज़िप फ़ाइल में सभी बिंदुओं की बचत की अनुमति देगा (चित्र 3L). फ़ाइल का चयन करें ] के रूप में सहेजें, और विश्लेषण की छवि की पहचान की अनुमति देता है कि एक नाम के साथ फ़ाइल को बचाने के.
  22. II के क्षेत्रफल द्वारा आईबीए1+/TMEM119+ द्वि-धनात्मक कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके माइक्रोग्लिया (प्रत्येक प्रतिबिंब के लिए) का घनत्व प्राप्त कीजिए।
    नोट: प्रत्येक चित्र के लिए मान प्रत्येक जानवर के लिए औसत किया जा सकता है. डेटा तो मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - सभी जानवरों के मतलब (SEM) के मानक त्रुटि.
  23. NND सभी TMEM119 + कक्षों के NND मान का प्रति चित्र औसत प्राप्त करके निर्धारित करें।
    नोट: डेटा तो मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - सभी जानवरों के SEM.
  24. सूत्र का उपयोग करके रिक्ति अनुक्रमणिका की गणना करें: NND2 x घनत्व.
    नोट: डेटा तो मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - सभी जानवरों के SEM. इस माप के लिए इकाइयों मनमाने ढंग से इकाइयों होगा.
  25. 12 डिग्री मीटर के नीचे एक NND है कि कोशिकाओं की पहचान करके microglial समूहों की मात्रा.
    नोट: यहाँ, 12 डिग्री मीटर का चयन किया जाता है, क्योंकि यह दो सीधे-सीधे एक दूसरे को arborizations के साथ छू microglial कोशिकाओं के बीच अनुमानित दूरी है. यदि तीन से अधिक microglia जो इस शर्त को पूरा कर रहे हैं, छवि पर लौटें और सत्यापित करें कि क्या ये कक्ष एक या एकाधिक समूहों का हिस्सा हैं।
  26. क्लस्टर्स की संख्या की पुष्टि करने के बाद, डेटा पत्रक में क्लस्टर्स की संख्या लिखें।
    नोट: प्रत्येक जानवर के लिए कोशिकाओं/मिमी2 का घनत्व प्राप्त करने के लिए समूहों की संख्या को ROI क्षेत्र से विभाजित किया जा सकता है। डेटा तो मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - सभी जानवरों के SEM.
  27. परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक जानवर के लिए आईबीए1 +/TMEM119- कोशिकाओं की कुल संख्या पर % की गणना करें (TMEM119+/IBA1+ + TMEM119-/IBA1+)।
    नोट: डेटा तो मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - सभी जानवरों के SEM.

5. Morphology विश्लेषण

  1. OPEN FIJI/ImageJ.
  2. छवि J या FIJI का उपयोग कर40x छवि खोलें। चुनें एक पॉपअप विंडो पूछ अगर छवियों को एक ढेर में खोला जाना चाहिए दिखाई देगा. ठीकक्लिक करें. अगला, छवि का चयन करें | ढेर ] $ परियोजना खिड़की खोलने के लिए $ परियोजना। सभी स्लाइस शामिल करें, पहले से अंतिम स्लाइस के माध्यम से. सुनिश्चित करें कि अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन प्रकारके अंतर्गत चयनित है, और ठीक क्लिक करें
  3. $ परियोजना के साथ नई विंडो पर क्लिक करें. छवि का चयन करें ] रंग ] विभाजित चैनल | आईबीए1 चैनल की छवियों पर निशान आचरण.
    नोट: अन्य चैनलों (TMEM119 और DAPI) खुला रखा जा सकता है और microglial आकारिकी विश्लेषण के दौरान की जरूरत के रूप में परामर्श किया.
  4. मेनू पट्टी पर, विश्लेषण का चयन करें | सेट माप| क्षेत्र, Centroid, और परिधिकी जाँच करें . टैब पर रीडायरेक्ट करें, खोली गई फ़ाइल का चयन करें (चित्र 3K).
  5. चरण 4.2 में वर्णित के रूप में स्केल सेट करें।
  6. IBA1 चैनल में सोमा आकार को मापने के लिए, मुक्तहस्त चयन उपकरण के साथ सोमा की किसी न किसी परिधि आकर्षित (चित्र 3 डी).
  7. उपकरण पट्टी पर अंडाकार उपकरण को डबल-क्लिक करके चयन ब्रश उपकरण सक्षम करें, उसके बाद चयन ब्रश बॉक्स सक्षम करें (चित्र 3G) की जाँच करके. 10$20(चित्र 3ख) के बीच चयन ब्रश आकार का चयन करें।
  8. चयन ब्रश का उपयोग करना, सबसे अच्छा सोमा फिट करने के लिए ट्रेस समायोजित करें। इस चरण के दौरान ज़ूम इन करना परिशुद्धता को सक्षम करेगा (चित्र 2I)
  9. ROI प्रबंधक में सोमा ट्रेस जोड़ने के लिए T कुंजी दबाएँ (चित्र 3L).
  10. विश्लेषण का चयन करें ] M कुंजी को मापें या दबाएँ. एक परिणाम विंडो पॉप अप होगा. किसी डेटा पत्रक पर परिणामों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ (चित्र 3R).
  11. सोमा क्षेत्र के बारे में जानकारी सहेजने के लिए, ROI प्रबंधक विंडो पर जाएँ, ROI पर राइट-क्लिक करें, छवि के नाम से मिलान करने के लिए नाम बदलें, निर्दिष्ट करें कि ट्रेस सोमा के लिए है, फिर फ़ाइल सहेजें.
  12. आईबीए1 चैनल में आर्बोाइजेशन क्षेत्र को मापने के लिए, बहुभुज चयन उपकरण के साथ एक माइक्रोग्लियल प्रक्रिया चरम पर क्लिक करें, जो बहुभुज आकृति (चित्र 3C) शुरू करेगा।
  13. माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं के सुझावों के बाद, प्रत्येक प्रक्रिया चरम सीमा के सुझावों पर क्लिक करके माइक्रोग्लिया के चारों ओर जाएं ताकि एक बहुभुज बना या जा सके जो सूक्ष्मग्लियल आर्बोकेशन द्वारा कवर किए गए क्षेत्र का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है (चित्र 2D]H)।
    नोट: बहुभुज सभी microglial प्रक्रिया extremities जोड़ता है कि सुनिश्चित करें. बहुभुज बनाने वाली रेखाएं कभी भी प्रतिच्छेद नहीं करना चाहिए। जब एक microglial प्रक्रिया टिप के आसपास क्लिक करते हैं, इस प्रक्रिया के किसी भी हिस्से को काटने से बचने के लिए सावधान रहना होगा. यह कभी कभी एक प्रक्रिया के आसपास जाने के लिए अतिरिक्त अंक जोड़ने के लिए उपयोगी है. बहुभुज बनाने वाले बिंदुओं की संख्या सीधे दूरस्थ प्रक्रियाओं की संख्या से जुड़ी नहीं है और इस प्रकार अध्ययन के लिए प्रासंगिक नहीं है।
  14. बहुभुज को बंद करने के लिए, बहुभुज के प्रारंभिक बिंदु पर क्लिक करें.
  15. ROI प्रबंधक (चित्र 3L)में ट्रेस जोड़ने के लिए T कुंजी दबाएँ. विश्लेषण का चयन करें ] M कुंजी को मापें या दबाएँ. एक परिणाम विंडो पॉप अप होगा. किसी डेटा पत्रक पर परिणामों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ (चित्र 3R).
  16. arborization क्षेत्र के बारे में जानकारी सहेजने के लिए, ROI प्रबंधक विंडो पर जाएँ, ROI राइट-क्लिक करें, छवि के नाम से मेल खाने के लिए नाम परिवर्तित करें, arborization के लिए निर्दिष्ट करें, तो फ़ाइल सहेजें।
  17. प्रत्येक जानवर के लिए सभी सोमा क्षेत्रों औसत द्वारा सोमा क्षेत्र का निर्धारण.
    नोट: डेटा सभी जानवरों के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - SEM.
  18. प्रत्येक जानवर के लिए सभी वृक्ष-क्षेत्र क्षेत्रों का औसत करके वृक्ष-क्षेत्र का निर्धारण करें।
    नोट: डेटा सभी जानवरों के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - SEM.
  19. प्रत्येक माइक्रोग्लियल सेल के लिए सूत्र सोमा क्षेत्र/वृक्षीकरण क्षेत्र और प्रति जानवर औसत का उपयोग करके आकारिकी सूचकांक की गणना कीजिए।
    नोट: डेटा सभी जानवरों के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है - SEM.

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Representative Results

चित्र ाााा1 में २०x में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्शाए गए पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के कोरोनल खंड में आईबीए1 और टीएमईएम१19 का उपयोग करके माइक्रोग्लिया की सह-लेबलिंग को दिखाया गया है। एक सफल अभिरंजन सूक्ष्म-ग्लियल कोशिका निकायों और उनकी सूक्ष्म प्रक्रियाओं का पता चलता है (चित्र 1ए $सी)। इस अभिरंजन से सूक्ष्म-ग्लियल घनत्व और वितरण और सूक्ष्म समूहों की पहचान (चित्र 1I) और गुरु-कथाओं में घुसपैठ ( चित्र 1 च ) का निर्धारण किया जासकताहै।

चित्र 2 आईबीए1+/TMEM119+ माइक्रोग्लिया (चित्र 2A$C) माइक्रोग्लियल वृक्षीकरण अनुरेखण प्रक्रिया के चरणबद्ध उदाहरण में दिखाता है (चित्र 2D$H), साथ ही कोशिका शरीर अनुरेखण का एक उदाहरण (चित्र 2I ), दोनों confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 40x पर छवि.

Figure 1
चित्र 1: आईबीए1 और TMEM119 घनत्व, वितरण, क्लस्टरिंग, और परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ विश्लेषण के लिए माउस मस्तिष्क ऊतक के डबल धुंधला। (ए$सी) एक C57BL/6 वयस्क माउस के हिप्पोकैम्पस में विशिष्ट microglial वितरण. (डी ]एफ) माइक्रोग्लिया की पहचान आईबीए1+/TMEM119+ के रूप में की गई है और पुरुष माउस के एमीगडाला में आईबीए1+/TMEM119 (सफेद तीर) के रूप में पहचान की गई मैक्रोफेज को घुसपैठ करना। (जी $I) माउस के हिप्पोकैम्पस में दो माइक्रोग्लिया (सफेद वर्ग) का समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: आईबीए1 और TMEM119 microglial आकारिकी विश्लेषण के लिए धुंधला. (ए$सी) माइक्रोग्लिया। (डी $ I) FIJI/ImageJ में बहुभुज उपकरण का उपयोग करआईबी1 चैनल के साथ arborization अनुरेखण के चरण दर चरण उदाहरण. (ज)FIJI/ImageJ में मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग करके आईबीए1 चैनल के साथ माइक्रोग्लिया सोमा अनुरेखण का उदाहरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: FIJI/ImageJ इंटरफ़ेस और microglial घनत्व, वितरण, क्लस्टरिंग, आकृति विज्ञान, और परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ विश्लेषण के लिए उपकरण. (ए$आर) सभी उपकरणों का संकलन, मेनू, और खिड़कियों घनत्व के लिए इस्तेमाल किया, क्लस्टर, और आकृति विज्ञान विश्लेषण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान तैयारी
बफ़र ब्लॉक करना 0.5% जिलेटिन + 5% प्राकृतिक बकरी सीरम + 5% प्राकृतिक गधा सीरम + 0.01% Triton X-100 टीबीएस में [0.05 एम]
साइट्रेट बफर 1.92 ह साइट्रिक एसिड [10 एम], 500 [एल के ट्वीन 20 [0.05% (v/v)], 700 एमएल अल्ट्राप्यूर पानी, समायोजित पीएच ख् 6.0 के साथ NaOH [10 N], अल्ट्राप्यूर पानी के साथ 1 एल तक भरें
नबीएच4 [0.01% w/ अल्ट्राप्यूर पानी के 10 एमएल में 0.01 ग्राम NaBH4 को दूर करें, घोल को अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए। यह समाधान बुलबुला बनाता है; मिश्रण के बाद टोपी खोलने से दबाव जारी
पंजाब [100 मीटर] ना 2एचपीओ4 और 4.8 ग्राम नाह2पीओ4के 23.48 ग्राम H2O में 1 L अल्ट्रापुरे पानी, तो 2 ल तक भरें, पीएच को समायोजित करें - 7.4
Pbs [50 मीटर] न2एचपीओ4, 1.2 ह के नह2पो4के 5.87 ह ह2ह, 9 ह नकक 500 एमएल अल्ट्रापुरे पानी में, 1 ल तक अल्ट्रापुरे पानी के साथ भरें, पीएच को समायोजित करें 7.4
पीबीएसटी पीबीएस + 0.01% ट्राइटन एक्स-100
टीबीएस अल्ट्राप्यूर पानी के साथ डिल्यूट ट्राइस एचसीएल [0.5 एम], ट्रास एचसीएल [0.05 एम] का 1 L लें और 8.75 ग्राम NaCl जोड़ें
ट्राइस एचसीएल [0.5 M] 950 एमएल अल्ट्राप्यूर पानी, Tris बफर हाइड्रोक्लोराइड के 78.8 ग्राम जोड़ें (सी4एच11नहीं3सीएल) पीएच को समायोजित करने के लिए 8 और 1 एल को भरने

तालिका 1: समाधान इम्यूनोस्टेनिंग के लिए उपयोग किया जाता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल दो महत्वपूर्ण भागों में विभाजित किया जा सकता है: धुंधला और विश्लेषण की गुणवत्ता. यदि धुंधला इष्टतम नहीं है, यह पर्याप्त रूप से microglial कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने में विफल हो जाएगा, इस प्रकार घनत्व को प्रभावित, वितरण, और आकृति विज्ञान माप. इसके अलावा, घुसपैठ परिधीय माइलॉयड कोशिकाओं के अनुपात को कम करके आंका जा सकता है। यह धुंधला प्रोटोकॉल का एक अनुकूलित संस्करण है, लेकिन वहाँ कई कारक है कि suboptimal छवियों में परिणाम हो सकता है. हालांकि पशु के भ्रम इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, अगर मस्तिष्क निर्धारण अच्छी तरह से निष्पादित नहीं है, धुंधला की गुणवत्ता समझौता किया जाएगा. इसके अतिरिक्त, रक्त वाहिकाओं के अंदर मैक्रोफेज की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त भ्रम की आवश्यकता है जो अध्ययन में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

इम्यूनोस्टेनिंग के संबंध में, सबसे महत्वपूर्ण विवरणों में बफर्स की गुणवत्ता, ब्लॉकिंग चरण, एंटीबॉडी का उचित भंडारण, और मस्तिष्क नमूना हैंडलिंग शामिल हैं। बफ़र्स और उनके भंडारण की उचित तैयारी धुंधला की गुणवत्ता पर सीधा प्रभाव पड़ता है. जब तक निर्दिष्ट, कुछ बफ़र्स लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन किसी भी बफर कि संदूषण के लक्षण से पता चलता है के उपयोग से बचा जाना चाहिए. बफ़र्स दिन या सप्ताह अग्रिम में तैयार कर रहे हैं, तो उपयोग से पहले हर समाधान के पीएच सत्यापित किया जाना चाहिए।

इसके अतिरिक्त, इम्यूनोस्टेनिंग के बारे में, पृष्ठभूमि धुंधला की उपस्थिति सबसे आम समस्याओं में से एक है। पृष्ठभूमि धुंधला यह microglia का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल बनाता है, विशेष रूप से उनकी आकृति विज्ञान, और इसलिए परिणाम पूर्वाग्रह होगा. पृष्ठभूमि को रोकने के लिए, यह ब्लॉकिंग चरण सही रूप से किया जाता है कि महत्वपूर्ण है। एंटीबॉडी के भंडारण की स्थिति भी उनकी प्रभावकारिता पर सीधा प्रभाव पड़ता है. यह सख्ती से कंपनी द्वारा प्रदान की भंडारण दिशा निर्देशों का पालन करने के साथ ही लगातार thwing-फ्रीजिंग चक्र से बचने के लिए सलाह दी जाती है. अंत में, पूरी प्रक्रिया के दौरान, मस्तिष्क वर्गों की शारीरिक अखंडता पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक हेरफेर (बफर परिवर्तन, washes, और बढ़ते) के दौरान सावधानी का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, खासकर अगर प्रयोगकर्ता इस प्रक्रिया के साथ अनुभव नहीं है. यह समाधान या बफ़र्स बदलते समय किसी भी तरल समाधान के बिना नमूने छोड़ने से बचने के लिए सलाह दी जाती है, बाद के चरण के लिए समाधान पहले से अच्छी तरह से में डाल करने के लिए तैयार होना चाहिए। बहु अच्छी तरह से प्लेट सही ढंग से रात भर के कदम के दौरान पैराफिन फिल्म के साथ सील किया जाना चाहिए वाष्पीकरण है कि सूखे के लिए नमूने का नेतृत्व कर सकते हैं से बचने के लिए.

सूक्ष्म घनत्व, वितरण, और आकृति विज्ञान के मात्रात्मक विश्लेषण गुणात्मक रिपोर्ट पर कई फायदे हैं. पूर्वाग्रह को रोकने के लिए, विश्लेषण करने वाले शोधकर्ता को प्रयोगात्मक स्थिति के लिए अंधा किया जाना चाहिए। इस प्रकार, यह अलग अलग लोगों को विश्लेषण प्रदर्शन और फ़ाइलों का नाम बदलने के लिए सुझाव दिया है (एक कुंजी पत्रक में मूल और नए नाम रखते हुए). नए नामों में प्रयोगात्मक स्थिति का कोई संकेत नहीं होना चाहिए। पूरे विश्लेषण इन अंधा फ़ाइलों पर किया जा सकता है, और मूल छवि पहचान डेटा के संकलन के बाद ही पता चला है और सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले. हालांकि अंधा पहले से ही अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा अभ्यास किया है, यह पहली बार के लिए विश्लेषण के इस प्रकार के प्रदर्शन उन लोगों के लिए बहुमूल्य सलाह बनी हुई है.

मस्तिष्क क्षेत्र के लिए नियंत्रण मस्तिष्क अनुभाग चयन और विश्लेषण के दौरान ROI के अनुरेखण के दौरान किया जाता है. जानवरों में Bregma स्तर की एक ही श्रेणी से वर्गों का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें. एक ही ROI घनत्व, वितरण, और आकारिकी विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. घनत्व और वितरण विश्लेषण के लिए, FIJI/Image J में ROI बनाते समय सटीक होना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक मस्तिष्क एटलस का उपयोग दृढ़ता से दोनों अनुभाग चयन और रॉय अनुरेखण के लिए सिफारिश की है. डीएपीआई का उपयोग तंत्रिका परमाणु स्थलों की पहचान की सुविधा भी प्रदान करता है। विचरण से बचने के लिए, यह microglia कि केवल आंशिक रूप से ROI में स्थित हैं अस्वीकार करने के लिए सिफारिश की है, क्योंकि वे अपने microenvironment के बीच अलग हो सकता है. जब घनत्व विश्लेषण के लिए microglia अंकन, DAPI चैनल एक चयन मापदंड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. केवल माइक्रोग्लिया की गणना करके जिसमें DAPI-सना हुआ नाभिक होता है, सभी माना जाता microglia एक ही तल में हैं, चयन के दौरान व्यक्तिगत पूर्वाग्रह को कम करने.

चूंकि NND, रिक्ति सूचकांक, और क्लस्टर विश्लेषण के लिए माप अलग-अलग कक्षों को चिह्नित करने वाले बिंदुओं के स्थानों पर आधारित होते हैं, और चूंकि दूरी की गणना FIJI/ImageJ द्वारा की जाती है, इसलिए इन बिंदुओं को रखते समय संगत होना महत्वपूर्ण है। सख्ती से कोशिका शरीर है, जो नेत्रहीन निर्धारित किया जाता है के केंद्र में डॉट्स जगह सुनिश्चित करें. साथ ही, डॉट्स का आकार पूरे विश्लेषण में संगत रहना चाहिए। यह microglial आबादी के स्थानिक वितरण के एक बेहतर प्रतिनिधित्व करने के लिए योगदान देगा. क्लस्टर विश्लेषण के लिए, 12 डिग्री मीटर हमारे पिछले विश्लेषण के आधार पर एक दूरी सीमा के रूप में चुना गया था। फिर भी, यदि NND 12 डिग्री से नीचे चार या अधिक भिन्न कक्ष हैं, तो ये सभी कक्ष एकल क्लस्टर का भाग ले सकते हैं या दो कक्षों के दो समूहों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. यह यह आवश्यक छवियों पर लौटने के लिए और समूहों की वास्तविक संख्या की पुष्टि करने के लिए बनाया है।

घनत्व और वितरण के विपरीत, जिसमें ROI एक मस्तिष्क एटलस का उपयोग neuroanatomic सुविधाओं द्वारा निर्धारित किया जाता है, आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए microglial कोशिकाओं का चयन सेल का विश्लेषण करने की क्षमता पर आधारित है. सभी कक्षों का विश्लेषण किया जा सकता है कि चयन पूर्वाग्रह को रोकने के लिए एक और $-स्टैक करने के लिए जाने से पहले एक $-स्टैक में विश्लेषण के लिए चुना जाना चाहिए। कोशिकाओं को छोड़कर कारणों में इम्यूनोस्टेनिंग या ऊतक काटने, प्रसंस्करण (उदाहरण के लिए, फाड़ना), या बढ़ते (उदाहरण के लिए, बुलबुला गठन) के साथ मुद्दे शामिल हैं। आदर्श रूप में, ऐसे मुद्दों के साथ मस्तिष्क वर्गों व्यवस्थित इमेजिंग और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि TMEM119 और IBA1 के लिए धुंधला 100% ओवरलैप नहीं दिखाता है (चित्र 2ए $सी) . क्योंकि TMEM119 प्रक्रिया निरंतरता के दृश्य की अनुमति नहीं है (के रूप में अच्छी तरह से IBA1), यह यह मुश्किल का आकलन करने के लिए जहां एक सेल समाप्त होता है और जहां एक और एक शुरू होता है बनाता है. इस प्रकार, आकारिकी विश्लेषण आईबीए1 चैनल का उपयोग करके किया जाता है। इसके अतिरिक्त, सभी अंश और डॉट्स को सहेजा जाना चाहिए और भविष्य में संशोधन के लिए कल्पना की जानी चाहिए, जिससे परिणामों की पारदर्शिता और पुन: उत्पादनीयता में वृद्धि हो सके.

यह प्रोटोकॉल माइक्रोग्लिया और घुसपैठ मैक्रोफेज के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है। इसके अनुप्रयोगों के उदाहरण विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में microglia में परिवर्तन के माध्यम से neuroinflammation के लक्षण का पता लगाने, एक यौगिक के विरोधी भड़काऊ प्रभाव का अध्ययन, और कारकों है कि microglia के उचित समारोह के साथ हस्तक्षेप का अध्ययन शामिल हैं. यह देखते हुए कि इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क में मैक्रोफेज घुसपैठ का पता लगाने और microglia से इन कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देता है, अतिरिक्त अनुप्रयोगों में शामिल हैं: दृढ़ संकल्प अगर मैक्रोफेज की भर्ती एक विशेष अपमान में या के साथ होता है अन्य तकनीकों (यानी, आनुवंशिक उपकरण) का उपयोग, और पुष्टि और अपमान के दौरान मस्तिष्क में परिधीय मैक्रोफेज की अनुपस्थिति के परिणामों का अध्ययन. ध्यान रखें कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी अपने आप मस्तिष्क पैरेन्काइमा के अंदर घुसपैठ की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त नहीं है। जब आईबीए1++/TMEM119- कोशिकाओं को वेंट्रिकल्स या परिसंवहनी स्थान के पास देखा जाता है, तो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैसी उच्च स्थानिक संकल्प तकनीकों को पैरेन्काइमा के भीतर उनके स्थानीयकरण की पुष्टि करने की आवश्यकता होती है। जबकि घनत्व, वितरण, और आकृति विज्ञान में परिवर्तन microglial और मैक्रोफेज भूमिकाओं के अच्छे संकेतक हैं, इस दृष्टिकोण सबसे शक्तिशाली है जब कार्यात्मक जांच के साथ संयुक्त.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्रयोगों के साथ उसके मार्गदर्शन और सहायता के लिए Nathali Vernoux के लिए आभारी हैं. हम भी Drs. Emmanuel Planel और सेर्गे Rivest उनके फ्लोरोसेंट और confocal माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए क्रमशः धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम आंशिक रूप से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के मैक्सिकन परिषद (CONACYT; F.G.I करने के लिए), Fondation Famille-Choquette और केंद्र th$matik de recherche एन न्यूरोसाइंसेज (CTRN; K.P.), Fonds de Recherche du Qubec - Sant $ (M.B.) से छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और शास्त्री इंडो-कनाडा इंस्टीट्यूट (के.बी.) के साथ-साथ प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा की इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) से एम.ई.टी.एम.ई.टी. को डिस्कवरी ग्रांट स्वास्थ्य और चिकित्सा में न्यूरोम्यून्यून प्लास्टिकिटी का कनाडा रिसर्च चेयर (टियर II) रखती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse Invitrogen/Thermofisher A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit Invitrogen/Thermofisher A11011
Biolite 24 Well multidish Thermo Fisher 930186
Bovine serum albumin EMD Millipore Corporation 2930
Citric acid Sigma-Aldrich C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain Invitrogen/Thermofisher MP 01306
Fine Brush Art store
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Gelatin from coldwater fish skin Sigma-Aldrich G7765
Microscope coverglass Fisher Scientific 1254418
Microslides positively charged VWR 48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1 Millipore MABN92
Na2H2PO4·H2O BioShop Canada Inc. SPM306, SPM400
Na2HPO4 BioShop Canada Inc. SPD307, SPD600
NaBH4 Sigma-Aldrich 480886
NaCl Fisher Scientific S642500
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 017-000-121
Normal goat serum (NGS) Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. 005-000-121
Parafilm-M Parafilm PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 Abcam ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25 Precision Scientific -
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride BioShop Canada Inc. TRS002/TRS004
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML

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References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 152 माउस मस्तिष्क माइक्रोग्लिया माइलॉयड कोशिकाओं न्यूरोइमोरोलॉजी इम्यूनोफ्लोरेसिस आईबीए1 TMEM119 माइक्रोस्कोपी

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

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Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

माइक्रोग्लियल घनत्व, मॉर्फोलॉजी और परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ विश्लेषण माउस मस्तिष्क के लिए आईबीए1 और TMEM119 का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसी
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González Ibanez, F., Picard, K., Bordeleau, M., Sharma, K., Bisht, K., Tremblay, M. È. Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (152), e60510, doi:10.3791/60510 (2019).

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